Le rôle des protéines avec un motif TerD est depuis toujours insaisissable. La séquence en acides aminés qui correspond au motif TerD est répandue dans les génomes de plusieurs espèces bactériennes. Les recherches effectuées dans le cadre de ce doctorat avaient pour objectif d’identifier le rôle du gène tdd8 (SCO2368) qui code pour une protéine avec un motif TerD chez Streptomyces coelicolor. Sur la base d’une étude comparative du transcriptome de souches présentant une expression différentielle de tdd8, il a été possible de déterminer l’implication de tdd8 dans plusieurs systèmes de régulation. Les résultats obtenus ont permis d'établir que le niveau d’expression de tdd8 peut jouer un rôle dans le mécanisme de la différenciation morphologique et de la sporulation, dans le métabolisme de l’azote et dans l’équilibre redox. La protéine Tdd8 semble avoir un rôle dans divers processus cellulaires de par son implication dans l’homéostasie du calcium intracellulaire qui a été démontrée dans cette étude. Parmi les gènes qui semblent affectés par le taux d’expression de tdd8, ces recherches ont identifié un regroupement de gènes impliqués dans la réponse au stress redox. La plupart de ces gènes sont positionnés sur deux loci et leur expression implique un système de régulation analogue au régulon DosR retrouvé chez Mycobactérium tuberculosis. La croissance de la souche M145 de S. coelicolor en conditions de stress (hypoxie et présence d’oxyde nitrique) a permis de confirmer l’induction de ces gènes et des recherches bioinformatiques ont permis d’identifier un motif de liaison DosR dans les séquences qui précèdes la région codante de plusieurs gènes situés dans les deux loci identifiés. Les recherches ont également permis une meilleure caractérisation du métabolisme de l’azote et notamment une implication de tdd8 dans la régulation de ce métabolisme. Ces travaux s’inscrivent dans un processus de recherche fondamentale qui permet de mieux comprendre le rôle des protéines avec un motif TerD.

Le rôle des protéines avec un motif TerD est depuis toujours insaisissable. La séquence en acides aminés qui correspond au motif TerD est répandue dans les génomes de plusieurs espèces bactériennes. Les recherches effectuées dans le cadre de ce doctorat avaient pour objectif d’identifier le rôle du gène tdd8 (SCO2368) qui code pour une protéine avec un motif TerD chez Streptomyces coelicolor. Sur la base d’une étude comparative du transcriptome de souches présentant une expression différentielle de tdd8, il a été possible de déterminer l’implication de tdd8 dans plusieurs systèmes de régulation. Les résultats obtenus ont permis d'établir que le niveau d’expression de tdd8 peut jouer un rôle dans le mécanisme de la différenciation morphologique et de la sporulation, dans le métabolisme de l’azote et dans l’équilibre redox. La protéine Tdd8 semble avoir un rôle dans divers processus cellulaires de par son implication dans l’homéostasie du calcium intracellulaire qui a été démontrée dans cette étude. Parmi les gènes qui semblent affectés par le taux d’expression de tdd8, ces recherches ont identifié un regroupement de gènes impliqués dans la réponse au stress redox. La plupart de ces gènes sont positionnés sur deux loci et leur expression implique un système de régulation analogue au régulon DosR retrouvé chez Mycobactérium tuberculosis. La croissance de la souche M145 de S. coelicolor en conditions de stress (hypoxie et présence d’oxyde nitrique) a permis de confirmer l’induction de ces gènes et des recherches bioinformatiques ont permis d’identifier un motif de liaison DosR dans les séquences qui précèdes la région codante de plusieurs gènes situés dans les deux loci identifiés. Les recherches ont également permis une meilleure caractérisation du métabolisme de l’azote et notamment une implication de tdd8 dans la régulation de ce métabolisme. Ces travaux s’inscrivent dans un processus de recherche fondamentale qui permet de mieux comprendre le rôle des protéines avec un motif TerD.

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote. / The atmosphere of the Earth is very rich in nitrogen (N2). However, diatomic nitrogen is very stable and therefore unusable by the majority of life forms even though it is necessary for the synthesis of a variety of organic compounds. Only diazotrophic procaryotes are capable of using N2 as nitrogen source. Their nitrogen fixation allows the production of aminated compounds from atmospheric nitrogen (78 %). However, this process is very complex and requires the biosynthesis of about twenty proteins and the consumption of a lot of energy (16 molecules of ATP per molecule of N2 fixed), thus necessitating its tight regulation. The purple non-sulfur photosynthetic bacteria are known for their ability to carry out nitrogen fixation. Studies conducted in the light, the preferred mode of growth of these bacteria (anaerobic photosynthetic), have shown that nitrogenase (the enzyme responsible for dinitrogen fixation) is subject to regulation at three levels: transcriptional regulation of NifA (activator protein for the transcription of nif genes), posttranslational regulation of the activity of NifA to activate nif gene transcription, and posttranslational regulation of nitrogenase activity when cells are subjected to an ammonium shock. The control system already described involves essentially a membrane protein, AmtB and both PII proteins, GlnK and GlnB. It has long been known that nitrogenase is regulated when light is suddenly removed from a culture, but until now it is unclear whether these systems are also involved in the regulation of nitrogen fixation in dark. Thus, one outstanding question is what are the proteins involved in the inactivation of nitrogenase when a light-grown culture is placed in the dark? An analysis of several mutant strains; amtB-, glnK-, glnB-, and amtY- under different conditions of nitrogen deficiency was used to address this question. Using measurements of nitrogenase activity and Fe protein modification by Western blotting, we were able to show that darkness causes a "switch-off” of nitrogenase due to ADP- ribosylation of Fe protein. Thus, the system that has already been described as involved in the response to a lack of ammonia, is also required for a response to a lack of light or energy (AmtB, GlnK, GlnB, DraG, and DraT, and AmtY). However, Rhodobacter capsulatus is also able to fix nitrogen and grow micro-aerobically in the dark as well as photosynthetically under anaerobic conditions, but so far its regulation in the dark has been little studied. The study of nitrogen fixation in the dark allowed us to show that the Rnf membrane complex is not required for growth of R. capsulatus in such conditions. In order to develop a way to study its regulation during this growth mode, we have attempted to identify the operating conditions (O2, [NH4+]), allowing R. capsulatus to fix nitrogen micro-aerobically. The optimization of this conditions has shown that the optimal concentration of oxygen required is 10% mixed with nitrogen.

L'achèvement de la fermentation alcoolique est corrélé au niveau de formation de biomasse, qui varie selon les souches de levure S. cerevisiae. La maîtrise de cette fermentation passe par une meilleure compréhension des liens entre métabolisme azoté et formation de biomasse ainsi que des mécanismes contribuant aux variations de formation de biomasse entre souches. L'analyse des cinétiques de consommation de 18 composés azotés a montré que l'ordre de consommation des sources d'azote est similaire pour 14 souches et s'explique principalement par les caractéristiques cinétiques et le mode de régulation des perméases impliquées dans leur transport. Par contre, des variations sont observées dans les profils de consommation de l'azote, qui mettent en jeu des mécanismes différents suivant la disponibilité en azote du milieu. En présence d'un excès d'azote, les souches « faibles productrices » présentent une capacité limitée d'assimilation de l'ammonium ; lorsque l'azote est présent en faible quantité, elles métabolisent plus efficacement l'arginine stockée dans la vacuole pendant la phase de croissance. Afin de déterminer la distribution des flux d'azote dans la cellule, nous avons développé une approche quantitative basée sur la filiation isotopique de sources d'azote marquées 13C ou 15N. Cette étude a révélé une incorporation limitée des acides aminés exogènes dans la biomasse au profit de la synthèse de novo, à l'exception de la leucine majoritairement intégrée dans la biomasse et de l'arginine stockée dans la vacuole. Enfin, cette étude a confirmé expérimentalement que les capacités d'assimilation de l'ammonium et de remobilisation de l'arginine sont des éléments clés des différences de production de biomasse entre souches. Cette étude apporte un nouvel éclairage sur l'efficacité d'utilisation et l'allocation de sources complexes d'azote pendant la fermentation œnologique et sur les mécanismes impliqués dans la variabilité de production de biomasse chez S. cerevisiae. / The completion of alcoholic fermentation is correlated with the level of biomass formation, which varies depending on the S. cerevisiae yeast strain. Achieving a better control of the fermentation requires a better understanding of the relationship between nitrogen metabolism and biomass formation and of the mechanisms contributing to variation in biomass formation between strains. The analysis of the kinetics of consumption of 18 nitrogen compounds showed that the order of consumption of nitrogen sources is similar for 14 strains and is mainly due to the kinetic characteristics and mode of regulation of permeases involved in their transport. By cons, variations are observed in the patterns of nitrogen consumption, which involve different mechanisms depending on the availability of nitrogen in the medium. In the presence of excess nitrogen, "low producing" strains have a limited capacity for assimilation of ammonium; when nitrogen is present in small quantities, they metabolize more efficiently arginine stored in the vacuole during the growth phase. To determine the intracellular distribution of nitrogen fluxes, we developed a quantitative approach based on isotopic filiation of 13C or 15N labeled nitrogen sources. This study revealed a limited incorporation of exogenous amino acids in biomass in favor of de novo synthesis, with the exception of leucine mostly integrated in the biomass and arginine stored in the vacuole. Finally, this study confirmed experimentally that the capacity of ammonium assimilation and remobilization of arginine are key determinant governing the differences of biomass production between strains. This study sheds new light on the efficient use and allocation of complex nitrogen sources during wine fermentation and on the mechanisms involved in the differences in biomass production within the S. cerevisiae species.

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote. / The atmosphere of the Earth is very rich in nitrogen (N2). However, diatomic nitrogen is very stable and therefore unusable by the majority of life forms even though it is necessary for the synthesis of a variety of organic compounds. Only diazotrophic procaryotes are capable of using N2 as nitrogen source. Their nitrogen fixation allows the production of aminated compounds from atmospheric nitrogen (78 %). However, this process is very complex and requires the biosynthesis of about twenty proteins and the consumption of a lot of energy (16 molecules of ATP per molecule of N2 fixed), thus necessitating its tight regulation. The purple non-sulfur photosynthetic bacteria are known for their ability to carry out nitrogen fixation. Studies conducted in the light, the preferred mode of growth of these bacteria (anaerobic photosynthetic), have shown that nitrogenase (the enzyme responsible for dinitrogen fixation) is subject to regulation at three levels: transcriptional regulation of NifA (activator protein for the transcription of nif genes), posttranslational regulation of the activity of NifA to activate nif gene transcription, and posttranslational regulation of nitrogenase activity when cells are subjected to an ammonium shock. The control system already described involves essentially a membrane protein, AmtB and both PII proteins, GlnK and GlnB. It has long been known that nitrogenase is regulated when light is suddenly removed from a culture, but until now it is unclear whether these systems are also involved in the regulation of nitrogen fixation in dark. Thus, one outstanding question is what are the proteins involved in the inactivation of nitrogenase when a light-grown culture is placed in the dark? An analysis of several mutant strains; amtB-, glnK-, glnB-, and amtY- under different conditions of nitrogen deficiency was used to address this question. Using measurements of nitrogenase activity and Fe protein modification by Western blotting, we were able to show that darkness causes a "switch-off” of nitrogenase due to ADP- ribosylation of Fe protein. Thus, the system that has already been described as involved in the response to a lack of ammonia, is also required for a response to a lack of light or energy (AmtB, GlnK, GlnB, DraG, and DraT, and AmtY). However, Rhodobacter capsulatus is also able to fix nitrogen and grow micro-aerobically in the dark as well as photosynthetically under anaerobic conditions, but so far its regulation in the dark has been little studied. The study of nitrogen fixation in the dark allowed us to show that the Rnf membrane complex is not required for growth of R. capsulatus in such conditions. In order to develop a way to study its regulation during this growth mode, we have attempted to identify the operating conditions (O2, [NH4+]), allowing R. capsulatus to fix nitrogen micro-aerobically. The optimization of this conditions has shown that the optimal concentration of oxygen required is 10% mixed with nitrogen.