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Identification de peptides antibactériens d'origine marine : Amélioration de la qualité et de la survie du naissain d'huître / Identification of marine antibacterial peptides : improving oyster spat quality and survival

Houyvet, Baptiste 13 April 2018 (has links)
Les premiers stades larvaires chez l’huitre creuse, nommée Magallana gigas, constituent une étape clé du bondéroulement du parcours zootechnique et également pour la pérennisation de la production en écloserie. Dans l’objectifde réduire les mortalités observées en écloserie, nous avons recherché de nouveaux peptides antimicrobiens. Larecherche de ces PAM a été réalisée à partir de deux organismes marins, le poisson-lion invasif en mer des caraïbes,Pterois volitans, et la seiche commune présente sur les zones ostréicoles, Sepia officinalis. La recherche de PAM a étéréalisée préférentiellement à partir de transcriptomes de novo obtenus chez ces deux animaux. Chez le poisson lion, àpartir de BLAST, 7 transcrits codant pour des PAM ont été identifiés. Quatre de ces PAM partagent de fortes homologiesde séquences (>90% d’identité) avec des PAM riches en cystéines proches de l’hepcidine, la LEAP-2, la NK-lysine et la bdéfensineidentifiées chez d’autres poissons. Les 3 autres transcrits annotés pteroicidines A, B et C codent pour despeptides apparentés aux piscidines. La présence de la b-défensine et de la pteroicidine a codée par la pteroicidine A a puêtre confirmée dans les extrait de peau du poisson lion par spectrométrie de masse. Une étude approfondie a été menéesur deux formes amidée et non amidée de la ptéroicidine a ainsi que sur plusieurs peptides de différentes tailles issusdes pteroicidines B et C. Les résultats ont permis de mettre en évidence une relation entre la structure, l’amidation et lesactivités antibactériennes et hémolytiques de ces différentes ptéroicidines. Sur le modèle Sepia officinalis, par lesapproches classiques couplant la purification et les tests antibactériens ou par des approches utilisant les BlAST, aucunPAM n’a été mis en évidence. Nous avons donc développé une approche plus originale qui repose sur le « design » depeptides à partir du transcriptome. A partir de 811 petits peptides sans cystéines issus de la base de données APD, nousavons déterminé des critères récurrents concernant la charge, l’hydrophobicité et la composition en acides aminés. Surla base de ces critères et en s’appuyant sur les outils de prédiction de CAMP, douze peptides ont fait l’objet d’une synthèse.Cinq de ces peptides ont révélé un large spectre d’activités antibactériennes. Les peptides antibactériens issus de la seicheayant une activité non hémolytique ont fait l’objet d’un transfert en écloserie. Ce transfert a été optimisé à partir d’uneétude préliminaire sur le peptide de novo K4, particulièrement actif sur les vibrios. Cette étude a mis en évidencel’importance de l’innocuité du peptide antibactérien sur les différents maillons de la chaine trophique, notamment del’huitre, et sur l’importance du stade de développement ciblé. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au devenir despeptides antibactériens de manière à s’assurer de leur biodégradabilité. L’ensemble de ces travaux a permis nonseulement d’identifier de nouveaux PAMs mais également d’apporter les premières données portant sur le potentiel del’utilisation de ces peptides comme alternative aux antibiotiques. / The first larval stages of oyster (Magallana gigas) are key steps in the smooth running of the zootechnical course and inthe sustainability of hatcheries, where mortality levels can be high. That is why we searched for new antimicrobialpeptides (AMPs) on two marine organisms, i.e. lionfish (Pterois volitans), which is invasive in the Caribbean Sea, and thecommon cuttlefish (Sepia officinalis), which is present in French oyster production areas. The search for AMPs wascarried out preferentially from de novo transcriptomes from these two animals. In lionfish, BLAST analyses allowed forthe identification of 7 transcripts encoding AMPs. Four of them shared strong sequence homology (> 90% identity) withAMPs rich in cysteines and close to hepcidin, LEAP-2, NK-lysin and b-defensin identified in other fish. The other 3transcripts, annotated pteroicidins A, B and C, coded for piscidin-related peptides. The presence of b-defensin andpteroicidin a encoded by pteroicidin A was confirmed in lionfish skin extracts by mass spectrometry. An in-depth studywas conducted on two amide and non-amide forms of pteroicidin a, as well as on several peptides of different sizesderived from pteroicidins B and C. The results highlighted a relationship between structure, amidation, and theantibacterial and hemolytic activities of these different pteroicidins. On the other hand, no AMP was highlighted in theSepia officinalis model using conventional approaches coupling purification and antibacterial tests or BLAST approaches.We therefore developed a more original approach that relies on the design of peptides starting from the transcriptome.Starting from 811 small cysteine-free peptides from the APD database, we determined recurring criteria for charge,hydrophobicity, and amino acid composition. Based on these criteria and on CAMP prediction tools, twelve peptides weresynthesized. Five of them revealed a broad spectrum of antibacterial activities. Non-hemolytic antibacterial peptidesderived from cuttlefish were transferred to the hatchery. This transfer was optimized thanks to a preliminary study onthe de novo K4 peptide, which is particularly active on vibrios. The study highlighted the importance of antibacterialpeptide safety on the various links of the trophic chain including oyster, and the importance of the targeted stage ofdevelopment. In addition, we addressed the fate of antibacterial peptides to ensure their biodegradability. Altogether,this work not only helped to identify new AMPs but also to provide the first data on the potential use of these peptidesas an alternative to antibiotics.
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La sensibilité des larves de pectinidés aux conditions d'élevage : le flux ouvert comme alternative aux mortalités massives / The susceptibility of pectinids larvae to farming conditions : open flow as an alternative to mass mortalities

Holbach, Marine 19 December 2014 (has links)
Dans de nombreux pays, l’aquaculture de pectinidés dépend aujourd’hui du succès de la production contrôlée de juvéniles. Néanmoins, les fortes variations des taux d’éclosion des oeufs et de la survie larvaire, enregistrées à ce jour, rendent cette production imprévisible. Les élevages larvaires en flux ouvert de coquilles Saint-Jacques (Pecten maximus) ont été développés en Norvège et présentent des résultats prometteurs. Malheureusement, les rendements de production encore faibles et l’impossibilité de travailler à fortes densités restent un frein majeur au développement de cette technique. En France, une technique en flux-ouvert, en petit volume (5 L), et à forte densité (≤ 300 larves mL-1) a été développée pour les ostréidés. Des expériences préliminaires visant à décliner ce système d’élevage aux larves de P. maximus se sont avérées infructueuses : retard de croissance et forte mortalité en quelques jours. Il est reconnu que les larves de pectinidés doivent faire face à des contraintes diverses en écloserie : bactériologiques, physiologiques et environnementales. Elles sont également plus sensibles que les larves des autres espèces de bivalves comme par exemple l’huître japonaise (Crassostrea gigas). Il apparait donc nécessaire aujourd’hui d’identifier plus clairement l’origine des phénomènes perturbant le bon développement des larves en flux ouvert afin d’améliorer la qualité des élevages et les rendements larvaires. Grâce à l’étude et à la compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans la lutte contre le stress des larves de P. maximus en flux ouvert, ce projet de doctorat donne des clés permettant d’améliorer cette technique d’élevage tout en limitant l’utilisation de produits chimiques en milieu contrôlé. / In many countries, aquaculture of pectinids depends on the success of artificial spat production in hatchery. This production is always unpredictable due to the variability of hatching rate and larval survival. Flow-through larval rearing systems were developed in Norway for the King scallop Pecten maximus and showed promising results. Unfortunately the system needs to be optimized since the larval yields and the densities used are still relatively low. In France, a small-scale (5 L) and high-density (≤ 300 larva mL-1) flow-through larval rearing system was successfully developed for oysters. First trials in such system and in similar conditions with P.maximus failed as we registered slower growth and high mortality rate in only a few days. It is known that pectinids larvae are more sensitive to environmental conditions than the oyster Crassostrea gigas, for example.Nowadays, it is important to identify and to understand the phenomena disturbing larval development in flowthrough system to improve larval quality and production yields. This doctoral project provided some indications how improving P. maximus flowthrough rearing system while limiting the use of antibiotic through a better understanding the physiological mechanisms involved in the larval response to a stressful environment

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