On a montré que les PTM jouaient un rôle significatif de P. falciparum dans l'année de contrôle de la régulation transcriptionnelle, de l'expression monoaléique et de la différenciation sexuelle. Dix SET contenant des HKMTs contenant du domaine-ont été prédits; Six d'entre eux être essentiels pour le développement de stages de sang asexués. Le projet de thèse est centré sur la caractérisation biologique de PfSET7 et PfSET6. Nous avons observé l'échange de localisation cellulaire dynamique Pendant le cycle de vie: PfSET7 se trouvent dans de multiples foyers cytoplasmiques dans les stades érythrocytaires asexués et le stage de foie, et plus frappante, dans la membrane du parasite enrichie en gamétocytes. PfSET6 EXPOSÉ une localisation nucléaire dans les anneaux et un modèle ponctué dans le cytoplasme des trophozoites matures et schizontes, et est enrichi dans les structures de foyers dans le cytoplasme des gamétocytes. Pris ensemble, notre étude suggère que la méthylation non histone est beaucoup plus significative chez P. falciparum que précédemment attendu. La méthylation à médiation par PfSET7 Peut être une extension du code histone à - d'autres protéines cytosoliques; Partiellement PfSET6 s'associe à des voies de répression transcriptionnelle dans le noyau et des régulateurs post-transcriptionnels dans le cytoplasme. Une étude plus approfondie vise à identifier des cibles de domaine SET contenant des protéines dans le gène inducible knockout mutant parasite lignes. Le fait que PfSET7 et PfSET6 sont exprimés à différents stades du cycle de vie, les fait comme de nouvelles cibles pour le développement de médicaments contre cette maladie grave et de bloquer la transmission. / In P. falciparum, PTMs have been shown to play an important role in the control of transcriptional regulation, monoallelic expression, and sexual differentiation. Ten SET domain-containing HKMTs have been predicted; six of them appear to be essential for asexual blood stage development. My lab has expressed and purified two enzymatically active recombinant methyltransferase PfSET7 and PfSET6. In vitro enzyme kinetics assays shows they can methylate histones. The dissertation project is centered around the biological characterization of PfSET7 and PfSET6. We observed the dynamic changes of cellular localization during life cycle: PfSET7 are found in multiple cytoplasmic foci in asexual erythrocytic stages and liver stage, and more strikingly, enriched in parasite membrane in gametocytes. PfSET6 exhibited a nuclear localization in rings and a punctuated pattern in the cytoplasm of mature trophozoites and schizonts, and is enriched within foci-like structures in the cytoplasm of gametocytes. Taken together, our study suggests that non-histone methylation is much more important in P. falciparum than previously anticipated. PfSET7-mediated methylation may be an extension of the histone code to other cytosol proteins; PfSET6 partially associates with transcriptional repression pathways in the nucleus and post-transcriptional regulators in the cytoplasm. Further study aims to identify targets of SET domain containing proteins within the inducible gene knock out mutant parasite lines. The fact that PfSET7 and PfSET6 are expressed in different life cycle stages, makes them as novel targets for drug development that could against severe disease and to block pathogen transmission.

Des données suggéraient que le facteur de transcription ZNF143 régule l’expression de milliers de gènes mais très peu d’informations étaient disponibles sur les gènes cibles, réseaux de gènes, processus biologiques et mécanismes impliquant ZNF143. Pour mon travail de thèse je me suis intéressé au potentiel régulateur de ce facteur en particulier chez l’homme. Mon projet de recherche a premièrement consisté à identifier toutes les cibles génomiques de ZFN143 puis à caractériser fonctionnellement cet interactome. Les résultats obtenus ont permis d’identifier plus de 3000 gènes cibles de ZNF143, principalement impliqués dans des processus liés à la croissance cellulaire. Mes travaux ont aussi permis de mettre à jour de nouveaux mécanismes de régulation impliquant ce facteur. En effet, nous avons démontré que les facteurs de transcription ZNF143, THAP11 et Notch1 modulent l’expression d’un répertoire commun de gènes via des sites de liaison à l’ADN chevauchant. Nous avons aussi montré que ZNF143 joue un rôle essentiel dans l’expression des gènes dirigés par des promoteurs bidirectionnels et qu’il est aussi impliqué dans une boucle d’autorégulation transcriptionnelle de son expression. / Numerous data were suggesting that the transcription factor ZNF143 regulates the expression of thousand of genes. However, nothing was known about the genome wide regulatory networks, biological processes and transcriptional mechanisms involving this factor.For my PhD thesis I was interested in exploring the regulatory potential of the ZNF143 transcription factor in human. The goal of my project was to identify all the genomic targets of this factor and functionally characterize this ZNF143-DNA interactome. The results I obtained allowed us to identify more than 3000 genes targeted by ZNF143, mainly involved in biological processes linked to cell proliferation. My work also led us to discover new transcriptional mechanisms involving ZNF143. We demonstrated that the transcription factors ZNF143, THAP11 and Notch1 modulate the expression of a common set f gene via overlapping DNA binding sites. Moreover, we also showed that ZNF143 in essential for the divergent expression of genes from bidirectional promoters and that its expression is regulated through auto-regulatory feedback loop.

La variabilité du système protéolytique de surface a été étudiée chez 30 souches de St. thermophilus. Cette variabilité consiste en la présence ou l’absence du gène prtS, en la présence de deux allèles différents de ce gène, en la présence d'une protéase PrtS ancrée et/ou soluble et enfin en l'expression variable, due à une variabilité de la régulation du système protéolytique, du gène prtS et d'autres gènes qui interviennent, pour la plupart, dans le métabolisme azoté. L’expression des gènes prtS, pepX, pepC, pepN, amiA1CDEF, dtpT, livJHMGF, ilvC, ilvDBN, bcaT, ackA, ldh, codY et relA a été quantifiée chez les souches PB302 et PB18O en lait et en milieu M17. La souche PB302 est représentative des souches qui se développent rapidement en lait alors que la souche PB18O l’est de celles qui ont une croissance intermédiaire dans ce milieu. Alors que l’expression des gènes étudiés est peu différente en milieu M17 où les deux souches ont une croissance similaire, cette expression diverge lorsque les deux souches sont cultivées en lait.Globalement, la différence de croissance observée en lait entre les deux souches pourrait résulter d'une variabilité de la capacité protéolytique et de l’expression, entre autres, des gènes codant PrtS, le régulateur CodY, les transporteurs des oligopeptides (Ami), des di-tripeptides (DtpT) et des acides aminés ramifiés (LivJ) et de ceux codant des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse des acides aminés ramifiés (IlvC, IlvB et BcaT), ces derniers étant nécessaires pour la croissance en lait. Tous ces gènes possèdent en amont de leur promoteur une boîte CodY potentielle et pourraient donc appartenir au régulon CodY / The variability of the cell envelope-associated proteolytic system was studied in 30 strains of St. thermophilus. Variations in strains consist in the presence or absence of the gene prtS, the presence of two allelic forms of prtS, the presence of an anchored and/or soluble form of the protease PrtS and in the variable expression of the gene prtS and other genes involved mainly in nitrogen metabolism, thus in the variability of the regulation genetic of this system. Expression of the genes prtS, pepX, pepC, pepN, amiA1CDEF, dtpT, livJHMGF, ilvC, ilvDBN, bcaT, ackA, ldh, codY and relA was quantified in the PB302 and PB18O strains. The strain PB302 is representative of strains which exhibit a rapid growth in milk. The strain PB18O is representative those with intermediate growth in milk. In M17 medium, where both strains have similar growth, little difference in the expression of genes tested was observed. Conversely, the two strains did not express the selected genes in the same way when grown in milk. Overall, the difference in growth observed between strains in milk could result from variable proteolytic activities and variable expression of genes encoding, for example, the proteinase PrtS, the regulator CodY, transporters of oligo- or di-tri- peptides (Ami or DtpT) or branched chain amino acids, or BCAA (LivJ) and enzymes in the biosynthetic pathway of BCAA (IlvC, IlvB et BcaT) which are necessary for growth in milk. All these genes have a potential CodY box at the upstream of their promoter and could therefore belong to the regulon CodY

La méthylation et déméthylation de l'ADN jouent un rôle majeur dans la stabilité des génomes, l'empreinte génomique, la paramutation et le développement. En revanche, le rôle de cette régulation épigénétique a été peu étudiée dans les interactions hôtes-pathogènes. Dans ce projet de thèse, nous avons tout d'abord montré que la méthylation de l'ADN régule négativement la résistance d'Arabidopsis thaliana à une souche de Pseudomonas syringae pathogène. Nous avons également identifié un grand nombre de gènes de l'immunité ciblés directement par la méthylation de l'ADN dirigée par petits ARN dans leurs régions promotrices. Nous proposons que cette régulation génique permettrait de maintenir une faible expression basale de ces gènes et d'éviter ainsi des effets délétères qui seraient causés par une expression constitutive de la réponse immunitaire. De plus, nous montrons que la déméthylase active REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) facilite l'activation transcriptionnelle de gènes de l'immunité en laissant potentiellement des éléments de régulation en cis accessibles à des facteurs de transcription. Nous avons également démontré que ce facteur contribue à la résistance à P. syringae chez Arabidopsis, caractérisant ainsi la première déméthylase eucaryote dans la résistance antibactérienne. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la méthylation de l'ADN maintient une faible expression basale de gènes de l'immunité en absence de pathogène, tandis que la déméthylation active assure une induction rapide de ces gènes au cours de la réponse immunitaire en favorisant potentiellement le recrutement de facteurs de transcription sur la chromatine. / DNA methylation and demethylation are regulatory processes involved in genome stability, genomic imprinting, paramutation and development. Until recently, very little was known about the role of these epigenetic processes in plant disease resistance and in the transcriptional control of immune-responsive genes. Here we provide evidence that DNA methylation negatively regulates antibacterial resistance against a virulent Pseudomonas syringae strain in Arabidopsis. Accordingly, we have identified a subset of defense genes that are targeted and repressed by RNA-directed DNA methylation (RdDM), presumably to prevent trade-off effects that would be caused by their constitutive expression and/or sustained induction. In addition, we found that the active DNA demethylase facilitates the transcriptional activation of some of these defense genes by pruning DNA methylation at their promoter regions and leaving cis-elements accessible for transcription factor binding. In addition, we show that the active demethylase REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) positively regulates late immune responses including Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP)-triggered callose deposition and salicylic acid (SA)-dependent defense response. We also demonstrate that ROS1 restricts Pto DC3000 propagation in Arabidopsis leaf secondary veins, providing the first example for a role of an active DNA demethylase in antibacterial resistance. Based on these findings we propose that DNA methylation maintains a low basal expression of some immune-responsive genes in normal growth condition, while active DNA demethylation ensures a rapid and pervasive induction of these genes upon bacterial pathogen detection.

Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été identifié en 1989. Vingt-cinq ans après, les mécanismes contrôlant sa fine expression, sont encore mal compris. Bien qu’environ 1980 mutations aient été découvertes, il reste des patients pour qui le génotype n’a pas été établi. Les éléments de régulation, décrits au sein du promoteur, ne peuvent à eux seuls expliquer cette complexe régulation tissu spécifique. Des éléments de régulation à distance, en cis ou en trans, sont certainement impliqués dans ce contrôle d’expression. L’objectif de ce projet est de mieux décrypter les mécanismes de régulation à distance du gène CFTR en identifiant des séquences régulatrices éloignées, mais pouvant, par des mécanismes de repliement, interagir spécifiquement avec celui-ci. Afin d’étudier ces contacts chromosomiques, nous avons, dans un premier temps, mis au point la technique de Capture de Conformation Chromosomique (3C). Suite à cette technique, nous sommes passés à une approche à plus grande échelle, la technique de Copie Conforme de 3C (5C), qui permet de mesurer des milliers d’interactions chromatiniennes en une analyse. L’organisation spatiale d’une région d’environ 790 kb recouvrant le gène CFTR, a été analysée dans des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, exprimant le gène CFTR et des fibroblastes de peau, ne l’exprimant pas ou très peu. Les interactions entre les régions de ce locus et le promoteur CFTR ont été étudiées par séquençage nouvelle génération sur Ion PGM™. Nous avons comparé ces conformations chromatiniennes afin d’identifier des éléments de régulation spécifiques d’une expression de CFTR. Notre approche a été validée par l’identification de régions régulatrices précédemment décrites. De plus, nous avons mis en évidence de nouveaux contacts chromatiniens avec le promoteur CFTR. Ces régions semblent fortement impliquées dans la régulation de l’expression du gène CFTR. Grâce à la technique 3C et ses variantes, l’identification de nouvelles mutations à distance du gène pourraient expliquer des dérégulations de son expression. / The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene was identified in 1989. Twenty five years later, the regulatory mechanisms controlling its complex expression are still not fully understood. Although, almost 1980 mutations have been identified, many cases of cystic fibrosis or CFTR Related Disorders remain still of unknown origin. The promoter which binds transcription factors and drives some aspects of CFTR gene expression, cannot alone account for tissue specific control. This implicates other distal cis- or trans-acting elements in cell-type-specific regulation of CFTR expression. The aim of our project is to study long-range regulatory elements of the CFTR gene, which could interact specifically with the CFTR promoter by tri-dimensional folding mechanism. We first developed the Chromosome Conformation Captures (3C) approach to map these chromosomal contacts. Subsequently, we enhanced our analyses with a high-throughput adaptation of 3C: the 3C-Carbon Copy (5C) technology. This approach allows the analysis of millions chromatin interactions. Thus, we have analyzed the spatial organization of a ～790kb region, comprising the CFTR gene, in primary nasal epithelial cells, which express the gene, and primary skin fibroblasts, which do not express the gene. Interactions between this locus and the CFTR promoter have been analysed by next generation sequencing with the Ion PGM™. We have compared chromatin conformation in order to identify uncharacterized regulatory elements that act especially in CFTR-expressing cells. Our approach has been validated by the identification of previously characterized regulatory elements. Moreover, we identify novel chromatin contacts of the CFTR promoter with chromosomal regions, which could potentially be involved in CFTR gene expression regulation. Thanks to 3C and 3C-derivated analyses, we could identify new possible mutations far from the gene, which may lead to its dysfunction by modifying the chromatin conformation or regulatory elements.

Chez les Archaea, tous les processus informationnels, transcription incluse, sont effectués par des protéines proches de celles des Eukarya. Alors que la machinerie transcriptionnelle des archées a été bien caractérisée structurellement et fonctionnellement, très peu d'informations sont disponibles sur la régulation de son activité. En travaillant à la fois avec des modèles cellulaires (crénarchée hyperthermophile Sulfolobus islandicus) et viraux, nous avons pu réaliser une étude approfondie de trois régulateurs transcriptionnels et mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez les archées. Au cours de cette thèse, deux régulateurs viraux, SvtR et AFV1p06, et un régulateur cellulaire, Sta1, ont été étudiés. Concernant SvtR, codé par le virus SIRV1 qui infecte S. islandicus, nous avons poursuivi la recherche précédente, qui avait permis de déterminer sa structure et sa fonction, en nous focalisant sur la caractérisation de l'ensemble de ses cibles dans le génome viral et sur l'étude de son mécanisme d'action. Pour cela, la séquence du site consensus reconnu par SvtR a été établie à l'aide de la mutagénèse systématique d'un de ses sites déjà caractérisés. Ce site est présent dans les promoteurs de dix gènes de SIRV1 montrant que SvtR pourrait réguler l'activité de plus de 20% des gènes viraux. Ses cibles incluent tous les gènes codant pour les protéines de la capside virale. L'analyse fonctionnelle réalisée sur une partie des sites de liaison de SvtR a permis de démontrer qu'il s'agit d'un régulateur polyvalent agissant, selon la cible, en tant que activateur ou répresseur transcriptionnel. En prenant comme modèle le promoteur du gène gp30, nous avons pu démontrer par plusieurs approches que la régulation de ce promoteur inclut la polymérisation de la protéine depuis son site de liaison principal jusqu’à la TATA-box du promoteur. Il s’agit d’un mécanisme de régulation de transcription à distance original et inédit chez les archées. La structure de l’autre régulateur viral étudié, AFV1p06, codé par le virus AFV1 qui infecte Acidianus hospitalis, révèle la présence au sein de cette protéine d’un domaine en doigt de zinc C2H2, considéré jusqu’à présent comme spécifique des eucaryotes. Nous avons démontré la capacité d’AFV1p06 à se lier à l’ADN avec une préférence pour les régions riches en GC. AFV1p06 est la première DNA binding protéine d’archées de ce type caractérisée in vitro. Le troisième régulateur transcriptionnel, Sta1, est codé par le génome des Sulfolobales. Il est capable d’activer la transcription de gènes viraux, ainsi que du gène chromosomique radA en réponse à un dommage à l’ADN. Pour comprendre son rôle dans la cellule, nous avons tenté de réaliser, sans succès, un mutant knock-out du gène sta1 de S. islandicus RYE15A, ce qui indique que le gène sta1 serait un gène essentiel. L’étude de l’interaction hôte-virus sur le modèle S. islandicus LAL14/1 est un des sujets principaux de notre laboratoire. Le séquençage du génome de cette souche a ouvert la voie pour établir un système génétique. Plusieurs mutants KO de LAL14/1 (pyrEF-; ΔCRISPR1) ont été construits. L’impossibilité d’inactiver un autre gène candidat, topR2, codant pour une réverse gyrase, indique qu’il s’agit d’un gène essentiel. La construction du mutant ΔCRISPR1 est la première étape pour obtenir un dérivé de LAL14/1 dépourvu de système CRISPR, un mutant très utile pour mieux comprendre l’implication des CRISPRs dans le phénotype de résistance de LA14/1 au virus SIRV1 et leur rôle chez les archées en général. L’ensemble des résultats de cette thèse contribue à la meilleure compréhension du fonctionnement moléculaire chez les archées et leurs virus. / In Archaea cells all information processes, including transcription, are performed by the Eukarya-like proteins. While the transcriptional machinery of archaea has been well characterized structurally and functionally, very few information concerning the regulation of its activity is available. By working with both cell (crenarchaeota Sulfolobus islandicus) and viral models, we have performed an in-depth study of three transcriptional regulators: two viral regulators, SvtR and AFV1p06, and a cell regulator Sta1. The obtained results allow to better understand the mechanisms of transcriptional regulation in archaea. Concerning the protein SvtR encoded by the virus SIRV1 that infects S. islandicus, we continued the research project that had identified its structure and function. We were focused on identification and characterization of all of SvtR targets in the viral genome and on the study of the mechanisms of regulation. For this purpose, we established the sequence of consensus site recognized by SvtR using systematic mutagenesis of one of its previously characterized binding sites. This site is present in the promoters of 10 genes meaning that SvtR may regulate the activity of more than 20% of SIRV1 genes. Its targets include all known genes encoding proteins of the viral capsid. Functional analysis of SvtR has demonstrated that, according to the target, this protein is a versatile regulator acting as transcriptional activator or repressor. Taking as a model the gp30 gene promoter, we demonstrated by several approaches that regulation of this promoter includes the polymerization of the protein from its primary binding site towards the TATA-box. Such a mechanism of transcriptional regulation is new in archaea. Second, we performed a structural analysis of the protein AFV1p06 encoded by the virus AFV1 which infects Acidianus hospitalis. The structural analysis of AFV1p06 revealed the presence of a C2H2 zinc finger domain regarded hitherto as specific to eukaryotes. We demonstrated that AFV1p06 has ability to bind specifically to DNA sequences rich in GC. AFV1p06 is the first archaeal DNA binding protein with zinc finger domain characterized in vitro. The third transcriptional regulator, Sta1 is encoded by the genome of Sulfolobales. The protein RadA is able to activate the transcription of viral as well as chromosomal genes in response to DNA damage. To understand its role in the cell, we attempted, without success, to knockout the sta1 gene in S. islandicus RYE15A. This result indicates that the sta1 gene is probably essential. The strain S. islandicus LAL14 /1 is a model strain to study host-virus interaction in archaea. The sequencing of the genome of this strain opened the way to establish a genetic system for this model and allowed us to construct knockout mutants for several LAL14/1 genes (pyrEF-; ΔCRISPR1). Our unsuccessful attempts to inactivate topR2, another candidate gene encoding reverse gyrase indicate that topR2 function could be essential. The construction of the ΔCRISPR1 mutant opens the way to obtain a derivative of LAL14/1 entirely lacking the CRISPR system. Such a mutant will be very useful for the future studies of function and role of CRISPRs in archaea in general but also will allow to verify the hypothesis of involvement of CRISPRs in the phenotype of resistance of LA14/1 to SIRV1. All the results of this thesis contribute to an improved understanding of molecular mechanisms in archaeal cells and their viruses.

Le contrôle du cycle cellulaire, processus fondamental pour la prolifération cellulaire, est souvent altéré au cours de la tumorigenèse. Les facteurs de transcription E2Fs sont des régulateurs majeurs de l'expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire, la réplication de l'ADN, la mort cellulaire programmée ou encore la différenciation cellulaire. La famille des facteurs E2Fs contient des membres qui agissent comme activateurs ou répresseurs de la transcription et dont l'activité est régulée par un grand nombre de corégulateurs transcriptionnels, incluant notamment les protéines à poche pRb, p107, p130. RIP140 (Receptor Interacting Protein of 140kDa) a été identifié comme un corépresseur de nombreux récepteurs nucléaires, une autre grande famille de facteurs de transcription qui, pour certains, régulent positivement l'expression du gène RIP140.Ce travail de thèse a permis d'identifier RIP140 comme un nouveau répresseur de l'activité transcriptionnelle du facteur E2F1, dans des expériences de transfection transitoire ainsi que sur l'expression de gènes endogènes. Nous avons également montré que l'expression ectopique de RIP140 bloque la progression des cellules dans le cycle cellulaire. Dans les cancers du sein, le niveau d'expression de RIP140 présente une corrélation inverse avec celui de différents gènes cibles des facteurs E2Fs et semble discriminer les tumeurs luminales des tumeurs basales. Nous avons également démontré que le niveau d'ARNm RIP140 est régulé au cours du cycle cellulaire et que le promoteur du gène RIP140 est une cible directe des facteurs E2Fs. Cette régulation implique des sites de liaison des facteurs E2Fs et Sp1 de la région proximale du promoteur. La régulation de ce gène par E2F1 a également été observée au cours du processus de différenciation adipocytaire en utilisant un modèle murin E2F1-/-.En conclusion, ce travail a permis d'identifier RIP140 comme un nouvel acteur de la voie de signalisation par les facteurs E2Fs. / Cell cycle control, a fundamental process which controls cell proliferation, is frequently altered during tumorigenesis. The E2F transcription factors are central regulators of target gene expression involved in cell cycle regulation, DNA replication, apoptosis and differentiation. The E2F transcription factors family encompasses members which act as activators or repressors. Their activities are regulated by a large number of transcriptional coregulators, including in particular the pocket proteins pRb, p107, p130.The transcription coregulator RIP140 (Receptor Interacting Protein of 140kDa) has been identified as a partner of numerous nuclear receptors, another important transcription factor family. Some of these nuclear receptors positively regulate RIP140 gene expression.This work identified RIP140 as a new repressor of E2F1 transcriptional activity, both in transient transfection experiments and on the expression of endogenous target genes. We also showed that ectopic expression of RIP140 blocks cell cycle progression. In breast cancers, the level of RIP140 expression is inversely correlated with various target genes of E2Fs factors and seems to discriminate luminal from basal tumors. We also demonstrated that the RIP140 mRNA expression is regulated during cell cycle and that the RIP140 promoter is a direct target of E2F transcription factors. This regulation involves both E2F and Sp1 binding sites in the proximal region of the RIP140 promoter. The regulation of the RIP140 gene by E2F1 was also observed during adipocyte differentiation using an E2F1-/- mouse model.In conclusion, this study identified RIP140 as a new regulator of the E2F signalling pathway and as a novel E2F1 target gene. These results open new perspectives concerning the roles that this transcriptional coregulator might play in the control of cell proliferation and tumorigenesis.

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote. / The atmosphere of the Earth is very rich in nitrogen (N2). However, diatomic nitrogen is very stable and therefore unusable by the majority of life forms even though it is necessary for the synthesis of a variety of organic compounds. Only diazotrophic procaryotes are capable of using N2 as nitrogen source. Their nitrogen fixation allows the production of aminated compounds from atmospheric nitrogen (78 %). However, this process is very complex and requires the biosynthesis of about twenty proteins and the consumption of a lot of energy (16 molecules of ATP per molecule of N2 fixed), thus necessitating its tight regulation. The purple non-sulfur photosynthetic bacteria are known for their ability to carry out nitrogen fixation. Studies conducted in the light, the preferred mode of growth of these bacteria (anaerobic photosynthetic), have shown that nitrogenase (the enzyme responsible for dinitrogen fixation) is subject to regulation at three levels: transcriptional regulation of NifA (activator protein for the transcription of nif genes), posttranslational regulation of the activity of NifA to activate nif gene transcription, and posttranslational regulation of nitrogenase activity when cells are subjected to an ammonium shock. The control system already described involves essentially a membrane protein, AmtB and both PII proteins, GlnK and GlnB. It has long been known that nitrogenase is regulated when light is suddenly removed from a culture, but until now it is unclear whether these systems are also involved in the regulation of nitrogen fixation in dark. Thus, one outstanding question is what are the proteins involved in the inactivation of nitrogenase when a light-grown culture is placed in the dark? An analysis of several mutant strains; amtB-, glnK-, glnB-, and amtY- under different conditions of nitrogen deficiency was used to address this question. Using measurements of nitrogenase activity and Fe protein modification by Western blotting, we were able to show that darkness causes a "switch-off” of nitrogenase due to ADP- ribosylation of Fe protein. Thus, the system that has already been described as involved in the response to a lack of ammonia, is also required for a response to a lack of light or energy (AmtB, GlnK, GlnB, DraG, and DraT, and AmtY). However, Rhodobacter capsulatus is also able to fix nitrogen and grow micro-aerobically in the dark as well as photosynthetically under anaerobic conditions, but so far its regulation in the dark has been little studied. The study of nitrogen fixation in the dark allowed us to show that the Rnf membrane complex is not required for growth of R. capsulatus in such conditions. In order to develop a way to study its regulation during this growth mode, we have attempted to identify the operating conditions (O2, [NH4+]), allowing R. capsulatus to fix nitrogen micro-aerobically. The optimization of this conditions has shown that the optimal concentration of oxygen required is 10% mixed with nitrogen.

De récents travaux ont mis en évidence une production accrue de Perlecan au stade terminal de l’arthrose ou ostéoarthrite (OA). L’équipe du Dr Moreau a mis en évidence qu’il y a une perte d’expression du facteur de transcription Pitx1 dans l’arthrose et que ce dernier pourrait agir comme un régulateur négatif du gène HSPG2 codant pour le Perlecan. Afin d’étudier la régulation transcriptionnelle de ce gène, des fragments du promoteur proximal ont été clonés en amont du gène rapporteur luciférase et testés en transfections transitoires. Des co-transfections avec des quantités variables de pSI-mPitx1 et avec des constructions comportant des fragments de différentes régions du promoteur mHSPG2 (jusqu’à 3926 pbs en amont de l’ATG) ont démontrées une activité transcriptionnelle et une stimulation de cette activité en présence de Pitx1, avec des résultats variables selon les types cellulaires. Parallèlement, des expériences en qPCR effectuées sur des ostéoblastes dérivés de souris transgéniques surexprimant Pitx1 ont aussi démontré qu’une surexpression de Pitx1 corrèle avec une augmentation de l’expression de p53, une cible connue de Pitx1, et de Perlecan. Le lien qui existe entre Pitx1 et Perlecan est encore très méconnu et la cascade régulatrice impliquant ces deux acteurs n’est pas encore établie. Une meilleure connaissance des mécanismes qui régulent la transcription normale et pathologique du gène HSPG2 permettrait sans aucun doute une avancée dans la compréhension du développement et du rôle possible de Perlecan dans la progression de l’ostéoarthrite. / Recent work has shown an increase of Perlecan production associated with the terminal stage of osteoarthritis (OA). Dr Moreau’s team demonstrated a loss of expression of the transcription factor Pitx1 in osteoarthritis suggesting its putative role as a negative regulator of the HSPG2 gene coding for Perlecan. To study the transcriptional regulation of this gene, promoter fragments were cloned upstream of a luciferase reporter gene and tested in transient transfection assays. Co-transfections with variable quantities of pSI-mPitx1 and with constructs made with fragments of different lengths of the mHSPG2 promoter demonstrated a transcriptional activity and enhancement of this activity in presence of Pitx1, with variable results depending on cell types. In addition, expression analysis by qPCR on transgenic mice osteoblasts that overexpress Pitx1 showed that the overexpression of Pitx1 correlates with an augmentation of p53, a known Pitx1 target and Perlecan expression. The link between Pitx1 and Perlecan is still poorly understood and a clear pathway involving those two players is not yet established. A better understanding of mechanisms regulating normal and pathological transcription of the HSPG2 gene encoding for Perlecan would allow a better comprehension of osteoarthritis development and the putative role of Perlecan in its progression.

La famille des gènes Hox code pour des facteurs de transcription connus pour leur contribution essentielle à l’élaboration de l’architecture du corps et ce, au sein de tout le règne animal. Au cours de l’évolution chez les vertébrés, les gènes Hox ont été redéfinis pour générer toute une variété de nouveaux tissus/organes. Souvent, cette diversification s’est effectuée via des changements quant au contrôle transcriptionnel des gènes Hox. Chez les mammifères, la fonction de Hoxa13 n’est pas restreinte qu’à l’embryon même, mais s’avère également essentielle pour le développement de la vascularisation fœtale au sein du labyrinthe placentaire, suggérant ainsi que sa fonction au sein de cette structure aurait accompagné l’émergence des espèces placentaires. Au chapitre 2, nous mettons en lumière le recrutement de deux autres gènes Hoxa, soient Hoxa10 et Hoxa11, au compartiment extra-embryonnaire. Nous démontrons que l’expression de Hoxa10, Hoxa11 et Hoxa13 est requise au sein de l’allantoïde, précurseur du cordon ombilical et du système vasculaire fœtal au sein du labyrinthe placentaire. De façon intéressante, nous avons découvert que l’expression des gènes Hoxa10-13 dans l’allantoïde n’est pas restreinte qu’aux mammifères placentaires, mais est également présente chez un vertébré non-placentaire, indiquant que le recrutement des ces gènes dans l’allantoïde précède fort probablement l’émergence des espèces placentaires. Nous avons généré des réarrangements génétiques et utilisé des essais transgéniques pour étudier les mécanismes régulant l’expression des gènes Hoxa dans l’allantoïde. Nous avons identifié un fragment intergénique de 50 kb capable d’induire l’expression d’un gène rapporteur dans l’allantoïde. Cependant, nous avons trouvé que le mécanisme de régulation contrôlant l’expression du gène Hoxa au sein du compartiment extra-embryonnaire est fort complexe et repose sur plus qu’un seul élément cis-régulateur. Au chapitre 3, nous avons utilisé la cartographie génétique du destin cellulaire pour évaluer la contribution globale des cellules exprimant Hoxa13 aux différentes structures embryonnaires. Plus particulièrement, nous avons examiné plus en détail l’analyse de la cartographie du destin cellulaire de Hoxa13 dans les pattes antérieures en développement. Nous avons pu déterminer que, dans le squelette du membre, tous les éléments squelettiques de l’autopode (main), à l’exception de quelques cellules dans les éléments carpiens les plus proximaux, proviennent des cellules exprimant Hoxa13. En contraste, nous avons découvert que, au sein du compartiment musculaire, les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes (Hoxa13lin+) s’étendent à des domaines plus proximaux du membre, où ils contribuent à générer la plupart des masses musculaires de l’avant-bras et, en partie, du triceps. De façon intéressante, nous avons découvert que les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes ne sont pas distribuées uniformément parmi les différents muscles. Au sein d’une même masse musculaire, les fibres avec une contribution Hoxa13lin+ différente peuvent être identifiées et les fibres avec une contribution semblable sont souvent regroupées ensemble. Ce résultat évoque la possibilité que Hoxa13 soit impliqué dans la mise en place de caractéristiques spécifiques des groupes musculaires, ou la mise en place de connections nerf-muscle. Prises dans leur ensemble, les données ici présentées permettent de mieux comprendre le rôle de Hoxa13 au sein des compartiments embryonnaires et extra-embryonnaires. Par ailleurs, nos résultats seront d’une importance primordiale pour soutenir les futures études visant à expliquer les mécanismes transcriptionnels soutenant la régulation des gènes Hoxa dans les tissus extra-embryonnaires. / The Hox family of transcription factors is well known for its key contribution in the establishment of the body architecture in all the animal kingdom. During vertebrate evolution, Hox genes have been co-opted to pattern a variety of novel tissues/organs. Often, this diversification has been achieved by changes in Hox transcriptional control. In mammals, Hoxa13 function is not restricted to the embryo proper, but is also essential for the proper development of the fetal vasculature within the placental labyrinth, suggesting that its function in this structure accompanied the emergence of placental species. In chapter 2, we report on the recruitment of two other Hoxa genes, namely Hoxa10 and Hoxa11, in the extra embryonic compartment. We show that Hoxa10, Hoxa11 and Hoxa13 expression is required in the allantois, the precursor of the umbilical cord and fetal vasculature within the placental labyrinth. Interestingly, we found that Hoxa10-13 gene expression in the allantois is not restricted to placental mammals, but is also present in a non-placental vertebrate, indicating that the recruitment of these genes in the allantois most likely predates the emergence of placental species. We generated genetic rearrangements and used transgenic assays to investigate the regulatory mechanisms underlying Hoxa gene expression in the allantois. We identified a 50 kb intergenic fragment able to drive reporter gene expression in the allantois. However, we found that the regulatory mechanism controlling Hoxa gene expression in the extra-embryonic compartment is very complex and relies on more than one cis-regulatory element. In chapter 3, we used genetic fate mapping to assess the overall contribution of Hoxa13 expressing cells to the different embryonic structures. In particular, we focused on Hoxa13 fate-mapping analysis in the developing forelimbs. We could determine that, in the limb skeleton, all autopod (hand) skeletal elements, with the exception of a few cells in the most proximal carpal elements, originate from Hoxa13 expressing cells. In contrast, we found that, in the muscle compartment, Hoxa13 expressing cells and their descendants extend to more proximal limb domains, where they contribute to most of the muscle masses of the forearm and, in part, to the triceps. Interestingly we found that Hoxa13 expressing cells and their descendants are not identically distributed among different muscles. Within the same muscular mass, fibres with different Hoxa13lin+ contribution can be identified, and fibers with similar contribution are often clustered together. This result raises the possibility that Hoxa13 might be involved in establishing specific features of muscle groups, or in establishing nerve-muscle connectivity. Altogether, the data presented herein provide a better understanding of the role of Hoxa13 in both the embryonic and extra-embryonic compartment. Moreover, our results will be of key importance for further investigations aimed at unravelling transcriptional mechanisms underlying Hoxa gene regulation in extra embryonic tissues.