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Foaming during fermentation reduces the efficiency of the process leading to increased costs and reduced productivity. Foaming can be overcome by the use of chemical antifoaming agents, however their influence upon the growth of organisms and protein yield is poorly understood. The objective of this work was to evaluate the effects of different antifoams on recombinant protein production. Antifoam A, Antifoam C, J673A, P2000 and SB2121 were tested at different concentrations for their effect on the growth characteristics of Pichia pastoris producing GFP, EPO and A2aR and the yield of protein in shake flasks over 48 h. All antifoams tested increased the total GFP in the shake flasks compared to controls, at higher concentrations than would normally be used for defoaming purposes. The highest yield was achieved by adding 1 % P2000 which nearly doubled the total yield followed by 1 % SB2121, 1 % J673A, 0.6 % Antifoam A and lastly 0.8 % Antifoam C. The antifoams had a detrimental effect upon the production of EPO and A2aR in shake flasks, suggesting that their effects may be protein specific. The mechanisms of action of the antifoams was investigated and suggested that although the volumetric mass oxygen transfer coefficient (kLa) was influenced by the agents, their effect upon the concentration of dissolved oxygen did not contribute to the changes in growth or recombinant protein yield. Findings in small scale also suggested that antifoams of different compositions such as silicone polymers and alcoxylated fatty acid esters may influence growth characteristics of host organisms and the ability of the cells to secrete recombinant protein, indirectly affecting the protein yield. Upon scale-up, the concentration effects of the antifoams upon GFP yield in bioreactors was reversed, with lower concentrations producing a higher yield. These data suggest that antifoam can affect cells in a multifactorial manner and highlights the importance of screening for optimum antifoam types and concentrations for each bioprocesses.

Thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry (TD-GC-MS), acoustic emission (AE), and Raman, near infrared (NIR) and mid infrared (MIR) spectrometries were investigated to assess their potential as monitoring techniques for industrial antibiotic-producing Streptomyces and Basidiomyces fermentation processes.

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Les effets immunitaires bénéfiques des fibres sont surtout des effets indirects, dits « prébiotiques ». La chlorelle est une micro-algue verte d’eau douce qui a fait l’objet d’intenses recherches durant ces dernières années. Ce travail a caractérisé les effets immunologiques directs de différentes fibres et souches de micro-algues in vitro, puis in vivo pour les meilleurs candidats.Aucune fibres testées n’induit de cytokine par les cellules mononuclées du sang périphérique ni par les cellules épithéliales intestinales. Cependant, une fibre inhibe presque complètement les cytokines induites par des bactéries. Cette fibre semble donc avoir un effet immuno-suppresseur direct. Aucune des micro-algues testées n’induit la production de cytokines et semblent donc inertes. Cependant, le produit Algomed® qui est une forme atomisée de la Chlorella vulgaris induit une forte réponse immune. L’impact de deux fibres aux propriétés antagonistes et des chlorelles a été évaluée dans deux modèles murins de colite expérimentale mimant la pathologie humaine de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. L’administration de chlorelles n’a eu aucun effet sur l’évolution de la colite ni sur les marqueurs pro-inflammatoires. Dans le but de dissocier les effets immunologiques directs des effets indirects (prébiotiques), les fibres ont été administrées en temps court et en temps long. Dans le modèle TNBS, nous avons pu mettre en évidence un effet direct d’une fibre spécifique sur le système immunitaire murin. Ce potentiel immuno-modulateur intrinsèque et « fibre-dépendant » pourrait étendre la protection médiée par les prébiotiques dans les maladies inflammatoires intestinales. / Beneficial immune effects of fibers are mainly indirect, via the prebiotic effect. Chlorellas are a green freshwater micro-algae which have been the subject of intense research in recent years. This work attemps to characterize the direct immunological effects of fibers and micro-alga strains in vitro and then in vivo for the most promising candidates. None of fibers tested induce the production of cytokine by peripheral blood mononuclear cells and intestinal epithelial cells. However, only one from all fibers almost completely inhibited the production of pro-inflammatory cytokines induced by bacteria. This fiber seems to have direct immuno-suppressive effects. Among the micro-alga tested, none of them could induce the production of cytokines and all seem to be inert. However, the product Algomed® which is an atomized form of Chlorella sorokiniana induces a strong immune response. The impact of two antagonist fibers as well as chlorella preparations has been evaluated in two murine experimental colitis model mimicking human pathologies of inflammatory bowel disease. Administration of chlorella had no effect on the colitis neither on the pro-inflammatory markers. Fibers have been administred either in long and short term treatments in order to dissociate the direct immunological effect from indirect (prebiotics) ones. In the TNBS colitis model, we highlighted a direct effect of a specific fiber on the murine immune system. This intrinsic, fiber-dependant immunomodulatory potential may extend prebiotic-mediated protection in inflammatory bowel diseases.

Que ce soit par la production de biomolécules actives ou encore via une action probiotique, les Lactobacilles peuvent être utilisés pour le traitement de plusieurs affections. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse est la recherche d’applications santé, applicables à la prévention de l’ostéoporose, à partir de Lactobacilles. Dans ce but, deux approches ont été définies, la première consiste en l’utilisation des souches en tant que probiotiques, la seconde approche concerne la production de peptides bioactifs issus de l’hydrolyse des protéines laitières par ces Lactobacilles. Après criblage et sélection de souches potentiellement probiotiques, la capacité des souches à moduler l’absorption du calcium au niveau intestinal a été étudiée. Pour l’approche peptides, différents criblages ont également été réalisés comprenant une stratégie de criblage originale basée sur l’analyse multiparamétrique de la protéolyse en lait. Ces travaux ont permis de sélectionner 3 souches pour la suite du projet, et différents hydrolysats peptidiques ont été produits par fermentation du lait en bioréacteur. Les hydrolysats produits ont été testés pour différentes activités en lien avec la prévention de l’ostéoporose comme l’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine ou la modulation de l’absorption intestinale du calcium. Différentes activités ont ainsi été mises en évidence pour les différents hydrolysats. De ces résultats, un procédé en continu utilisant un bioréacteur à membrane, a été développé afin de produire un hydrolysat peptidique d’intérêt. Ces travaux ont permis de mettre en évidence différentes applications santé à partir d’une collection de souches de Lactobacilles. / Lactobacilli are bacteria of major interest for health applications. These species are able to produce different active biomolecules by fermentation or exert a probiotic action. Thus, Lactobacilli represent a source of different ingredients which could be used for various health purposes. The objective of the present research is to study the potential of different lactobacilli to be use as ingredients dedicated to osteoporosis prevention. This work is based on a collection of 170 Lactobacillus strains isolated from dairy products in Mongolia. Two different strategies were undertaken: the use of lactobacilli as probiotics or the production of bioactive peptides by fermentation of milk proteins. A screening based on some probiotic characteristics allowed to select Lactobacillus strains which were studied for their capacity to modulate the intestinal calcium absorption. In the same way, screenings were used to select strains with important proteolytic abilities. Particularly, an original screening strategy, based on a multiparametric analysis of proteolysis occurring in milk was developed in this study. Milk protein hydrolysates were produced using the selected strains by batch fermentation of milk in bioreactor. The resulting products were then studied for different biological activity linked to bone health like angiotensin-converting enzyme inhibition or modulation of intestinal calcium absorption. By these results, an integrated continuous process, using a membrane bioreactor, was developed to produce an active ingredient by fermentation. This work highlights the potential health applications of some lactobacilli.

Dans cette étude, nous avons isolé et évalué le potentiel probiotique et l’effet barrière de nouvelles souches de bactéries lactiques contre l’entérite nécrotique du poulet de chair; une infection qui cause des lésions intestinales, mais aussi qui diminue le poids des oiseaux et entrainant dans certains cas leur mort. Le recours aux antibiotiques pour prévenir cette infection, mais d’une comme facteurs de croissance est prohibé depuis 2006 en Europe, par le règlement 1831/2003/CE. Ainsi, le développement de stratégies alternatives aux antibiotiques reste un objectif louable sur les plans scientifique, industriel et sociétal. Ainsi, nous avons procédé à l’isolement et évaluation de nouvelles souches de bactéries lactiques, plus particulièrement de lactobacilles, comme flores probiotiques et potentiellement protectrices contre l’entérite nécrotique. Les bactéries lactiques sont capables de produire plusieurs molécules antagonistes comme l’acide lactique, ou encore les acides gras et phénylactique, le peroxyde d’hydrogène, le diacétyle et les bactériocines. Outre cet arsenal, les bactéries lactiques bénéficient du double statut GRAS/QPS (innocuité et sécurité des souches), et sont pour autant utilisables dans divers secteurs de la biotechnologie et de l’agroalimentaire. Les bactéries lactiques sont capables de former des biofilms et d’exercer de nombreuses fonctions biologiques de grande importante, les rendant ainsi comme microorganismes de choix pour des applications probiotiques. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets barrière et probiotique de nouvelles souches de bactéries lactiques appartenant au genre Lactobacillus, et plus particulièrement aux espèces Lactobacillus reuteri et Lb. salivarius. Ces souches ont été isolées de caeca de poulets sains élevés dans la région des Hauts-de-France. Les résultats que nous avons obtenus ont permis de mettre en évidence les activités antagonistes de ces nouvelles souches, notamment contre Clostridium perfringens; la bactérie qui est responsable de l’entérite nécrotique. Cet antagonisme est d’abord mis en évidence in vitro sur un milieu gélosé. Il est attribué à la production d’acide lactique, comme principale molécule antagoniste. Les propriétés d’agrégation, d’adhésion et de formation de biofilms de ces nouvelles souches et leur résistance aux conditions gastro-intestinales de poulets reconstituées ont également été étudiées et établies dans le cadre de cette thèse. Les souches que nous avons nouvellement isolées et sélectionnées se sont avérées être non-hémolytiques. Par ailleurs, les propriétés de résistance au procédé de lyophilisation, à la conservation ainsi que la viabilité aux conditions d’administration aux animaux ont été également élucidées. Ces critères technologiques nous ont permis d’établir la faisabilité de les produire à l’échelle avant une possible commercialisation. Les génomes des souches ayant donné des activités les plus intéressantes sur le plan de l’antagonisme et qualification probiotique ont été séquencés. Il faut noter que la validation de ces activités et plus particulièrement de l’effet anti-C. perfringens a été réalisée avec succès in vivo sur des modèles de poulets. / Here, we propose the use as probiotic novel lactic acid bacteria (LAB), mainly lactobacilli for their anti-Clostridium perfringens properties. This Gram-positive, spore-forming and harmful bacterium is responsible for necrotic enteritis in broilers. This infection is characterized by severe intestinal lesions, bird weight loss and ultimately bird death. The use of antibiotics to prevent necrotic enteritis or just as growth promotors has been banned in Europe since 2006 based on the EU regulation 1831/2003/CE. Antibiotics replacement in the animal production is expected to drive fruitful and intensive projects. In this frame, we have successfully isolated novel lactobacilli strains endowed with anti-C. perfringens activity and additional probiotic features. LAB are recognized as GRAS/QPS organisms and can offer advantages for industrial applications. In this study, LAB strains were isolated from healthy chicken caeca. These LABs, mainly those belonging to Lactobacillus reuteri and Lb. salivarius species have revealed highly capabilities to inhibit in vitro C. perfringens through lactic acid production. Besides lactic acid production, these novel strains were able to form biofilms and display high aggregation and adhesion scores. These non-hemolytic strains were also studied for their resistance to simulated gastro-intestinal conditions. Technological properties as resistance to freeze-drying process, conservation and viability were determined and allowed to shape and predict scale production of these novel LAB strains. Genomes of Lactobacilli with relevant fulfilling antagonistic activities and probiotic grade were sequenced and analyzed. To conclude this study, in vivo assays were successfully tested in challenged birds. Interestingly and remarkably, these strains allowed birds to gain weight and avoid lesions caused ascribed to C. perfringens.

Les bioréacteurs à biofilm aéré par contacteur membranaire représentent un moyen de production alternatif aux bioréacteurs aérés par bullage. Ils sont, par exemple, utilisés pour éviter la formation abondante de mousse lors de la production de lipopeptides, molécules d’intérêt aux propriétés surfactantes produites notamment par Bacillus subtilis. La maîtrise du biofilm qui se forme à l’interface gaz-liquide dans la membrane représente la clé pour optimiser les paramètres de production et préparer une montée en échelle.Dans un premier temps, le transfert d’oxygène seul est étudié dans un bioréacteur aéré par membrane à fibre creuse microporeuse. Une analyse dimensionnelle a été couplée de façon innovante à un plan d’expériences fractionnaire, réduisant considérablement le nombre d’expérience pour obtenir une relation de procédés. Les performances de transfert d’oxygène sont modélisées en fonction du débit de liquide, du volume de liquide et de la pression de gaz. Dans un second temps, l’état physiologique du biofilm et la production de surfactine sont étudiés en régime continu. La présence d’un biofilm agit comme un accélérateur de transfert d’oxygène au lieu d’une résistance. Les variations de débit de liquide, de pression de gaz, de concentrations en glucose et en oxygène ont permis de déterminer le régime de limitation en substrats, apportés en contre-diffusion, tous deux révélés comme limitants. L’augmentation du débit de liquide permet une meilleure pénétration du glucose dans le biofilm sans en augmenter la taille. L’augmentation de la concentration en oxygène conduit aux meilleurs résultats de production de surfactine atteignant 1,2 g.m-2.h-1, niveau encore jamais atteint avec d’autres types de bioréacteurs. / Membrane aerated biofilm bioreactors are a convenient alternative production way to sparged bioreactors. They are, for example, used to avoid the important foam formation during lipopeptides production, molecule of interest with tensioactif properties produced among others by Bacillus subtilis. The control of the biofilm which grows at the gaz-liquid interface in the membrane represents the key to optimise production parameters and prepare the scale-up.First, only the oxygen transfer is studied in a bioreactor aerated by a microporous hollow fiber membrane. A dimensional analysis was coupled in an innovative way with a fractional design of experiments, reducing greatly the number of experiments to obtain a process relationship. Oxygen transfer performances are modelled in function of the liquid flow rate, the liquid volume and the gas pressure. Then, the biofilm physiological condition and the surfactin production are studied in continuous state. The biofilm presence acts as an oxygen transfer booster instead of a resistance. Variations of liquid flow rate, gaz pressure, glucose and oxygen concentrations enabled to determine the substrates limitation state, brought in counter-diffusion, both revealed limiting. The increase of the flow rate enables a better glucose penetration inside the biofilm without increasing his size. The increase in oxygen concentration leads to the best results in surfactin production reaching 1,2 g.m-2.h-1, level still never reached with other bioreactors types.