La fermentation sombre est un procédé utilisant des déchets organiques dont le passage à l'échelle pilote est limité par les rendements de production d'hydrogène trop faibles ainsi que par l'utilisation des sous-produits. Cette étude a pour premier objectif d'étudier l'effet du pH, de la combinaison du pH et de la concentration en substrat, du prétraitement du substrat et de l'adaptation de l'inoculum sur la fermentation sombre de trois types de déchet différents. Il a notamment été montré que la biodégradabilité des substrats joue un rôle majeur dans le choix des paramètres opérationnels utilisés pour optimiser la production d'hydrogène. De plus, la faisabilité et la stabilité à long terme de la production d'hydrogène par le procédé de fermentation sombre ont été mises en évidence en utilisant des déchets agroalimentaires et du petit lait dans deux réacteurs thermophiliques fonctionnant en mode semi-continu. En particulier, il a été discuté l'influence de la charge organique (OLR), du temps de rétention hydraulique (HRT) et de l'addition de co-substrats (fumier de buffle) comme source d'alcalinité. Cette étude a montré que la combinaison de ces trois paramètres peut jouer un rôle important sur le pH et la stabilité de la production d'hydrogène. De plus, les sous-produits de la fermentation sombre ont été utilisés pour produire de l'hydrogène via la photo-fermentation, alors que les déchets générés par le couplage de la fermentation sombre et de la photo-fermentation ont été valorisés pour la production de méthane par digestion anaérobie. Ce concept de bioraffinerie basé sur la conversion en trois étapes des déchets agroalimentaires augmente le rendement énergétique global du procédé. Par ailleurs, il a été montré le potentiel important du procédé de photo-fermentation pour la production de polyhydroxybutyrate (polymère), parallèlement à celle d'hydrogène. De même, l'utilisation de la fermentation par voie sèche dans une bioraffinerie concept apparaît prometteuse vis à vis de la production de bioénergie et de molécules telles que les acides organiques et les alcools / Low biohydrogen (H2) yields and use of process by-products from dark fermentation (DF) of waste biomass is limiting its scaled-up application. This study aims to investigate the effects of culture pH, combination of substrate concentration and culture pH, pre-treatment of substrate and inoculum adaptation in H2 yields during the DF of three different wastes biomass. The study showed that the biodegradability of the substrates is important for the selection and application of optimum operational parameters aimed at enhancing H2 production. Moreover, long-term operational feasibility and stability of dark fermentative H2 production was demostrated using food waste and cheese whey in two semi-continuous thermophilic DF reactors. The effect of organic loading rates (OLRs), hydraulic retention times (HRTs) and co-substrates (buffalo manure) addition as a source of alkalinity on culture pH and H2 production stability was discussed. The study showed that combination of OLR, HRT and co-substrate addition could play an important role in the culture pH and stability of H2 production. Furthermore, the by-products of DF process was utilized for H2 production via photo fermentation (PF), while the waste stream generated from coupling of DF and PF processes was converted to methane in anaerobic digestion (AD). The three-step conversion of food waste in a biorefinery concept increased the total energy yields. Moreover, PF also showed a good potential for concomitant production of H2 and polyhydroxybutyrate (biopolymer). Likewise, dry fermentation could be promising to a biorefinery concept based on waste biomass for the production of bioenergy and biochemicals (organic acids and alcohols)

A ce jour, le contexte énergétique mondial est dominé par une utilisation massive des énergies fossiles non-renouvelables et épuisables par nature. La production de biohydrogène de 2ème génération issu de déchets organiques par le procédé de fermentation sombre constitue donc une solution attractive pour diversifier le mix énergétique actuel. Dans ce cadre, l’objectif de ce travail est d’étudier l’influence de la qualité du mélange sur l’efficacité de la voie fermentaire sombre. En effet, les conditions d’agitation mécanique (type d’agitateur, vitesse d’agitation) et la viscosité du digestat (fonction des intrants en cours de culture), comptent parmi les paramètres abiotiques les moins étudiés à ce jour dans ce procédé. Or, l’agitation joue un rôle clé puisqu’elle doit permettre non seulement d’homogénéiser la phase liquide riche en bactéries, en substrats organiques, en métabolites et en biogaz soluble, mais aussi de favoriser les échanges de matière liquide-bactéries et liquide-gaz. Cependant, pour atteindre la qualité de mélange requise, il faut faire face à deux contraintes : d’une part il faut maintenir un niveau acceptable de stress mécanique pour les bactéries du consortium ; d’autre part, la puissance mécanique consommée par l’agitation doit rester limitée pour assurer la viabilité économique du procédé. Dans ce travail, les effets combinés de la viscosité du digestat et de la vitesse d’agitation des mobiles sur la production de biohydrogène dans un bioréacteur ont été étudiés dans un premier temps. Les résultats ont montré une influence significative de ces deux facteurs sur la productivité en biohydrogène qui a pu être reliée au nombre adimensionnel de Reynolds et au régime d’écoulement du digestat. Un maximum de productivité a été observé lors de la transition laminaire-turbulent. Dans un deuxième temps, des méthodes de détermination du temps de mélange (conductimétrie, décoloration chimique, Fluorescence Induite par Nappe Laser) et du transfert de matière liquide-gaz (désoxygénation/oxygénation) ont été mises en oeuvre dans les mêmes conditions de viscosité et d’agitation afin de rechercher les étapes limitantes pouvant expliquer les évolutions observées lors des essais de fermentation. Les résultats ont montré que transfert interfacial et mélange ne sont limitants qu’en régime laminaire, alors que les faibles productivités en régime turbulent résultent vraisemblablement d’une interaction entre la turbulence et les agrégats bactériens. Ensuite, l’écoulement dans le bioréacteur a été modélisé par une approche de type Mécanique des Fluides Numérique (CFD) et analysé par une méthode de Vélocimétrie par Images de Particules (PIV) afin de déterminer les échelles spatiales locales de la turbulence et de pouvoir les comparer à la dimension caractéristique des agrégats bactériens. Les mesures locales confirment les hypothèses émises à partir des valeurs moyennes observées. Finalement, un modèle de type ADM1 (Anaerobic Digestion Model N°1) standard a été modifié en prenant en compte les ions lactate et un modèle hydrodynamique de type « cascade de cellules » dans le but de simuler la production de biohydrogène en systèmes batch et continu. Les simulations sont en bon accord avec les résultats expérimentaux dans les deux modes de culture en supposant un réacteur parfaitement mélangé. En conclusion, l’ensemble de ce travail confirme que la viscosité du digestat et les conditions de mélange sont effectivement des paramètres essentiels à prendre en compte pour l’optimisation et l’extrapolation du procédé de fermentation sombre. / The global energy trends are currently dominated by a massive use of fossil non-renewable energy sources which are progressively depleting. In this way, the production of second-generation biohydrogen production from organic wastes by the dark fermentation process offers, therefore, an attractive solution to diversify the present energy mix. Within this framework, the aim of this work is to investigate the effect of the efficiency of the mixing process on dark fermentation. The conditions of mechanical agitation (mixer type, mixing speed) and the viscosity of the digestate (which depends on the variability of influent substrate concentration) are, indeed, among the abiotic factors that have been the most disregards up to now in this bioprocess. For example, mixing plays a key role because agitation conditions must ensure on the one hand the homogenization of the liquid phase enriched in bacteria, in organic substrate, in soluble metabolites, and in soluble biogas, and in the other hand promote liquid-to-bacteria and liquid-to-gas mass transfer. However, to reach the desired degree of mixing, two constraints must be faced: firstly, an acceptable level of mechanical stress must be maintained on the microbial consortium, and secondly, mechanical power input due to mixing must comply with the economic sustainability of the process. In this work, the combined effects of digestate viscosity and agitation conditions on the fermentative biohydrogen production in the bioreactor were studied first. Experimental results highlighted a significant effect of these factors on biohydrogen productivity which could be expressed as function of the purely hydrodynamic dimensionless Reynolds number and of the prevailing flow regime. Hydrogen production was maximized in the transition region between laminar and turbulent flow conditions. Secondly, experimental measuring methods of mixing time (conductimetric, chemical decolorization and Planar Laser Induced Fluorescence techniques) and mass transfer (dynamic deaeration/aeration) were implemented in the same conditions of viscosity and agitation conditions so as to investigate the possible limiting steps that could explain the trends observed in the mixed cultures. The results proved that mixing and liquid-gas transfer was slower than hydrogen production rate only in the laminar flow regime, while low production rate under turbulent flow conditions might stem from an interaction between turbulent eddies and bacterial aggregates. Then, the flow field in the bioreactor was simulated using a CFD (Computational Fluid Dynamics) methodology and analyzed experimentally using PIV (Particle Image Velocimetry) to determine the characteristic turbulent length scales and to compare them to the characteristic size of the bacterial aggregates. Local measurements confirmed the assumptions made from average values derived from power input data. Finally, a modified ADM1 model (Anaerobic Digestion Model N°1) was developed to simulate the biohydrogen production, accounting for lactate ions and non-ideal mixing, under batch and continuous culture conditions. Simulations fairly agree with experimental data in both modes of cultures assuming perfect mixing condition. As a conclusion, the present work as a whole confirms that digestate viscosity and mixing conditions constitute key parameters that must be considered for process optimization and for the scale-up of dark fermentation.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.