La thèse analyse les conditions de variation des motivations des étudiants chinois apprenant le français. Après la description historique du développement de l’enseignement du français et de la didactique du FLE en Chine, on s’est concentré sur l’enjeu affectant le plus la qualité de l’enseignement de la langue française : la motivation des enseignés. La particularité de cette recherche est l’application des approches motivationnelles en acquisition de la troisième langue (ATL), pour la première fois dans le contexte chinois de l’enseignement du français. À la suite de l’adaptation du modèle AMTB de Gardner, 184 questions ont constitué la banque de questions pour la production aléatoire de l’enquête. On a sélectionné une université publique chinoise comme lieu de recherche empirique et organisé trois passations pour observer la variation de la motivation : au début du semestre (point de départ), avant la fin du semestre et après les vacances. Plus de 180 étudiants du département de français ont participé à cette série d’enquêtes. On a comparé deux classes de chaque promotion dont l’une a suivi le système d’évaluation continue, et l’autre non. Tout en recueillant, d’une manière quantitative dans chaque classe, les variations des réponses des étudiants au sujet de la motivation, on a montré la supériorité du système d’évaluation continue pour la motivation dans l’apprentissage du français. Ce résultat est apparu, alors qu’on a également procédé à une analyse différentielle et comparative de l’influence de facteurs motivationnels, comme le genre des étudiants, la situation familiale et géographique, le niveau d’éducation des parents, l’apprentissage précoce du français, et les rôles des étudiants dans la classe. En faisant la synthèse des réponses des étudiants les plus motivés dans chaque classe, on a retrouvé les mêmes caractéristiques communes, ce qui nous semble constituer une première réponse sur la logique interne de la variation de la motivation dans l’acquisition du français. / The thesis analyzes the circumstances of the change in the motivations of Chinese students of french. After the historical description of the development of the teaching of french and teaching french in China, we focus on the analysis the issue that affects the quality of the french language instruction: the motivation of the taught. The special feature of this research is the application of motivational approaches in acquiring the third language (ATL) for the first time in the Chinese context of the teaching of french. As a result of the adaptation of the model AMTB of Gardner, 184 questions were question Bank for the random production of the investigation. We have selected a Chinese public University as place of empirical research and three passages for monitoring the change in motivation: at the beginning of the semester (starting point), before the end of the semester and after the holidays. More than 180 students of the french department participated in this series of surveys. In the form of a quantitative comparison, summarizes the motivational influence of natural, educational and family factors such as the sexe of students, the family situation, the preparation of the french course, the role of class and the reguliar evaluation system to better understand the internal logic of the change in motivation in acquisition of french.

La fixation de l’azote diatomique est un processus très important à la vie, vu sa nécessité dans la biosynthèse de plusieurs molécules de base; acides aminés, acides nucléiques, etc. La réduction de l’azote en ammoniaque est catalysée par la nitrogénase, une enzyme consommatrice de beaucoup d’énergie étant donné qu’elle nécessite 20 à 30 moles d’ATP pour la réduction d’une mole d’azote. De ce fait une régulation rigoureuse est exigée afin de minimiser le gaspillage d’énergie. Plusieurs systèmes de contrôle sont connus, aussi bien au niveau post-traductionnel que traductionnel. Chez la bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse R. capsulatus, la régulation de l’activité de la nitrogénase nécessite une panoplie de protéines dont la protéine membranaire AmtB, qui est impliquée dans le transport et la perception d’ammonium, et les protéines PII qui jouent plusieurs rôles clés dans la régulation de l’assimilation d’azote. Suite à l’ajout de l’ammonium dans le milieu, une inhibition réversible de l’activité de la nitrogénase est déclenchée via un mécanisme d’ADP-ribosylation de la nitrogénase. La séquestration de GlnK (une protéine PII) par l’AmtB permet à DraT, une ADP-ribosyltransférase, d’ajouter un groupement ADP-ribose sur la protéine-Fe de la nitrogénase l’empêchant ainsi de former un complexe avec la protéine-MoFe. Donc, le transfert d’électrons est bloqué, engendrant ainsi l’inhibition de l’activité de la nitrogénase qui dure aussi long que la concentration d’azote fixé reste élevé, phénomène appelé le « Switch-off/Switch-on » de la nitrogénase. Dans ce mémoire, pour mieux comprendre ce phénomène de régulation, des mutations ponctuelles au niveau de certains résidus conservés de la protéine AmtB, dont D338, G367, H193 et W237, étaient générées par mutagénèse dirigée, afin d’examiner d’avantage leur rôle dans le transport d’ammonium, la formation du complexe AmtB-GlnK, ainsi que dans le « Switch-off » et l’ADP-ribosylation. Les résultats permettent de conclure l’importance et la nécessité de certains résidus telle que le G367 dans la régulation de la nitrogénase et le transport d’ammonium, contrairement au résidu D338 qui ne semble pas être impliqué directement dans la régulation de l’activité de la nitrogénase. Ces résultats suggèrent d’autres hypothèses sur les rôles des acides aminés spécifiques d’AmtB dans ses fonctions comme transporteur et senseur d’ammonium. / The reduction of diatomic nitrogen is a very important biological process given the need of all organisms for fixed nitrogen for the biosynthesis of basic key molecules such as, amino acids, nucleic acids, etc.. The reduction of nitrogen to ammonia is catalyzed by nitrogenase, an enzyme with high energy demands since it requires 20 to 30 moles of ATP for the reduction of one mole of nitrogen. Therefore a strict control is required to minimize energy waste. Several systems of regulation are known, both at the translational and post-translational level. In the purple non-sulfur photosynthetic bacterium R. capsulatus, the post-translational regulation of nitrogenase activity requires an array of proteins, including; the membrane protein AmtB, implicated in the perception and transport of ammonium, and PII proteins, which play key roles in the regulation of nitrogen assimilation. Following the addition of ammonium to the medium nitrogenase activity is reversibly inhibited (nitrogenase switch-off) via a mechanism of ADP-ribosylation of nitrogenase. Sequestration of GlnK (PII protein) by AmtB allows DraT, an ADP-ribosyltransferase, to add an ADP-ribose group to the Fe protein preventing it from forming a complex with the MoFe protein and nitrogenase activity is consequently inhibited. To better understand this phenomenon, in this Master’s thesis point mutations were created by site-directed mutagenesis at specific conserved residues of the AmtB protein, namely, D338, G367, H193 and W237, in order to examine their role in ammonium transport, formation of an AmtB-GlnK complex, and the regulation of nitrogenase (Switch-off/ADP-ribosylation). Plasmid-borne mutant alleles were transferred to a ∆AmtB strain of R. capsulatus, and the resultant strains were subjected to a series of tests. These demonstrated the importance and necessity of certain residues, such as G367, in the regulation of nitrogenase and ammonium transport, in contrast to residue D338, which seems to have no direct role in the regulation of nitrogenase activity. These results suggest further hypotheses about the roles of specific amino acids of AmtB in its functions as a sensor and transporter for ammonium.

La fixation de l’azote diatomique est un processus très important à la vie, vu sa nécessité dans la biosynthèse de plusieurs molécules de base; acides aminés, acides nucléiques, etc. La réduction de l’azote en ammoniaque est catalysée par la nitrogénase, une enzyme consommatrice de beaucoup d’énergie étant donné qu’elle nécessite 20 à 30 moles d’ATP pour la réduction d’une mole d’azote. De ce fait une régulation rigoureuse est exigée afin de minimiser le gaspillage d’énergie. Plusieurs systèmes de contrôle sont connus, aussi bien au niveau post-traductionnel que traductionnel. Chez la bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse R. capsulatus, la régulation de l’activité de la nitrogénase nécessite une panoplie de protéines dont la protéine membranaire AmtB, qui est impliquée dans le transport et la perception d’ammonium, et les protéines PII qui jouent plusieurs rôles clés dans la régulation de l’assimilation d’azote. Suite à l’ajout de l’ammonium dans le milieu, une inhibition réversible de l’activité de la nitrogénase est déclenchée via un mécanisme d’ADP-ribosylation de la nitrogénase. La séquestration de GlnK (une protéine PII) par l’AmtB permet à DraT, une ADP-ribosyltransférase, d’ajouter un groupement ADP-ribose sur la protéine-Fe de la nitrogénase l’empêchant ainsi de former un complexe avec la protéine-MoFe. Donc, le transfert d’électrons est bloqué, engendrant ainsi l’inhibition de l’activité de la nitrogénase qui dure aussi long que la concentration d’azote fixé reste élevé, phénomène appelé le « Switch-off/Switch-on » de la nitrogénase. Dans ce mémoire, pour mieux comprendre ce phénomène de régulation, des mutations ponctuelles au niveau de certains résidus conservés de la protéine AmtB, dont D338, G367, H193 et W237, étaient générées par mutagénèse dirigée, afin d’examiner d’avantage leur rôle dans le transport d’ammonium, la formation du complexe AmtB-GlnK, ainsi que dans le « Switch-off » et l’ADP-ribosylation. Les résultats permettent de conclure l’importance et la nécessité de certains résidus telle que le G367 dans la régulation de la nitrogénase et le transport d’ammonium, contrairement au résidu D338 qui ne semble pas être impliqué directement dans la régulation de l’activité de la nitrogénase. Ces résultats suggèrent d’autres hypothèses sur les rôles des acides aminés spécifiques d’AmtB dans ses fonctions comme transporteur et senseur d’ammonium. / The reduction of diatomic nitrogen is a very important biological process given the need of all organisms for fixed nitrogen for the biosynthesis of basic key molecules such as, amino acids, nucleic acids, etc.. The reduction of nitrogen to ammonia is catalyzed by nitrogenase, an enzyme with high energy demands since it requires 20 to 30 moles of ATP for the reduction of one mole of nitrogen. Therefore a strict control is required to minimize energy waste. Several systems of regulation are known, both at the translational and post-translational level. In the purple non-sulfur photosynthetic bacterium R. capsulatus, the post-translational regulation of nitrogenase activity requires an array of proteins, including; the membrane protein AmtB, implicated in the perception and transport of ammonium, and PII proteins, which play key roles in the regulation of nitrogen assimilation. Following the addition of ammonium to the medium nitrogenase activity is reversibly inhibited (nitrogenase switch-off) via a mechanism of ADP-ribosylation of nitrogenase. Sequestration of GlnK (PII protein) by AmtB allows DraT, an ADP-ribosyltransferase, to add an ADP-ribose group to the Fe protein preventing it from forming a complex with the MoFe protein and nitrogenase activity is consequently inhibited. To better understand this phenomenon, in this Master’s thesis point mutations were created by site-directed mutagenesis at specific conserved residues of the AmtB protein, namely, D338, G367, H193 and W237, in order to examine their role in ammonium transport, formation of an AmtB-GlnK complex, and the regulation of nitrogenase (Switch-off/ADP-ribosylation). Plasmid-borne mutant alleles were transferred to a ∆AmtB strain of R. capsulatus, and the resultant strains were subjected to a series of tests. These demonstrated the importance and necessity of certain residues, such as G367, in the regulation of nitrogenase and ammonium transport, in contrast to residue D338, which seems to have no direct role in the regulation of nitrogenase activity. These results suggest further hypotheses about the roles of specific amino acids of AmtB in its functions as a sensor and transporter for ammonium.

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance. / Nitrogen is the most abundant element in the Earth's atmosphere with a percentage of 78 %. This element is essential for the biosynthesis of cellular organic material and is unusable in its stable diatomic form (N2) by most organisms. Only bacteria called diazotrophs such as Rhodobacter capsulatus are able to fix molecular nitrogen N2 through the synthesis of the nitrogenase enzyme. The latter catalyzes the reduction of N2 to NH4 which can then be absorbed by other organisms. The synthesis and activity of nitrogenase consumes a lot of energy and therefore implies a strict regulation and its inhibition when a sufficient amount of ammonium is available. Among the proteins involved in this regulation, is the membrane transporter AmtB which is responsible for the sensing and transportation of ammonia. In R. capsulatus, it was shown that following the addition of ammonium, AmtB reversibly inhibits (switch off / switch on) nitrogenase activity by sequestering the PII protein GlnK accompanied by the addition of an ADP ribose group onto the Fe subunit of the enzyme by DraT. In addition, the formation of this complex alone would not be sufficient for this inactivation, suggesting the sequestration of a third protein, DraG is required to inhibit its action of removing the ADP ribose from the nitrogenase and therefore its reactivation. To better understand the role of the AmtB in the fixation of nitrogen, regulation and transport of ammonium at the molecular level, the first part of this study was to introduce a point mutation by directed mutagenesis in the conserved residue W237 of AmtB . Hydrogen production is another property of R. capsulatus that has been studied for a long time. This bacterium is capable of producing hydrogen from organic compounds following photofermentation and the exclusive enzymatic intervention of nitrogenase. Several studies have been undertaken to improve the production of hydrogen. Some of them were involved in determining the optimum conditions that give maximum gas production while others were interested in improving the growth of the bacterium itself. Thus, since the bio-production of H2 by fermentation is catalyzed by the nitrogenase, it is important to study the regulation of the activity of this enzyme by different mechanisms such as the switch off by ADP ribosylation. Therefore, a mutant of R. capsulatus (DG9) lacking AmtB was studied in the second part of this thesis for its nitrogenase activity, its modification by GlnK-DraG, and to see the effects of different amino acids used in the growth medium on the regulation and therefore the future use of this strain for the production of H2. The results showed a continuous and uninterrupted activity of the nitrogenase when AmtB was absent with a maximum activity when proline was used as a nitrogen source for bacterial growth. In addition, Western blots were used to demonstrate the effect of ADP ribosylation on regulation and that the expression of GlnK and DraG were unchanged between the wild –type and mutant R. capsulatus. In conclusion, nitrogenase is not modified or inhibited when mutated amtB what makes the R. capsulatus strain DG9 an ideal candidate for biohydrogen production especially when glucose and proline are respectively used as source carbon and nitrogen for growth.

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +. / Nitrogen is one of the most vital elements in the world for living creatures since it is essential for the production of the basic building blocks of the cell; amino acids, nucleic acids and other cellular constituents. The atmosphere is 78% nitrogen gas (N2), a source of nitrogen unusable by most organisms except for those possessing the enzyme nitrogenase, such as diazotrophic bacteria species. These microorganisms are capable of converting atmospheric nitrogen to ammonia (NH3), which is one of the most preferable nitrogen sources. This ATP demanding reaction, called nitrogen fixation, is catalysed by the nitrogenase enzyme, which is the most important enzyme in the nitrogen cycle. Some proteins are potential regulators of nitrogenase synthesis and activity; AmtB, DraT, DraG, PII proteins and etc. In this thesis I performed various experiments in order to better understand their roles in Rhodobacter capsulatus, in more detail. The membrane protein AmtB, which is widespread among archaea, bacteria and eukaryotes, is a member of the MEP/Amt/Rh family. The AmtB proteins are ammonium transporters, taking up external ammonium, and have also been suggested to sense the presence of ammonium. It has been shown that in Rhodobacter capsulatus AmtB functions as a sensor for the presence of external ammonium in order to regulate nitrogenase. Nitrogenase consists of two metalloprotein components named MoFe-protein and Fe-protein. The addition of ammonium to R. capsulatus culture medium leads to a series of reactions which result in the deactivation of nitrogenase, called “nitrogenase switch-off”. A critical reaction in this process is one in which DraT adds an ADP-ribose group to the Fe-protein of nitrogenase. The entrance of ammonia through the AmtB pore is regulated by GlnK sequestration. GlnK is a PII protein and PII proteins are one of the central proteins in the regulation of nitrogen metabolism. Not only is GlnK-AmtB sequestration important in nitrogenase regulation, but binding of ammonium by AmtB or its partial transport is also necessary. AmtB-GlnK complexes are thought to bind DraG, which is responsible for removing the ADP-ribose that DraT adds to nitrogenase, to form a ternary complex. In this thesis details of the signal transduction mechanism and ammonium transport were examined by generating and characterizing RCZC, a (D335A) site- directed mutant of AmtB. The ability of this mutant, as well as previously constructed mutants RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) and RCIA4 (W237A), to “switch-off” nitrogenase activity was measured by gas chromatography. The results revealed that all the above amino acid residues have critical roles in nitrogenase regulation. Immunoblotting was also carried out to check the presence of ADP-ribosylated Fe-protein. D335, D388 and W237 seem to be crucial for NifH ADP-ribosylation, since their mutants (RCZC, RCIA1 and RCIA4 respectively) didn't show ADP-ribosylation on Fe-protein. In addition, although a slight ADP-ribosylation was observed for RCIA2 (G344C) we still consider it as an important amino acid residue in this matter whereas the remaining mutant RCIA3 (H193E) showed Fe-protein ADP-ribossylation after an ammonium shock, therefore it doesn't seem to be important in NifH ADP-ribosylation. In addition R. capsulatus possesses a second Amt called AmtY, which in contrast to AmtB, doesn't appear to have any specific roles. In order to find out its functionality, AmtY was overexpressed in an E. coli strain lacking AmtB (GT1001 pRSG1) (which was carried out previously by other lab members) and AmtY-GlnK complex formation in response to ammonium addition was examined. It was shown that even though AmtY is able to take up ammonia when expressed in E. coli it fails to associate with GlnK in response to NH4+.

L'azote est l'un des éléments les plus essentiels dans le monde pour les êtres vivants, car il est essentiel pour la production des éléments de base de la cellule, les acides aminés, les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires. L’atmosphère est composé de 78% d'azote gazeux, une source d'azote inutilisable par la plupart des organismes à l'exception de ceux qui possèdent l’enzyme nitrogénase, tels que les bactéries diazotrophique. Ces micro-organismes sont capables de convertir l'azote atmosphérique en ammoniac (NH3), qui est l'une des sources d'azote les plus préférables. Cette réaction exigeant l’ATP, appelée fixation de l'azote, est catalysée par une enzyme, nitrogénase, qui est l'enzyme la plus importante dans le cycle de l'azote. Certaines protéines sont des régulateurs potentiels de la synthèse de la nitrogénase et de son activité; AmtB, DraT, DraG, les protéines PII, etc.. Dans cette thèse, j'ai effectué diverses expériences afin de mieux comprendre leurs rôles détailés dans Rhodobacter capsulatus. La protéine membranaire AmtB, très répandue chez les archaea, les bactéries et les eucaryotes, est un membre de la famille MEP / Amt / Rh. Les protéines AmtB sont des transporteurs d'ammonium, importateurs d'ammonium externe, et ont également été suggéré d’agir comme des senseurs d'ammonium. Il a été montré que l’AmtB de Rhodobacter capsulatus fonctionne comme un capteur pour détecter la présence d'ammonium externe pour réguler la nitrogénase. La nitrogénase est constituée de deux métalloprotéines nommées MoFe-protéine et Fe-protéine. L'addition d'ammoniaque à une culture R. capsulatus conduit à une série de réactions qui mènent à la désactivation de la nitrogénase, appelé "nitrogénase switch-off". Une réaction critique dans ce processus est l’ajout d’un groupe ADP-ribose à la Fe-protéine par DraT. L'entrée de l'ammoniac dans la cellule à travers le pore AmtB est contrôlée par la séquestration de GlnK. GlnK est une protéine PII et les protéines PII sont des protéines centrales dans la régulation du métabolisme de l'azote. Non seulement la séquestration de GlnK par AmtB est importante dans la régulation nitrogénase, mais la liaison de l'ammonium par AmtB ou de son transport partiel est également nécessaire. Les complexes AmtB-GlnK sont supposés de lier DraG, l’enzyme responsable pour enlever l'ADP-ribose ajouté à la nitrogénase par DraT, ainsi formant un complexe ternaire. Dans cette thèse certains détails du mécanisme de transduction du signal et de transport d'ammonium ont été examinés par la génération et la caractérisation d’un mutant dirigé, RCZC, (D335A). La capacité de ce mutant, ainsi que des mutants construits précédemment, RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) et RCIA4 (W237A), d’effectuer le « switch-off » de la nitrogénase a été mesurée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats ont révélé que tous les résidus d'acides aminés ci-dessus ont un rôle essentiel dans la régulation de la nitrogénase. L’immunobuvardage a également été effectués afin de vérifier la présence de la Fe-protéine l'ADP-ribosylée. D335, D388 et W237 semblent être cruciales pour l’ADP-ribosylation, puisque les mutants RCZC, RCIA1 et RCIA4 n'a pas montré de l’ADP-ribosylation de la Fe-protéine. En outre, même si une légère ADP-ribosylation a été observée pour RCIA2 (G344C), nous le considérons comme un résidu d'acide aminé important dans la régulation de la nitrogénase. D’un autre coté, le mutant RCIA3 (H193E) a montré une ADP-ribosylation de la Fe-protéine après un choc d'ammonium, par conséquent, il ne semble pas jouer un rôle important dans l’ADP-ribosylation. Par ailleurs R. capsulatus possède une deuxième Amt appelé AmtY, qui, contrairement à AmtB, ne semble pas avoir des rôles spécifiques. Afin de découvrir ses fonctionnalités, AmtY a été surexprimée dans une souche d’E. coli manquant l’AmtB (GT1001 pRSG1) (réalisée précédemment par d'autres membres du laboratoire) et la formation des complexes AmtY-GlnK en réponse à l'addition d’ammoniac a été examinée. Il a été montré que même si AmtY est en mesure de transporter l'ammoniac lorsqu'il est exprimé dans E. coli, elle ne peut pass’ associer à GlnK en réponse à NH4 +. / Nitrogen is one of the most vital elements in the world for living creatures since it is essential for the production of the basic building blocks of the cell; amino acids, nucleic acids and other cellular constituents. The atmosphere is 78% nitrogen gas (N2), a source of nitrogen unusable by most organisms except for those possessing the enzyme nitrogenase, such as diazotrophic bacteria species. These microorganisms are capable of converting atmospheric nitrogen to ammonia (NH3), which is one of the most preferable nitrogen sources. This ATP demanding reaction, called nitrogen fixation, is catalysed by the nitrogenase enzyme, which is the most important enzyme in the nitrogen cycle. Some proteins are potential regulators of nitrogenase synthesis and activity; AmtB, DraT, DraG, PII proteins and etc. In this thesis I performed various experiments in order to better understand their roles in Rhodobacter capsulatus, in more detail. The membrane protein AmtB, which is widespread among archaea, bacteria and eukaryotes, is a member of the MEP/Amt/Rh family. The AmtB proteins are ammonium transporters, taking up external ammonium, and have also been suggested to sense the presence of ammonium. It has been shown that in Rhodobacter capsulatus AmtB functions as a sensor for the presence of external ammonium in order to regulate nitrogenase. Nitrogenase consists of two metalloprotein components named MoFe-protein and Fe-protein. The addition of ammonium to R. capsulatus culture medium leads to a series of reactions which result in the deactivation of nitrogenase, called “nitrogenase switch-off”. A critical reaction in this process is one in which DraT adds an ADP-ribose group to the Fe-protein of nitrogenase. The entrance of ammonia through the AmtB pore is regulated by GlnK sequestration. GlnK is a PII protein and PII proteins are one of the central proteins in the regulation of nitrogen metabolism. Not only is GlnK-AmtB sequestration important in nitrogenase regulation, but binding of ammonium by AmtB or its partial transport is also necessary. AmtB-GlnK complexes are thought to bind DraG, which is responsible for removing the ADP-ribose that DraT adds to nitrogenase, to form a ternary complex. In this thesis details of the signal transduction mechanism and ammonium transport were examined by generating and characterizing RCZC, a (D335A) site- directed mutant of AmtB. The ability of this mutant, as well as previously constructed mutants RCIA1 (D338A), RCIA2 (G344C), RCIA3 (H193E) and RCIA4 (W237A), to “switch-off” nitrogenase activity was measured by gas chromatography. The results revealed that all the above amino acid residues have critical roles in nitrogenase regulation. Immunoblotting was also carried out to check the presence of ADP-ribosylated Fe-protein. D335, D388 and W237 seem to be crucial for NifH ADP-ribosylation, since their mutants (RCZC, RCIA1 and RCIA4 respectively) didn't show ADP-ribosylation on Fe-protein. In addition, although a slight ADP-ribosylation was observed for RCIA2 (G344C) we still consider it as an important amino acid residue in this matter whereas the remaining mutant RCIA3 (H193E) showed Fe-protein ADP-ribossylation after an ammonium shock, therefore it doesn't seem to be important in NifH ADP-ribosylation. In addition R. capsulatus possesses a second Amt called AmtY, which in contrast to AmtB, doesn't appear to have any specific roles. In order to find out its functionality, AmtY was overexpressed in an E. coli strain lacking AmtB (GT1001 pRSG1) (which was carried out previously by other lab members) and AmtY-GlnK complex formation in response to ammonium addition was examined. It was shown that even though AmtY is able to take up ammonia when expressed in E. coli it fails to associate with GlnK in response to NH4+.