L’azote est un des éléments les plus importants dans la nature. Sa disponibilité limite la productivité d’un grand nombre d’écosystèmes naturels, et influencera sans doute de manière importante leurs réponses aux changements climatiques globaux. La première source d’azote dans les écosystèmes non anthropisés est la fixation biologique de l’azote. Ce processus repose sur un groupe de métallo-enzymes spécifiques, les nitrogénases, dont le cofacteur métallique contient soit du fer et un atome de molybdène, soit du fer et un atome de vanadium, soit uniquement du fer. A ce jour, seule la nitrogénase au molybdène est prise en considération dans la dynamique de l’azote dans les écosystèmes, et ce malgré de nombreux indices indiquant que la nitrogénase au vanadium pourrait avoir un rôle important. Est-ce que la nitrogénase au vanadium est utilisée dans les écosystèmes naturels et quelles sont les conditions favorisant son utilisation ? Nous avons cherché à répondre à ces questions à l’aide d’un modèle symbiotique tripartite, un lichen, association entre une algue, un champignon et une cyanobactérie fixatrice d’azote. Nous avons tout d’abord développé une méthode d’étude des contenus en métaux des différents symbiontes, puis nous avons étudié la répartition et la régulation du vanadium au sein des différents symbiontes dans différentes conditions environnementales. Nous avons pu démontrer que dans ce modèle, le vanadium possède toutes les caractéristiques d’un micronutriment essentiel à la fixation d’azote. Nous avons également démontré que la disponibilité du molybdène ainsi que les températures, telles que rencontrées en milieux boréaux, seraient deux facteurs importants contrôlant l’utilisation de la V-Nase. Les résultats présentés dans cette étude apportent une meilleure compréhension de la gestion des métaux cofacteurs de la nitrogénase au sein de la symbiose lichénique. Mais ils permettent surtout de remettre en question le paradigme de l’hégémonie du molybdène sur la fixation biologique de l’azote. Ainsi, la fixation d’azote en milieu continental repose sur un ensemble hétérogène d’enzymes, ce qui autorise aux organismes fixateurs d’azote une grande flexibilité vis-à-vis des paramètres environnementaux comme les basses températures. Cela leurs permet également une meilleure adaptation au stress métallique résultant de carences en micronutriments, notamment celle en molybdène. Ces résultats invitent également à réévaluer les modèles biogéochimiques liant les cycles des micronutriments aux cycles des macronutriments, particulièrement celui de l’azote.

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance. / Nitrogen is the most abundant element in the Earth's atmosphere with a percentage of 78 %. This element is essential for the biosynthesis of cellular organic material and is unusable in its stable diatomic form (N2) by most organisms. Only bacteria called diazotrophs such as Rhodobacter capsulatus are able to fix molecular nitrogen N2 through the synthesis of the nitrogenase enzyme. The latter catalyzes the reduction of N2 to NH4 which can then be absorbed by other organisms. The synthesis and activity of nitrogenase consumes a lot of energy and therefore implies a strict regulation and its inhibition when a sufficient amount of ammonium is available. Among the proteins involved in this regulation, is the membrane transporter AmtB which is responsible for the sensing and transportation of ammonia. In R. capsulatus, it was shown that following the addition of ammonium, AmtB reversibly inhibits (switch off / switch on) nitrogenase activity by sequestering the PII protein GlnK accompanied by the addition of an ADP ribose group onto the Fe subunit of the enzyme by DraT. In addition, the formation of this complex alone would not be sufficient for this inactivation, suggesting the sequestration of a third protein, DraG is required to inhibit its action of removing the ADP ribose from the nitrogenase and therefore its reactivation. To better understand the role of the AmtB in the fixation of nitrogen, regulation and transport of ammonium at the molecular level, the first part of this study was to introduce a point mutation by directed mutagenesis in the conserved residue W237 of AmtB . Hydrogen production is another property of R. capsulatus that has been studied for a long time. This bacterium is capable of producing hydrogen from organic compounds following photofermentation and the exclusive enzymatic intervention of nitrogenase. Several studies have been undertaken to improve the production of hydrogen. Some of them were involved in determining the optimum conditions that give maximum gas production while others were interested in improving the growth of the bacterium itself. Thus, since the bio-production of H2 by fermentation is catalyzed by the nitrogenase, it is important to study the regulation of the activity of this enzyme by different mechanisms such as the switch off by ADP ribosylation. Therefore, a mutant of R. capsulatus (DG9) lacking AmtB was studied in the second part of this thesis for its nitrogenase activity, its modification by GlnK-DraG, and to see the effects of different amino acids used in the growth medium on the regulation and therefore the future use of this strain for the production of H2. The results showed a continuous and uninterrupted activity of the nitrogenase when AmtB was absent with a maximum activity when proline was used as a nitrogen source for bacterial growth. In addition, Western blots were used to demonstrate the effect of ADP ribosylation on regulation and that the expression of GlnK and DraG were unchanged between the wild –type and mutant R. capsulatus. In conclusion, nitrogenase is not modified or inhibited when mutated amtB what makes the R. capsulatus strain DG9 an ideal candidate for biohydrogen production especially when glucose and proline are respectively used as source carbon and nitrogen for growth.

Ce travail de thèse a pour but d'étudier la fixation d'azote marine dans les environnements riches mais déficitaires en azote (N), comparé au phosphore (P) dans un rapport N:P<16, grâce à l'utilisation d'approches complémentaire en culture in vitro et sur le terrain in situ. La première partie de ce travail a consisté à évaluer la réponse de la fixation d'azote de la cyanobactérie unicellulaire diazotrophe Crocosphaera watsonii face à des concentrations micromolaires en azote inorganique dissous (DIN) supposées inhiber l'activité de fixation d'azote : - suite à un apport sporadique, ou, - après une longue période d'acclimatation. Les résultats de ces études n'ont pas permis d'observer une inhibition des activités de fixation d'azote de cet organisme, laissant supposer que ce processus pourrait être actif dans une zone de l'Océan ayant ces même caractéristiques biogéochimiques : le Sud Est Tropical de l'Océan Pacifique (ETSP). En effet, cette zone est une des trois plus grandes zones de minimum d'oxygène (OMZ) de l'Océan et d'intenses processus de pertes de N (dénitrification et anammox) y ont lieu, résultant en un déficit de N par rapport au P. Des études présumaient que des processus inverses, de gains de N par la fixation d'azote, pourraient y être actifs mais aucune mesure à l'échelle du bassin n'y avait été faite car la fixation d'azote n'était supposée se produire que dans les environnements oligotrophes, comme les gyres subtropicaux. Dans le cadre d'un projet international, des missions océanographiques ont pu avoir lieu dans cette zone en Février 2010 pendant un évènement El Niño et en Mars-Avril 2011 pendant un évènement La Niña. / The objectif of these thesis was to study dinitrogen fixation in marine environments rich but deficient of nitrogen (N) compared to phosphorus (P) in a ratio N:P<16, by using complementary approaches in culture in vitro and in the field in situ. The first part of this work was to evaluate the response of nitrogen-fixing unicellular Cyanobacteria Crocosphaera watsonii faced with micromolar concentrations of dissolved inorganic nitrogen (DIN) supposed to inhibit nitrogen fixation activity : - after sporadic input, or, - after a long period of acclimatization. The results of these studies have failed to observe the inhibition of nitrogen fixation activities of this organism, suggesting that this process could be active in an area of the Ocean with these same biogeochemical characteristics : the Eastern Tropical South Pacific (ETSP). Indeed, this area is one of the three largest oxygen minimum zones (OMZ) of the Ocean, where intense processes of N losses (denitrification and anammox) took place, resulting in a deficit of N compared to P. Studies assumed that the inverse process, gain of N by nitrogen fixation, could be active in the ETSP but no measurements across the basin have been performed because nitrogen fixation was assumed to occur only in oligotrophic environments, such as the subtropical gyres. In the framework of an international project, cruises took place in this area in February 2010 during a El Niño event and in March-April 2011 during a La Niña event. Results of these two cruises have confirmed that nitrogen fixation was unexpectedly active with an intensity comparable to those reported in oligotrophic areas.

Ce travail de thèse porte sur le devenir du N2 récemment fixé par les diazotrophes dans l’océan oligotrophe de surface.Il apparaît que le N2 récemment fixé est excrété dans le compartiment dissous par tous les diazotrophes marins étudiés et que l'amplitude de cette excrétion dépend d'abord des contraintes environnementales que des diazotrophes impliqués dans la fixation.Le transfert de N2 fixé vers le plancton non-diazotrophe a été quantifié en utilisant une méthodologie innovante (couplage de la spectrométrie de masse à ionisation secondaire à l’échelle nanoscopique (nanoSIMS) et du tri cellulaire par cytométrie en flux). En conditions naturelles, 5 à 20 % du N2 récemment fixé est transféré vers les communautés non diazotrophes, principalement via l’excrétion de NH4+. Ce transfert est deux fois plus efficace lorsque le N2 est fixé par le diazotrophe Trichodesmium que lorsqu’il est fixé par les diazotrophes unicellulaires Crocosphaera ou Cyanothece.L’export du N2 récemment fixé a été évalué en utilisant des larges mésocosmes équipés de pièges à sédiments, déployés dans le lagon de Nouvelle Calédonie, et enrichis en PO43- pour stimuler la fixation de N2. Lors de cette expérience, il a été démontré que la fixation de N2 a alimenté une grande partie de la production primaire nouvelle (>90 %) et que le N2 fixé par les diazotrophes a rapidement été exporté. Cet export a été direct, par la sédimentation des diazotrophes eux-mêmes (représentant ~20 % de la matière particulaire retrouvée dans les pièges au plus fort de l’efflorescence de diazotrophes), et indirect, par le transfert de ~20 % du N2 fixé vers les communautés non diazotrophes qui, à leur tour, ont sédimenté. / This PhD thesis, achieved within the framework of the VAHINE project, focuses on the fate of the recently fixed N2 by diazotrophes in the oligotrophic surface ocean.It appears that the release of the recently fixed N2 in the dissolved pool is a process shared between all diazotrophs tested and that the magnitude of this release depend on the environmental contrains rather than on diazotroph involved in fixation.The transfer of the N2 fixed toward non-diazotroph plankton has been investigated using an innovative methodology (coupling of nano-scale mass spectrometry (nanoSIMS) and cell sorting flow cytometry). It appeared that 5 to 20 % of the recently fixed N2 is transferred toward non-diazotroph plankton, mainly through NH4+ release. This transfer is twice more efficient when the N2 is fixed by the filamentous Trichodesmium compared to Crocosphaera and Cyanothece.Particulate export of the fixed N2 has been investigate in large in-situ mesocosms equipped with sediment traps, deployed in the New Caledonian lagoon and enriched with PO43- in order to stimulate N2 fixation. During this experiment, N2 fixation fueled a large part of the new primary production (>90 %) and that fixed N2 was quickly exported. The export has been direct, through the sedimentation of the diazotrophs themselves, and indirect, through the transfer of ~20 % of the recently fixed N2 toward non-diazotrophic plankton that have, in turn, sedimented.

Ce travail de thèse porte sur la quantification de la diazotrophie et son influence sur les cycles biogéochimiques dans l'océan de surface Pacifique tropical sud-ouest, une région particulièrement sous-échantillonnée à ce jour. Les objectifs de ce travail étaient (1) de quantifier la fixation de N2 et identifier les principaux acteurs de la diazotrophie dans cette région, (2) d’évaluer l'influence de la fixation de N2 sur la production primaire et sur l'export de carbone, (3) d’identifier les voies de transfert de l’azote fixé dans la chaine trophique planctonique.Il a été mis en évidence que la région du Pacifique tropical sud-ouest était un hot spot de fixation de N2. A l'ouest, les eaux oligotrophes des archipels Mélanésiens présentaient des taux de fixation de N2 élevés et la communauté diazotrophe était dominée par Trichodesmium. A l'est, les eaux ultra-oligotrophes de la gyre du Pacifique sud présentaient des taux de fixation de N2 plus faibles et la communauté diazotrophe était dominée par les UCYN-B.Des bilans d'azote montrent que la fixation de N2 contribuait à plus de 90 % des apports d'azote nouveau dans la couche euphotique, et soutenait donc la quasi intégralité de la production primaire nouvelle. L'étude des voies de transfert de l'azote fixé montre qu’entre 7 et 15 % de la fixation de N2 totale était transféré vers les organismes non-diazotrophes.Ces travaux de thèse démontrent que la diazotrophie soutient la pompe biologique dans l'océan Pacifique tropical sud-ouest, et qu'elle peut jouer un rôle déterminant dans la structure des communautés planctoniques et les cycles biogéochimiques du carbone et de l'azote dans les régions oligotrophes. / This PhD thesis focuses on the quantification of diazotrophy and its influence on biogeochemical cycles in the western tropical South Pacific Ocean, a critically under-sampled region so far. The aim of this work is to (1) quantify N2 fixation and identify the main contributors of diazotrophy in this region, (2) assess the influence of N2 fixation on primary production and carbon export, (3) identify transfer pathways of the fixed nitrogen in the planktonic food web.We have found that the western tropical South Pacific Ocean was a hotspot of N2 fixation. In the western part, the oligotrophic waters of the Melanesian archipelago presented high N2 fixation rates and diazotrophes were dominated by Trichodesmium. In the eastern part, the ultra-oligotrophic waters of the South Pacific gyre presented lower N2 fixation rates, and diazotrophs were dominated by UCYN-B.The nitrogen budgets show that N2 fixation contributed to more than 90 % of the of new nitrogen input in the photic layer. The study of the transfer pathways of the fixed nitrogen has shown that 7 to 15 % of total N2 fixation was transferred to non-diazotrophs.This PhD thesis indicates that diazotrophy sustains the biological pump in the western tropical South Pacific Ocean, and can have a critical influence in the planktonic community structure and in biogeochemical cycles of carbon and nitrogen in oligotrophic regions.

Medicago truncatula est une Légumineuse établissant une interaction symbiotique avec une bactérie tellurique de la famille des Rhizobiacées, Sinorhizobium meliloti. Cette interaction induit l’organogénèse racinaire d’un nouvel organe, la nodosité dans laquelle s’établit un microenvironnement propice à la différenciation de S. meliloti en bactéroïde fixateur du diazote atmosphérique. Ce dernier réduit ainsi le N2 atmosphérique en ammonium, assimilé ensuite par la plante hôte. Cette réduction étant très endergonique M. truncatula fournit aux bactéroïdes des substrats carbonés issus de la photosynthèse. Cependant, cette interaction n’est pas pérenne, du fait de la mise en place d’un processus de sénescence ; processus conduisant à la lyse des bactéroïdes et des cellules hôtes végétales. Cependant, à l’heure actuelle, ce processus de rupture symbiotique reste largement méconnu. Afin de mieux caractériser ce processus de sénescence, nous avons développé de nouveaux outils cytologiques permettant par microscopie confocale de suivre in vivo la viabilité, mais également le fonctionnement des bactéroïdes au sein de la cellule hôte végétale. Ces nouvelles approches cytologiques pourraient ainsi offrir de nouvelles perspectives pour une caractérisation plus précise du déroulement du processus de sénescence nodositaire. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons également cherché à déterminer l’implication de deux cystéines protéases dans la mise en place du processus de sénescence nodositaire. Une des caractéristiques de ce processus de sénescence est une hausse de l’activité protéolytique, notamment des activités cystéine protéases. L’analyse transcriptomique par cDNA-AFLP du processus de sénescence nodositaire (Van de Velde et al. 2006) a pu mettre en évidence 508 gènes différentiellement exprimés dont deux cystéines protéases, MtCP6 et MtVPE. L’analyse spatio-temporelle de MtCP6 et MtVPE, par fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS, a permis de mettre en évidence l’induction de ces deux gènes lors du processus de sénescence nodositaire aussi bien développementale qu’induit par un traitement abiotique ou lors d’une interaction symbiotique non efficace. De plus, nous avons pu démontrer, par génétique inverse, que la diminution de l’expression de ces deux protéases retarde la mise en place du processus de sénescence, alors que leur expression précoce conduit à la promouvoir. Enfin, l’étude par microscopie confocale de la localisation subcellulaire de ces protéases par fusion traductionnelle avec la GFP, démontre leur adressage aux bactéroïdes. Nos données tendent donc à démontrer le rôle clef de MtCP6 et de MtVPE dans le processus de sénescence nodositaire, où ces protéases pourraient participer directement au déclenchement d’une dégradation des bactéroïdes. / Medicago truncatula is a leguminous plant establishing a symbiotic interaction with the bacteria Sinorhizobium meliloti. This symbiosis leads to the de novo development of root nodules involved in biological nitrogen fixation. However, this symbiotic interaction is time limited and an early senescence appears in mature nodule entailing the formation of a senescence zone (zone IV). This degradation process occurs earlier in comparison to senescence of the whole plant. During nodule developmental senescence of plant host cells, a gradual degradation process induces a loss of vacuole and peribacteroid membrane (PBM). But this nodule degradation process still remains to be unravelled. To increase our understanding of the nodule senescence process, we developed new cytologic tools allowing an in vivo assessment of the viability and functioning of bacteroids within plant host cells. Therefore, these new tools provide a new insight of the nodule senescence process which may help for a finer characterization of the nodule senescence. In the M. truncatula model, a previous cDNA-AFLP analysis enlightens an upregulation of several cysteine proteinases during the transition from nitrogen fixing nodule to a senescent one; including an early expression of an SPG31-like peptidase known to be involved in leaf senescence (MtCP6) and a Vacuolar Processing Enzyme described as a plant caspase-like protein (MtVPE) involved in mechanisms similar to hypersensitive response in A. thaliana. In planta spatiotemporal analysis of the expression of these two cysteine proteinases using promoter:reporter gene GUS confirmed their expression during natural senescence at the junction between the nitrogen fixing zone (zone III) and the senescence zone (zone IV). Therefore, to acquire a better insight into the role of these cysteine proteases during the senescence program, we knocked down by RNAi the expression of each gene specifically at the interzone III-IV. Depletion of these transcripts induced a drastic increased of N2 fixation and nodule size. Conversely, overexpression of both genes in the zone III of nodule leads to an extension of the senescence zone. Confocal microscopy images of protein:GFP fusions showed that both proteinases are addressed to bacteroids within plant host cells. Our data revealed that MtCP6 and MtVPE are key players of the nodule senescence process and may be directly involved in symbiosome degradation.

La déficience des sols en éléments minéraux, particulièrement le phosphore (P) est une limitation majeure pour la croissance et le développement des légumineuses fixatrices d’azote. L’application des fertilisants phosphatés est une pratique traditionnelles pour satisfaire les besoins des plantes en P. Ainsi, pour tester l’efficacité d'utilisation du P pour la fixation symbiotique de l’azote (FSN) sous déficience en P, plusieurs lignées recombinantes (RILs) de haricot contrastantes dans leurs tolérance au déficit en P ont été utilisées. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’aptitude de ces RILs pour l’amélioration de la fertilité phosphatée des sols déficients en P et sa relation avec la croissance et la nodulation de la légumineuse. Pour atteindre ces objectifs, des expériences ont été réalisées sous serre et en champs d'agriculteurs. Sous conditions contrôlées (serre) et non contrôlées (champs), les résultats ont montré une diminution du pH des sols associée à une augmentation du P assimilable. Une telle augmentation de la disponibilité du P a eu un effet positif sur la nodulation et la croissance de certaines des RILs testées. Aussi, l’amélioration de l’aptitude de ces RILs à fixer l’azote atmosphérique et l’élévation de la libération des protons H+ par les racines nodulées ont été quantifiés en milieu contrôlé. Ainsi la diminution du pH du sol a permis de réduire l’indisponibilité du P dans la solution du sol en le transformant en une forme directement biodisponible pour ces plantes. En outre, les résultats ont montré des différences significatives entre les différentes RILs en termes de la biomasse aérienne et nodulaire selon les sites d'observation. Nous concluons que, outre leur aptitude de fixation d’azote, l’utilisation efficace du phosphore pour sauver des engrais minéraux et de réduire les risques de pollution et pourrait améliorer la disponibilité des sols P. / The deficiency of soil minerals, particularly phosphorus (P) is a major limitation for growth and development of nitrogen-fixing by legumes. The application of phosphate fertilizers is a traditional practice to meet the needs of plant P. Thus, to test the effectiveness of use of P for symbiotic nitrogen fixation (NSF) under P deficiency, several recombinant inbred lines (RILs) of beans in their contrasting tolerance to P deficiency have been used. The main objective of this study is to assess the ability of these RILs to improve the fertility of soils deficient in phosphorus (P) and its relationship with growth and nodulation of the legume. To achieve these objectives, some experiments were conducted in greenhouses and fields. Under controlled conditions (greenhouse) and uncontrolled conditions (field), the results showed decreasing in soil pH associated with Proton release H+ and P acquisition. The increasing in available P had a positive effect on nodulation and growth of some RILs tested. Also, improving the ability of these RILs to fix atmospheric nitrogen and release H+ by nodulated roots were quantified in a controlled environment. Thus the decreasing in soil pH has reduced the un-availability of P in soil solution by transforming it into a bio-available form to the plants. In addition, the results showed significant differences between RILs in biomass and nodulation as observation in sites. We conclude that, in addition to their ability to fix nitrogen, effective use of phosphorus to save mineral fertilizer and reduce the pollution risks and could improve the availability of soil P.