Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs nucléaires régulent l’expression des gènes importants pour le développement et l’homéostasie des cellules eucaryotes. Si certains d’entre eux sont activés par la liaison d’un ligand naturel, d’autres, comme le récepteur ERR, sont orphelins et ne possèdent pas de ligand naturel connu à ce jour. ERR se lie via son domaine DBD sur un élément de réponse ERRE au niveau des régions promotrices des gènes et son activité peut être modulée par la liaison de ligands synthétiques antagonistes. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant biochimie, biophysique et cristallographie aux rayons-X, mon travail de thèse consistait en l’étude de l’organisation structurale d’ERR pour comprendre les mécanismes d’antagonisme induits par le ligand agoniste inverse XCT-790, et la topologie qu’il adopte en interagissant avec l’ADN. Mon projet était axé sur l’étude des domaines modulaires DBD et LBD en complexe avec ADN et ligand transposée à l’étude fonctionnelle du récepteur entier. Par un important travail biochimique, j’ai mis en place les protocoles de purification de ces protéines et caractérisé biophysiquement la stabilité et la stœchiométrie des complexes avec ADN et ligand. J’ai mis en évidence que le ligand XCT-790 se lie sur chacun des monomères de LBD avec une forte affinité et que le DBD interagit avec un ERRE sous la forme d’un monomère. De multiples essais de cristallisation ont abouti à l’obtention de cristaux pour les complexes avec le LBD et le DBD ayant diffracté respectivement jusqu’à 3,5 Å et 7 Å de résolution sans néanmoins pouvoir en déterminer les structures. L’ensemble de ces résultats permettent de conclure que le DBD est monomérique sur les ERRE et IR3 et semble être dimérique sur l’élément de réponse combiné ERRE/ERE. La topologie qu’adopte ERR sur l’ADN est dictée par la liaison de ligand et serait la conséquence d’une communication allostérique entre les domaines modulaires. Ces connaissances acquises faciliteront la détermination structurale d’ERR entier par cristallographie aux rayons-X ou par cryo-microscopie électronique. / Nuclear receptors regulate expression of important genes involved in development and homeostasis in eukaryotic cells. While some of them are regulated by the binding of a natural ligand, others, like ERR, are orphan and don’t have any natural ligand identified up to now. ERR binds to ERRE response elements through its DBD on promoter regions of genes and its activity can be modulated by the binding of synthetic antagonist ligands. By an integrative structural biology approach, my thesis work consisted in the study of the structural organization of ERR to understand the antagonism mechanisms induced by the inverse agonist XCT-790, and the adopted topology upon binding to DNA. My project focused on the study of the modular domains DBD and LBD complexes with DNA and ligand and extended to the functional study of the whole receptor. Thanks to significant biochemical work, I set up the purification protocols for these proteins and characterized by biophysics the stability and stoichiometry of the DNA and ligand complexes. This work revealed that XCT-790 binds on each LBD monomer with high affinity and that the DBD interacts to an ERRE as a monomer. Many crystallization trials led to crystals for the LBD and DBD complexes that diffracted respectively up to 3.5 Å and 7 Å of resolution but no structure could be determined. These results allow to conclude that the DBD is monomeric on the ERRE and IR3 and appears to be dimeric on the combined response element ERRE/ERE. The topology adopted by ERR on DNA is guided by the ligand binding and might be the consequence for an allosteric communication between the modular domains. These results provide the basis for a future structure determination of the full ERR by X-ray crystallography and cryo electron microscopy.

La peau est la première barrière de protection de l'organisme face aux agressions de l'environnement incluant notamment les radiations UV solaires, responsables de nombreux dommages sur l'ADN. Afin de prévenir l'apparition de lésions et de maintenir l'intégrité du génome, la cellule a mis en place des systèmes de protection avec la réponse pigmentaire, et de réparation avec le mécanisme du NER (nucleotide excision repair). Le NER est un mécanisme complexe et versatile, conservé au cours de l'évolution, qui repose sur l'action coordonnée d'acteurs protéiques dont les mutations conduisent à l'apparition de syndromes d'hyper-sensibilité aux UV. Ainsi, parallèlement à la régulation transcriptionnelle UV induite dépendante du facteur USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) des gènes clés de la pigmentation, nous avons étudié l'induction transcriptionnelle potentielle de gènes codant pour les acteurs du NER. Par une approche combinant expériences in-vivo (RT-QPCR et ChIP) et in-vitro (EMSA, luciférase essais), nous impliquons le facteur USF-1 dans l'induction transcriptionnelle de gènes codant deux acteurs des étapes de reconnaissance des lésions UV-induites par le NER. L'utilisation de souris invalidées pour le gène USF-1 confirme le modèle observé. L'ensemble de ces données obtenues au cours de ma thèse vient compléter la liste des gènes cibles du facteur de transcription USF-1 et élargit son réseau d'implication en réponse aux UV. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel du facteur USF-1 dans le processus tumoral des cancers cutanés UV-induits.

Face à un environnement changeant, la cellule a dû développer des systèmes de régulation lui permettant de s’adapter et d’assurer son développement et sa survie. Ces systèmes de régulation s’organisent autour de réseaux de régulation transcriptionnelle permettant l’expression des gènes codant pour les protéines dont la cellule a besoin. Dans la plupart des réseaux trancriptionnels, la régulation de la transcription des gènes est « raffinée » par la présence de circuits de rétroaction positifs et négatifs à l’origine de deux types de comportements différents: la multistabilité d’une part, et les comportements homéostatiques ou oscillants d’autre part. Deux réseaux de régulation transcriptionnelle de complexité différente ont été étudiés au cours de cette thèse : le réseau p53-Mdm2 impliqué dans l'arrêt de la croissance cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose chez les mammifères, et le réseau de facteurs transcriptionnels GATA impliqué dans la régulation du catabolisme de l’azote chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L’analyse théorique du réseau p53-Mdm2 a eu pour principal objectif de reproduire et d’interpréter les données expérimentales disponibles dans la littérature concernant la réponse oscillante de la p53 lorsque l’ADN de la cellule est endommagé. L’analyse théorique des comportements du réseau GATA, quant à elle, a été couplée à une étude expérimentale dans les milieux de qualité intermédiaire en azote peu investigués jusqu’à présent. Pour analyser les propriétés dynamiques de ces deux réseaux, plusieurs approches complémentaires, se situant à différents niveaux de description, ont été utilisées: l’approche logique, différentielle et stochastique. La première partie de cette thèse a été consacrée à l’étude du réseau p53-Mdm2 pour lequel nous avons développé un modèle simple composé d’un circuit de rétroaction positif imbriqué dans un circuit de rétroaction négatif. Les résultats de notre analyse logique montrent que les principales propriétés dynamiques du réseau peuvent être résumées par un petit nombre de diagrammes de bifurcation logique. Ces scénarios de bifurcations diffèrent par la séquence d’activation du circuit positif et négatif composant le réseau et dépendent d’une part de l’affinité de la p53 pour ses gènes cibles et d’autre part de son activité transcriptionnelle. Nous proposons que différents stress et types cellulaires pourraient correspondre à différents scénarios de bifurcation et donc conduire à des réponses différentes après irradiation. Cette première analyse qualitative nous a permis de rendre compte de différents aspects de la dynamique du réseau observés expérimentalement, tels que le changement de fréquence des oscillations en cours de réponse, les oscillations de longue durée de la p53 ou l’amortissement rapide des oscillations à l’échelle d’une population de cellules. Pour nous affranchir des fortes non-linéarités inhérentes au traitement logique, nous avons ensuite traduit le modèle logique en un modèle différentiel et montré que les principaux comportements présentés par le modèle logique sont conservés, suggérant que la structure du réseau détermine dans une large mesure les principales potentialités dynamiques du système. L’analyse des propriétés de bifurcation du modèle différentiel en fonction du niveau de dommage à l’ADN nous a également permis de mettre en évidence la présence de deux régimes oscillants d’amplitude, de valeur moyenne et de fréquence nettement différentes, séparés par une zone de bicyclicité où ces deux régimes coexistent. Cette propriété permet d’expliquer l’existence des deux fréquences d’oscillation différentes qui ont été observées expérimentalement en fonction de la dose d’irradiation. Enfin l’analyse stochastique de notre modèle nous a, en particulier, permis de rendre compte de l’augmentation du nombre de cellules oscillant à des fréquences élevées lorsque la dose d’irradiation augmente, observée expérimentalement. La deuxième partie de notre thèse a été consacrée à l’étude du réseau de facteurs GATA chez la levure S.cerevisiae. Ce réseau, constitué des activateurs Gln3 et Nil1 et des répresseurs Dal80 et Gzf3, comporte plusieurs circuits de rétroaction positifs et négatifs interconnectés. Dans le but d’aider à comprendre le rôle et le fonctionnement du réseau GATA, nous avons effectué une analyse théorique et expérimentale de son comportement dynamique en fonction de la qualité de la source azotée. L’analyse différentielle montre la possibilité d’un comportement bistable dans les milieux de qualité intermédiaire en azote et d’oscillations amorties suite à un transfert nutritionnel d’une condition azotée à une autre, lorsque l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 est synergique ou lorsque le gène Gln3 est supprimé. Gzf3 serait le répresseur clef impliqué dans la bistabilité tandis que Dal80 serait le répresseur clef impliqué dans les comportements oscillants. L’analyse stochastique nous a permis d’étudier l’effet des fluctuations moléculaires sur ces comportements et les distributions de variables importantes du système dans une population de cellules. Pour le modèle synergique de la souche sauvage et celui du mutant gln3°, elle a montré l’existence, dans des milieux de qualité intermédiaire en azote, de deux populations de cellules qui coexistent : une population où l’expression de Dal80 est réprimée, une autre où son expression est activée. Enfin, l’étude de la dynamique du couplage entre la protéine fluorescente Gfp, sous le contrôle du promoteur de DAL80, et le réseau GATA montre que, pour des ordres de grandeur physiologique de la vitesse de disparition de la Gfp, la bimodalité présente au niveau du réseau GATA devrait se refléter au niveau de la Gfp. Les comportements bistables et oscillants mis en évidence dans notre étude théorique du réseau GATA ont ensuite été testés expérimentalement en suivant la Gfp sous le contrôle du promoteur de DAL80 en fonction de la concentration de la source azotée glutamine. Cette étude expérimentale nous a permis de mettre en évidence l’existence d’oscillations amorties de la fluorescence de la protéine de fusion Dal80-Gfp. De telles oscillations cependant n’ont pas été observées dans les expériences réalisées sur les autres souches testées pour lesquelles le gène de la Gfp est fusionné au promoteur de DAL80. Notre étude expérimentale montre également l’existence, chez la souche sauvage, d’une population unique de cellules fluorescentes quelle que soit la concentration du milieu extérieur en glutamine testé (0.2mM à 10mM). Un modèle additif où l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 n’est pas synergique serait donc en meilleur accord avec nos observations. Chez les souches où le facteur Gln3 est inactivé, par contre, deux populations cellulaires, l’une de forte fluorescence et constituée de cellules de grande taille, l’autre de plus faible fluorescence et constituée de cellules de taille plus petite, coexistent pour des concentrations intermédiaires du milieu extérieur en glutamine. La forte corrélation observée entre la taille et la fluorescence des cellules suggère que le comportement bimodal observé au niveau de la fluorescence est lié au comportement bimodal observé au niveau de la taille. Enfin, un modèle phénoménologique de la croissance cellulaire nous a permis de reproduire l’existence de deux populations cellulaires de taille distincte.

La segmentation du rhombencéphale désigne le processus de subdivision rostro-caudale du cerveau postérieur embryonnaire en 7 compartiments cellulaires, appelés rhombomères (r), qui constituent des unités de développement et d'expression génique. Le facteur de transcription à doigts à zinc Krox20 joue un rôle central dans ce processus en couplant la formation et la spécification des rhombomères 3 et 5. Trois éléments régulateurs contrôlant l'expression de Krox20 ont été caractérisés. Les éléments B et C, actifs respectivement dans r5 et r3-r5, sont impliqués dans le démarrage de l'expression de Krox20 dont l'amplification et le maintien sont ensuite assurés par l'élément autorégulateur A. L'élément C constitue donc une clé d'investigation pour élucider les mécanismes responsables de l'expression régionalisée de Krox20 dans r3. Afin de poursuivre la caractérisation du contrôle transcriptionnel de Krox20 dans r3, j'ai entrepris une analyse fonctionnelle des séquences de l'élément C par mutagénèse et mis en évidence plusieurs blocs nécessaires à son activité. J'ai également établi le répertoire transcriptomique exhaustif, quantitatif et différentiel du rhombencéphale murin en début de segmentation par RNA-Seq et j'ai pu ainsi identifier plusieurs régulateurs de l'activité de l'élément C. Enfin, j'ai réalisé l'analyse du mutant murin d'excision de l'élément C et révélé de nouvelles propriétés du contrôle transcriptionnel de Krox20, dont la coopération en cis entre les éléments A et C. Ces travaux illustrent comment la combinaison de différentes approches permet d'élucider un mécanisme de régulation transcriptionnel complexe jouant un rôle essentiel dans la spécification cellulaire

L'inactivation du chromosome X est la réponse trouvée par l'évolution pour pallier à la divergence gonosomique entre mâle (XY) et femelle (XX). Ce phénomène sert donc à mettre les deux sexes sur un pied d'égalité en limitant la quantité de transcrits provenant des chromosomes X présents dans les cellules femelles. Au cours de mon doctorat, j'ai tenté de contribuer à l'étude des mécanismes de régulation transcriptionnelle, notamment l'activation, des deux acteurs principaux de l'inactivation: Xist et Tsix, son transcrit antisens. Pendant ces 4 anne��es, j'ai entrepris de cartographier le profil de fixation de plusieurs protéines le long du locus Xist/Tsix, dans le but de comprendre les mécanismes permettant une surexpression de Xist lors de la disparition de ses facteurs répressifs en cours de différenciation. J'ai donc pu établir un modèle de régulation transcriptionnelle de l'ARN non-codant Xist, impliquant plusieurs protéines connues pour leur rôle dans la régulation transcriptionnelle (CTCF et YY1) aussi bien que dans la formation de structures tridimensionnelles (la cohésine). La pertinence de ce modèle est renforcée par nos études montrant que de nombreux aspects de ce modèle sont conservés à travers l'évolution (notamment chez l'homme). J'ai également pu contribuer à la découverte de nouveaux activateurs de Tsix, certains facteurs de pluripotence se fixant au minisatellite DxPas34 afin de réguler l'élongation de la transcription de l'antisens. Ces résultats apportent donc d'importantes informations concernant les mécanismes régulant la mise en place du phénomène d'inactivation du chromosome X au cours du développement précoce de l'embryon.

Les travaux présentés dans cette thèse s'inscrivent dans le cadre bio-informatique de l'analyse des génomes. Plus particulièrement, ces travaux concernent l'expression des gènes et les éléments régulateurs, présents dans l'ADN, qui participent à la modulation de cette expression.<br />Le problème de la recherche de ces éléments régulateurs peut être envisagé sous l'angle informatique de la recherche de motifs approchés particuliers.<br /><br />La recherche de motifs régulateurs est une question difficile du fait de la faible spécificité des motifs recherchés. Pour pouvoir y répondre, il faut prendre en compte différentes formes d'information. En particulier, il est pertinent de prendre en compte la conservation entre espèces (génomique comparative), la conservation entre séquences génomiques partageant des éléments de régulation (gènes co-régulés) ou encore, dans certains cas, la conservation spatiale des sites de fixation.<br /><br />Dans ce cadre, nous proposons une méthode permettant de tirer parti, à la fois de la conservation spatiale, et de la conservation entre espèces. Cette approche se compose d'un algorithme de recherche locale et d'évaluateurs statistiques adaptés au problème de la recherche de motifs sur-représentés localement lorsque l'environnement de recherche est hétérogène, c'est-à-dire pour des séquences pouvant provenir d'organismes différents ou de régions différentes du génome. Ces travaux ont été mis en oeuvre dans un logiciel appelé TFM-Explorer, que nous avons évalué avec succès sur des données issues du génome humain, de la souris et du rat.

Les régulateurs de croissance et facteurs environnementaux régulent le développement et la croissance des plantes, ce qui affecte la biomasse et le rendement des cultures. Un déterminant important de la biomasse est l'étendue de la ramification, c'est-à-dire l'élongation des branches latérales. Les strigolactones (SL), des régulateurs de croissance dérivés de caroténoïdes et produits de la voie MORE AXILLARY BRANCHING (MAX), sont des régulateurs négatifs du développement des bourgeons axillaires. Les gènes AtMAX1 à AtMAX4 chez Arabidopsis codent pour des protéines impliquées dans la synthèse et la régulation de ces molécules. Parallèlement, une autre protéine, nommée BRANCHED1 (BRC1), est impliquée dans l'arrêt du développement des bourgeons, et il a été suggéré que son action se trouvait en aval de la voie MAX. D'autre part, une étude récente a démontré que l'expression constitutive du gène TRITICUM AESTIVUM VERNALIZATION1 (TaVRN1) du blé chez Arabidopsis affecte la ramification. Ce gène code pour un facteur de transcription à boîte MADS (MADS-box). TaVRN1 se lie à des motifs CArG de la région promotrice de AtMAX4, et provoque une augmentation de l'expression de AtMAX4. TaVRN1 fait partie du clade APETALA1/SQUAMOSA, tout comme les gènes APETALA1 (AtAP1), FRUITFUL (AtFUL) et CAULIFLOWER (AtCAL) chez la plante-modèle Arabidopsis thaliana, toutefois seul le membre AtAP1 de ce clade est surexprimé en présence de TaVRN1. Dans ce travail, nous avons procédé à une analyse détaillée des régions promotrices des gènes AtBRC1, AtMAX2 et AtMAX4, ainsi que du gène codant pour le MADS-box AtAP1. Cette analyse nous a permis d'identifier de nombreux éléments de régulation situés dans la région proximale des promoteurs (800 pb), dont des motifs CArG et CArG consensus chez AtBRC1 et AtMAX4 auxquels nous avons porté une attention particulière. Des analyses de gels de retardement effectuées avec des sondes contenant ces CArG et avec les protéines recombinantes AtAP1, AtFUL, et TaVRN1 (comme contrôle) indiquent qu'AtAP1 et TaVRN1 ont la capacité de se lier aux différents motifs CArG et CArG consensus des gènes AtAP1, AtBRC1 et AtMAX4. Ceci suggère qu'AtAP1 est un orthologue de TaVRN1 chez Arabidopsis. Nos résultats suggèrent aussi qu'AtAP1 est un FT MADS ayant la capacité de s'autoréguler et de moduler l'expression des gènes AtMAX4 et AtBRC1. Ces gènes étant impliqués dans le développement des branches latérales, ceci suggère que la dominance apicale est un phénomène qui dépend de facteurs de régulation MADS et plus spécifiquement d'AtAP1. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Arabidopsis thaliana, APETALA1, bourgeons axillaires, BRANCHED1, branches latérales, croissance, développement, dominance apicale, MADS, MAX, motif CArG

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s'accompagne de l'inactivation transcriptionnelle d'un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l'expression mono-allélique de l'ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d'inactivation du chromosome X (Xic) - tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d'appréhender le paysage structural dans lequel s'exerce cette régulation. La caractérisation de l'architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), m'a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu'au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5' respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l'architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l'intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L'existence de ces domaines d'interaction s'intègre avec d'autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l'association à la lamine nucléaire, mais n'apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j'ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j'ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l'environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l'orée de l'activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l'échelle de la population cellulaire d'une part et de la fibre de chromatine unique d'autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s'inscrit le contrôle de l'activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l'organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

Le virus de la maladie de Marek (GaHV-2), est un α-herpèsvirus induisant des lymphomes T chez le poulet. L’étude de la protéine IE ICP22 a montré que cette protéine est principalement asssociée à la phase lytique du cycle viral avec une localisation majoritairement cytoplasmique. Nos résultats montrent que cette protéine réprime la transcription des promoteurs viraux. Par ailleurs, nous avons montré que la protéine était produite à la fois à partir de deux transcrit, un transcrit monocistronique et un transcrit bicistronique de façon majoritaire. La transcription d’ICP22 est pilotée par un promoteur unique dont nous avons localisé le « core » promoteur dans les 200 nt en amont du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le promoteur du gène ICP22 était faiblement soumis au mécanisme de méthylation. Ce promoteur peut être régulé par la protéine virale ICP4 connue pour être un transactivateur majeur au sein des alphaherpèsvirus. Enfin, nous avons mis en évidence qu’ICP22 était la cible de 3 miR viraux parmi lesquels la cible prédite pour le mdv1-miR-M1 et mdv1-miR-M5-3p entraînaient une diminution du taux du transcrit. / Marek’s disease virus (GaHV-2) is an α-herpesvirus that induces T-cell lymphoma in chickens. The study of the IE ICP22 protein showed that this protein is mainly associated to the lytic phase of the viral cycle viral with a cytoplasmic localization. Our results showed that this protein represses the transcription of the viral promoters. ICP22 protein is produced from two transcript, a monocistronic and a bicistronic. The transcription of ICP22 is drived by a unique promoter whose "core" promoter was located in the 200 nt upstream to the gene. In our study, we showed that ICP22 promoter was weakly subjected to régulation by methylation. This promoter is regulated by the viral protein ICP4 known to be a major transactivateur within alphaherpèsvirus. Finally, we highlighted that ICP22 was the target of 3 miR viral among which the target predicted for mdv1-miR-M1 and mdv1-miR-M5-3p decreased the rate of the ICP22 transcripts.