Que ce soit par la production de biomolécules actives ou encore via une action probiotique, les Lactobacilles peuvent être utilisés pour le traitement de plusieurs affections. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse est la recherche d’applications santé, applicables à la prévention de l’ostéoporose, à partir de Lactobacilles. Dans ce but, deux approches ont été définies, la première consiste en l’utilisation des souches en tant que probiotiques, la seconde approche concerne la production de peptides bioactifs issus de l’hydrolyse des protéines laitières par ces Lactobacilles. Après criblage et sélection de souches potentiellement probiotiques, la capacité des souches à moduler l’absorption du calcium au niveau intestinal a été étudiée. Pour l’approche peptides, différents criblages ont également été réalisés comprenant une stratégie de criblage originale basée sur l’analyse multiparamétrique de la protéolyse en lait. Ces travaux ont permis de sélectionner 3 souches pour la suite du projet, et différents hydrolysats peptidiques ont été produits par fermentation du lait en bioréacteur. Les hydrolysats produits ont été testés pour différentes activités en lien avec la prévention de l’ostéoporose comme l’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine ou la modulation de l’absorption intestinale du calcium. Différentes activités ont ainsi été mises en évidence pour les différents hydrolysats. De ces résultats, un procédé en continu utilisant un bioréacteur à membrane, a été développé afin de produire un hydrolysat peptidique d’intérêt. Ces travaux ont permis de mettre en évidence différentes applications santé à partir d’une collection de souches de Lactobacilles. / Lactobacilli are bacteria of major interest for health applications. These species are able to produce different active biomolecules by fermentation or exert a probiotic action. Thus, Lactobacilli represent a source of different ingredients which could be used for various health purposes. The objective of the present research is to study the potential of different lactobacilli to be use as ingredients dedicated to osteoporosis prevention. This work is based on a collection of 170 Lactobacillus strains isolated from dairy products in Mongolia. Two different strategies were undertaken: the use of lactobacilli as probiotics or the production of bioactive peptides by fermentation of milk proteins. A screening based on some probiotic characteristics allowed to select Lactobacillus strains which were studied for their capacity to modulate the intestinal calcium absorption. In the same way, screenings were used to select strains with important proteolytic abilities. Particularly, an original screening strategy, based on a multiparametric analysis of proteolysis occurring in milk was developed in this study. Milk protein hydrolysates were produced using the selected strains by batch fermentation of milk in bioreactor. The resulting products were then studied for different biological activity linked to bone health like angiotensin-converting enzyme inhibition or modulation of intestinal calcium absorption. By these results, an integrated continuous process, using a membrane bioreactor, was developed to produce an active ingredient by fermentation. This work highlights the potential health applications of some lactobacilli.

L’augmentation de la population mondiale, l’amélioration des niveaux de vie font que la demande en protéines animales devrait doubler d’ici à 2050. Ceci aura pour conséquence l’augmentation de la surface des terres agricoles entrainant des effets néfastes sur le climat et la biodiversité. Il est urgent de mieux qualifier les protéines agroalimentaires et d’en diversifier les sources pour pallier aux problèmes liés à la demande mondiale en protéines. Le marché du pet food, connait également une croissance constante, du fait de l’augmentation de la population des chiens et chats, et d’une relation entre le maître et l’animal de plus en plus humanisée. Les conditions de vie s’en trouvent modifiées, ce qui génère souvent des troubles métaboliques chez le chat et le chien. La digestion gastro-intestinale des protéines a longtemps été considérée exclusivement pour son rôle de fourniture d’acides aminés ; néanmoins, de nombreux travaux ont mis en évidence l’implication de peptides bioactifs, générés au cours de la digestion, dans de nombreuses fonctions biologiques comme l’homéostasie énergétique. Ils modulent notamment la sécrétion des hormones intestinales telles que les cholécystokinines (CCK) et le Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1) qui sont des signaux de régulation à court terme de la prise alimentaire. L’objectif principal de cette thèse a été de mesurer les effets sur la régulation de l’homéostasie énergétique de deux hydrolysats protéiques, issus d’un criblage préalable (une source poisson, PWF et une source carnée, XVP 15035), pour une application pet food. Dans un premier temps, un modèle de digestion gastro-intestinale in vitro simulant la digestion du chien a été mis au point. Une étude a ensuite été menée afin de caractériser le devenir des hydrolysats au cours de la digestion in vitro et de déterminer l’effet de ces digestats sur la régulation de la prise alimentaire à court terme, d’une part par leur capacité à réguler la sécrétion des CCK et du GLP-1 produits par les cellules entéroendocrines, et d’autre part, par leur pouvoir d’inhibition de l’activité de l’enzyme dipeptidyl peptidase-4 (DPP-IV) modulant l’activité du GLP-1. De nouveaux peptides bioactifs capables de stimuler la sécrétion des hormones intestinales et d’inhiber l’activité de la DPP-IV ont ensuite été identifiés grâce à des méthodes séparatives couplées à la spectrométrie de masse. Une étude in vivo, menée en parallèle chez le rat nourri en régime riche en graisse, a permis notamment de mettre en évidence l’effet inhibiteur de la prise alimentaire à court terme de l’hydrolysat PWF. / The increase in the world population and the improvement in living standards mean that the demand for animal protein is expected to double by 2050. This will result in an increase in the surface area of agricultural land, with negative effects on climate and biodiversity. There is an urgent need to better qualify agri-food proteins and diversify their sources to address the problems associated with global protein demand. The pet food market is also growing steadily, due to the increase in the population of dogs and cats, and an increasingly humanized relationship between the owner and the animal. As a result, living conditions have evolved, ultimately possibly leading to metabolic disorders in cats and dogs. Gastrointestinal digestion of proteins has long been considered exclusively for its role in providing amino acids; nevertheless, many studies have shown the involvement of protein-derived bioactive peptides, generated during digestion, in many biological functions such as energy homeostasis. They modulate the secretion of intestinal hormones such as cholecystokinins (CCK) and Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), which are short-term signals involved in the regulation of food intake. The main objective of this thesis was to measure the effects on the regulation of energy homeostasis of two protein hydrolysates, resulting from prior screening (a fish source, PWF and a meat source, XVP 15035), intended for the pet food applications. As a first step, an in vitro gastrointestinal digestion model simulating dog digestion was developed. A study was then conducted to characterize the fate of hydrolysates during in vitro digestion and to determine the effect of these digestates on the regulation of short-term food intake, both by their ability to regulate the secretion of CCKs and GLP-1 produced by enteroendocrine cells, and by their ability to inhibit the activity of the enzyme dipeptidyl peptidase-4 (DPP-IV) modulating GLP-1 activity.Novel bioactive peptides able to stimulate the secretion of intestinal hormones and to inhibit the DPP-IV activity were then identified using separation methods coupled with mass spectrometry. An in vivo study, conducted in parallel in high-fat diet fed rats, revealed in particular the inhibitory effect of PWF hydrolysate on short term food intake.

La conception de nouveaux produits laitiers fermentés fonctionnalisés avec les peptides bioactifs est l'une des stratégies prometteuses pour le développement d'aliments fonctionnels. L'objectif de cette thèse s'inscrit ainsi dans une démarche de production d'un lait fermenté contenant un peptide anxiolytique, l'alpha-casozépine (alpha-CZP ; f91-100 de la CN-alpha s1 bovine) ou du fragment plus court (f91-97). Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité des peptides bioactifs vis-à-vis des souches ayant le phénotype PrtS+ (LMD-9) et PrtS- (CNRZ1066) de S. thermophilus. Il s'est avéré que les deux souches sont capables d'hydrolyser le peptide en fragments plus courts par l'activité peptidasique de surface. Il a été vérifié que l'hydrolyse n'est due ni aux peptidases intracellulaires issues d'une éventuelle lyse cellulaire ni à la protéase chaperonne HtrA. Les activités de type amino-, X-prolyl dipeptidyl-, carboxy-peptidases et peptidyl dipeptidase de surface ont été mises en évidence. L'ajout de peptides bioactifs dans des laits fermentés nécessite donc la caractérisation préalable du potentiel protéolytique des bactéries lactiques. Afin de n'ajouter qu'un type de peptides et non pas une fraction peptidique, nous avons exprimé de manière hétérologue l'alpha-CZP sous forme multimérique chez L. lactis en utilisant le système d'induction NICE. Il a été révélé par le test ELISA qu'une petite quantité d'alpha-CZP multimérique a été produite par les cellules induites mais également non induites par la nisine. Le ralentissement important de la croissance des cellules de L. lactis recombinante induites par la nisine suggère que le multimère peptidique a des effets toxiques sur les cellules / The designing of novel fermented milk products functionalized with bioactive peptides is one of the promising strategies to develop functional foods. The objective of the thesis is thus the development of fermented milks comprising of an anxiolytic peptide, alpha-casozepine (f91-100 of bovine alpha s1 CN) or its shorter fragment (f91 97). Firstly, we studied the stability of different bioactive peptides towards two strains, with PrtS+ (LMD¬9) and PrtS- (CNRZ1066) phenotypes, of S. thermophilus, a starter bacterium widely used for the manufacture of yogurt. It was revealed that both strains hydrolysed the peptides into shorter fragments by surface peptidases. The hydrolysis was neither due to intracellular peptidases eventually released from cell lysis nor to extracellular chaperone protease HtrA, since mutant LMD-9-deltahtrA also showed the same type of hydrolysis. Aminopeptidase, X-prolyl dipeptidyl peptidase, peptidyl dipeptidase and carboxypeptidase activities associated to the cell-surface of both strains were observed. Therefore, addition of bioactive peptides in fermented milks requires well prior characterization of the proteolytic potential of lactic acid bacteria. Finally, in order to add only one type of peptides instead of a peptide fraction, we expressed heterologously alpha-CZP in multimeric form in L. lactis using NICE system. It was revealed by ELISA test that a small quantity of recombinant alpha-CZP multimer was produced by both nisin-induced as well as non-induced cells. The significant decrease in the growth of nisin-induced recombinant L. lactis suggests that the peptide multimer has toxic effects on the cells

Parmi 30 souches, seule 4F44 excrète une activité dans son milieu de culture qui ne résulte pas de la présence de protéases intracellulaires due à une lyse cellulaire.D’après le séquençage N-ter, l’enzyme soluble chez 4F44 est PrtS retrouvée sous deux formes (non mature et mature) à la fois ancrée (60%) et soluble (40%).Sa séquence protéique déduite de prtS est proche de celles de LMD-9 (97% identité), CNRZ385 (98%), JIM8232 (96%) et S. suis (97%) chez qui elle est toujours ancrée. Le domaine d’ancrage contenant LPNTG est conservé chez 4F44, LMD-9, CNRZ385 et S. suis ; ainsi elle serait ancrée au peptidoglycane par la sortase A (SrtA). Chez 4F44, l’absence d’une duplication peptidique imparfaite dans le prodomaine de PrtS pourrait expliquer sa libération partielle, en effet LMD-9 présentant cette duplication possède sa protéase PrtS uniquement sous forme ancrée.La comparaison de la séquence de la sortase déduite du gène de 4F44, ND03, LMD-9, PB18O, PB302 et CNRZ307 a montré que les sites catalytique et actif sont conservés. Seuls 6 résidus d’acides aminés sont différents, la substitution chez 4F44 de I222 par V222 entraînerait sa libération partielle. Les peptides trypsiques C-ter QVTQLPNTGENDTK et QVTQLPNTGENDTKYYLVPGVIIGLGTLLVSIRR ont été identifiés en MS/MS, donc la liaison TG (cible de l’activité peptidasique de SrtA) n’est pas hydrolysée. La caséine β est la caséine préférentiellement hydrolysée. L’enzyme présente une large spécificité de coupure (A, L, M, F, Y, W, V, S, T, N, Q, R, H et K en position P1). Globalement elle libère 33 peptides bioactifs : ECA-inhibiteurs, mitogènes, opioïdes, immunomodulants, antibactériens, antioxydants, antimutagènes / Among 30 strains, only 4F44 strain releases a activity in the medium which does not results from the presence of intracellular protease due to cell lysis. This soluble protease is PrtS in two forms (non mature and mature), 60% as anchored to cell wall and 40% as released in the medium. The protein sequence deduced from the gene is slightly different to those of LMD-9 (97% identity), CNRZ385 (98%), JIM8232 (96%), S. suis (97%). The protein sequence of the anchor domain including LPNTG is conserved as for LMD-9, CNRZ385 and S. suis ; so this PrtS might be anchored to peptidoglycan by sortase A (SrtA).In 4F44, the absence of an imperfect duplication of a peptide sequence at prodomain of PrtS could explain the partial liberation, furthermore, the LMD-9 strain which presents this duplication possess the protease PrtS only the anchored form.Comparison of protein sequence deduced from the srtA gene in 4F44, ND03, LMD-9, PB18O, PB302 and CNRZ307 strains showed that the residues of the catalytic and active sites are conserved. Six amino acids are different for 4F44, I222 replaced by a V222 possibly leads to the partial liberation of PrtS. The trypsic C-ter peptides QVTQLPNTGENDTK and QVTQLPNTGENDTKYYLVPGVIIGLGTLLVSIRR have been identified by MS/MS, indicating that the peptide bond of T and G (target of endopeptidasic activity of Srt A) is not hydrolyzed.β-casein is preferentially degraded in comparison to other caseins. Soluble PrtS has a broad specificity against A, L, M, F, Y, W, V, S, T, N, Q, R, H and K at position P1. Globally, it releases 33 bioactive peptides (antihypertensives, mitogenics, oipoide, immunomodulantors, antimicrobials, antioxydants, antimutagens)

Les protéines du lait bovin sont la source la plus importante en peptides bioactifs qui permettraient de maintenir le capital-Santé du consommateur. Nous nous sommes intéressés aux peptides inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I (ECA) et aux caséinophosphopeptides (CPP) chélateurs de minéraux pour étudier in vitro leur mécanisme d'interaction avec leurs cibles moléculaires. En effet, les peptides d'origine alimentaire, inhibiteurs de l'ECA (IEC) contribueraient à une prévention de l'hypertension. Pour comprendre la relation entre la séquence de ces peptides et leur pouvoir IEC, les paramètres d'inhibition de l'ECA somatique de poumon de lapin, qui possède 2 domaines N et C ayant chacun un site actif, par des peptides (FALPQYLK, FALPQY, ALPMHIR, IPP et VPP) issus de protéines du lait et des peptides dérivés ont été étudiés. De plus, l'interaction entre certains de ces peptides avec l'ECA somatique humaine a été caractérisée par la technologie Biacore®. La cartographie des sites de liaison de FALPQY en compétition avec le captopril (inhibiteur compétitif des 2 sites actifs de l'ECA) et le peptide BPP-11b (inhibiteur sélectif du domaine C de l'ECA) montre que ce peptide se fixe au niveau des 2 sites actifs de l'ECA. Par ailleurs, les CPP sont un bon moyen de corriger les carences minérales car ils sont capables de former des complexes solubles avec les cations, améliorant ainsi leur biodisponibilité. L'interaction entre le CPP [bêta]-CN (f1-25)4P et Ca2+, Mg2+, Zn2+ et Cu2+ a été étudiée par microcalorimétrie de titration isotherme : 1 mole de CPP fixe 2 moles de Ca2+, de Mg2+ ou de Zn2+ à pH 8, avec des constantes d'affinité faibles, mais ne fixe pas Cu2+ / Bovine milk proteins are the most important source of bioactive peptides. These peptides may contribute to maintain optimal health state. In the current study, we attempted to elucidate in vitro the molecular interaction mode between both angiotensin I-Converting enzyme (ACE) inhibitory peptides and mineral-Chelating caseinophosphopeptides (CPP). Indeed, ACE inhibitory peptides from food may provide a natural and safe alternative to prevent hypertension. In order to better understand the relationship between the sequence of ACE inhibitory peptides and their inhibitory potency, the inhibition parameters of rabbit lung somatic ACE (that possesses 2 domains, N and C, which are both catalytically active) by bovine milk peptides (FALPQYLK, FALPQY, ALPMHIR, IPP, and VPP) and other peptides with related sequence were investigated. Moreover, the interaction between some peptides and their derivatives with human somatic ACE was analyzed by Biacore® technology. The mapping of FALPQY-ACE interaction sites in competition with captopril (a competitive inhibitor for both sites) and also with BPP-11b (a selective inhibitor of the C-Domain active site) showed that FALPQY binds at or near the two active sites located on the 2 domains of ACE. In addition, CPP efficiently bind cations of nutritional interest by forming soluble complexes which prevent the precipitation of minerals at alkaline pH and increasing thus their bioavailability. The interaction between [beta]-CN (f1-25)4P, and Ca2+, Mg2+, Zn2+, and Cu2+ cations, was characterized by isothermal titration calorimetry: 1 mole of [beta]-CN (f1-25)4P binds 2 moles of Ca2+, Mg2+, and Zn2+ at a pH 8, with a low affinity, but does not bind Cu2+ cation