L’inactivation d’un des deux chromosomes X dans les cellules d’organismes femelles permet d’assurer un taux similaire des transcrits des gènes liés aux chromosomes X entre les deux sexes. L’ARN non codant Xist d’environ 17000 nts joue un rôle central dans ce processus. Il habille le futur chromosome X inactivé et induit la mise en place de modifications épigénétiques qui permettent d’éteindre l’expression des gènes. Une région d’approximativement 500 nts située à l’extrémité 5’ de l’ARN Xist est nécessaire à l’initiation de l’inactivation. Cette région appelée region des A-repeats contient 8 répétitions d’une séquence de 24 nucléotides. La délétion de cette région provoque un défaut d’inactivation, ce qui souligne son importance dans le processus. Etant donné que la fonction d’un ARN est bien souvent conditionnée par sa structure 2D, mon travail de thèse a consisté à réaliser l’étude expérimentale de la structure 2D de la région des A-repeats, ceci en utilisant des sondes de la structure secondaire des ARN en solution et une méthode de FRET. Nous avons montré que la région des A-repeats se structure selon 2 grandes structures tige-boucle irrégulières formées par l’appariement 2 à 2 des éléments répétés. Par purification des RNP et identification de leurs protéines, nous avons démontré que le complexe PRC2, impliqué dans la mise en place des marques épigénétiques du Xi, se lie à la région des A-repeats. Nous avons également identifié un grand nombre d’autres protéines pouvant avoir un rôle dans l’activité de la région des A-repeats (PTB, KSRP, Sam68, Vigiline, RHA, TIAR, DEK, H1, BRML1, Rod1, Lin28). Leurs implications dans l’inactivation du chromosome X est en cours de vérification. / Silencing of one X chromosome (XCI) in cells of mammalian female ensures sex chromosome dosage compensation between male and female. The 17kb Xist ncRNA plays an essential role in XCI. Its spread along the future inactivated X chromosome is associated with major modifications of the epigenetic status of this chromosome, including histone H3K27 methylations mediated by PRC2 complex. One key part of Xist necessary for XCI initiation is the phylogenetically conserved A region. It lies at the 5’ end of the Xist molecule and contains 8 of a 24-nucleotides motif. Female mouse embryos carrying a mutated Xist deleted for the A region are selectively lost during embryogenesis, which underlines the importance of this element. We performed the first experimental analysis of the structure of the entire A region in solution. By the use of chemical and enzymatic probes and FRET experiments, using oligonucleotides carrying fluorescent dyes, we established a 2D structure for the A region that contains two long stem-loop structures each including 4 repeats which interact together two by two. By immunoprecipitation assays and mass spectrometry analysis, we identified the protein partners of the A region. We demonstrated that the A region associate with PRC2 components which is responsible for the apposition of epigenetic modifications of X inactive chromosome. Others proteins which would have a role in A region function were also identified (PTB, KSRP, Sam68, Vigiline, RHA, TIAR, DEK, H1, BRML1, Rod1, Lin28).

L'inactivation du chromosome X est la réponse trouvée par l'évolution pour pallier à la divergence gonosomique entre mâle (XY) et femelle (XX). Ce phénomène sert donc à mettre les deux sexes sur un pied d'égalité en limitant la quantité de transcrits provenant des chromosomes X présents dans les cellules femelles. Au cours de mon doctorat, j'ai tenté de contribuer à l'étude des mécanismes de régulation transcriptionnelle, notamment l'activation, des deux acteurs principaux de l'inactivation: Xist et Tsix, son transcrit antisens. Pendant ces 4 anne��es, j'ai entrepris de cartographier le profil de fixation de plusieurs protéines le long du locus Xist/Tsix, dans le but de comprendre les mécanismes permettant une surexpression de Xist lors de la disparition de ses facteurs répressifs en cours de différenciation. J'ai donc pu établir un modèle de régulation transcriptionnelle de l'ARN non-codant Xist, impliquant plusieurs protéines connues pour leur rôle dans la régulation transcriptionnelle (CTCF et YY1) aussi bien que dans la formation de structures tridimensionnelles (la cohésine). La pertinence de ce modèle est renforcée par nos études montrant que de nombreux aspects de ce modèle sont conservés à travers l'évolution (notamment chez l'homme). J'ai également pu contribuer à la découverte de nouveaux activateurs de Tsix, certains facteurs de pluripotence se fixant au minisatellite DxPas34 afin de réguler l'élongation de la transcription de l'antisens. Ces résultats apportent donc d'importantes informations concernant les mécanismes régulant la mise en place du phénomène d'inactivation du chromosome X au cours du développement précoce de l'embryon.

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s'accompagne de l'inactivation transcriptionnelle d'un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l'expression mono-allélique de l'ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d'inactivation du chromosome X (Xic) - tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d'appréhender le paysage structural dans lequel s'exerce cette régulation. La caractérisation de l'architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), m'a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu'au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5' respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l'architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l'intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L'existence de ces domaines d'interaction s'intègre avec d'autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l'association à la lamine nucléaire, mais n'apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j'ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j'ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l'environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l'orée de l'activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l'échelle de la population cellulaire d'une part et de la fibre de chromatine unique d'autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s'inscrit le contrôle de l'activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l'organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s’accompagne de l’inactivation transcriptionnelle d’un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l’expression mono-allélique de l’ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d’inactivation du chromosome X (Xic) – tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d’appréhender le paysage structural dans lequel s’exerce cette régulation. La caractérisation de l’architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), m’a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu’au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5’ respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l’architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l’intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L’existence de ces domaines d’interaction s’intègre avec d’autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l’association à la lamine nucléaire, mais n’apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j’ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j’ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l’environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l’orée de l’activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l’échelle de la population cellulaire d’une part et de la fibre de chromatine unique d’autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s’inscrit le contrôle de l’activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l’organisation topologique des chromosomes chez les mammifères. / Early development of female mammals is accompanied by transcriptional inactivation of one of their two X chromosomes. This event is initiated following mono-allelic expression of the Xist non-coding RNA – what is achieved by the interplay of numerous cis-regulatory elements present within the X inactivation center (Xic), such as its repressive antisense Tsix. Our work aimed at throwing light on the structural landscape that underlies such long-range regulation. Characterization of the three-dimensional architecture of the Xic, by the means of Chromosome Conformation Capture (3C)-based techniques and in situ fluorescence hybridization (FISH), revealed that the respective promoters of Xist and Tsix contact many distal genomic elements within the Xic, and that at least one of such interacting region exerts long-range cis-transcriptional control. Noticeably, Xist and Tsix promoters associate with different sets of elements in their respective 5’ direction that are spread out over several hundreds of kilobases These experiments also revealed unforeseen properties of chromatin architecture. Indeed, the Xic appears to be partitioned in several sub-regions, each spanning between 200kb and 1Mb, inside which chromosomal interactions are preferentially established. The existence of these interaction domains integrates with other structural features of the genome, such as underlying chromatin composition and association with the nuclear lamina, but does not seem to directly depend on them. By analyzing chromosome conformation of the Xic during cell differentiation we document the robustness of this organizational principle, with the noticeable exception of the inactive X chromosome that assumes a folding pattern that is more random than its active homolog. Finally we also bring evidence that variability in the folding pattern of the two X chromosomes in the same cell brings each Tsix allele in association with different sets of chromosomal partners at a given moment, suggesting that the instantaneous structural environment of each allele at the onset of mono-allelic Xist up-regulation is different.By combining approaches at the scale of cell populations on the one hand, and at the single chromatin fiber level on the other, this study provides a first vision of the structural landscape in which Xist regulation takes place, and brings new insights concerning fundamental properties of chromosome organization in mammals.

Chez les Mammifères femelles, l’extinction transcriptionnelle d’un des deux chromosomes X pendant l’embryogénèse précoce compense le déséquilibre de dose des gènes liés à l’X entre les sexes. L’inactivation aléatoire du chromosome X est mise en place dans la masse cellulaire interne du blastocyste et maintenue jusqu’à l’âge adulte dans le soma. Chez certains Euthériens incluant la souris, les tissus extra-embryonnaires (trophectoderme et endoderme primitif) montrent une inactivation soumise à empreinte du X paternel. Le statut inactif du Xp peut être étudié ex vivo dans les cellules souches trophoblastiques (TS) dérivées du trophectoderme. Nous avons pu sélectionner des cellules TS montrant une réactivation partielle du Xp ou bien une inversion complète du profil d’inactivation. Ceci révèle une plasticité épigénétique accrue de l’inactivation dans le trophectoderme par au soma.L’inactivation aléatoire du chromosome X est récapitulée pendant la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES), qui servent de modèle cellulaire. Ce processus est déclenché par l’accumulation en cis du long ARN non codant Xist qui crée un domaine nucléaire répresseur autour du futur chromosome X inactif. Avant la différenciation, l’accumulation de Xist est réprimée par un autre long ARN non codant, Tsix, qui est transcrit en antisens de Xist. Afin d’adresser la dynamique fonctionnelle des ARN Xist et Tsix, nous avons inséré différents motifs d’étiquetage au locus Xist/Tsix endogène. Incorporés dans l’ARN sens ou antisens, ces étiquettes sont reconnues spécifiquement par des molécules fluorescentes, permettant ainsi la visualisation de ces transcrits dans les cellules vivantes. / In female Mammals, the transcriptional silencing of one of the two X chromosomes during early embryogenesis compensates the dosage disequilibrium of X-linked genes between sexes. Random X chromosome inactivation occurs in the inner cell mass of the blastocyst and is maintained through adult life in the soma. In some Eutherian species including mice, extraembryonic tissues (trophectoderm and primitive endoderm) exhibit imprinted inactivation of the paternal X. The inactive state of the Xp can be extensively studied ex vivo in Trophoblast Stem (TS) cells derived from the trophectoderm. We were able to select from the general cell population, TS cells exhibiting partial reactivation of the Xp or showing a complete switch of imprinted X-inactivation pattern. This reveals an accrued epigenetic plasticity of imprinted X-inactivation in the trophectoderm as compared to random X-inactivation in the soma.Random X-chromosome inactivation is recapitulated during the differentiation of female Embryonic Stem (ES) cells – which serves as cellular model. This process is triggered by the cis-accumulation of Xist long non coding RNA molecules which create a nuclear repressive domain around the future inactive X chromosome. Before differentiation, the accumulation of Xist is repressed by another lncRNA, Tsix, that is transcribed antisense to Xist. In order to address the functional dynamics of Xist and Tsix RNAs, we inserted different types of tag sequences in the endogenous Xist/Tsix locus. Incorporated in the sense or antisense RNA, these tags are specifically recognized by fluorescent molecules, thereby allowing live cell imaging of these transcripts.

Comme dans la plupart des maladies auto-immunes une prédominance féminine est observée dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Le chromosome X, présent en 2 exemplaires chez la femme, est intéressant puisque beaucoup de gènes à fonctions immunitaires y sont localisés. Dans ce travail, nous montrons que certains de ces gènes peuvent augmenter leur nombre de copies quand l'individu vieillit. En outre, cette variation est spécifique au sexe avec une augmentation chez les hommes et l'inverse chez les femmes. D’autre part, alors que généralement les femmes inactivent aléatoirement (50:50) le chromosome X d’origine maternel ou X d’origine paternel, nous montrons un biais d’inactivation (≥ 80:20) chez les femmes atteintes de PR. De plus ce biais est préférentiellement associé à celles qui portent les gènes de susceptibilité à la maladie. Ces résultats soulignent l’importance du chromosome X dans le développement de l’auto-immunité et aident à la compréhension du biais féminin dans ces maladies. / As in many autoimmune diseases, a female predominance is observed in rheumatoid arthritis (RA). The X chromosome, present in 2 copies in females, is of particular interest as it contains many genes with immune functions. In this work, we show an increase with age in copy number of some X-linked genes in peripheral blood cells of men, healthy or with RA. Importantly, this increase is not observed in women. On the other hand, when in fact females generally randomly inactivate (50:50) either the paternally-derived or the maternally-derived X chromosome, we show a skewed inactivation (≥ 80:20) in women with RA. Moreover this skewing correlates preferentially with women carrying disease susceptibility genes. Altogether, our findings highlight the importance of this fascinating chromosome in the development of autoimmunity in a step forward to better understand female predilection to autoimmune diseases.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent une production constante des cellules sanguines tout au long de la vie, mais sont vulnérables à l’acquisition de mutations pouvant mener à une transformation maligne. Les mutations qui confèrent un avantage de croissance entraîneront une prolifération clonale. L’étude de la clonalité est centrale à la compréhension de ces phénomènes. Historiquement, l’analyse de la clonalité a été possible grâce au principe de l’inactivation du chromosome X (ICX) chez les femmes qui entraîne la création de deux populations cellulaires, celle avec le X-paternel actif et celle avec le X-maternel actif. Une déviation (biais) de la proportion théorique de 1 :1 entre ces deux populations peut supposer une dominance clonale. Nous avons démontré un biais significatif de l’ICX chez les femmes avec l’âge. Ce phénomène peut être expliqué par plusieurs causes dont la sélection hémizygote (un des deux X possède des allèles plus forts que l’autre) et l’acquisition de mutations dans une CSH. Nous posons l’hypothèse que ces deux phénomènes coexistent et peuvent être distingués par une approche génomique. Nous avons recruté une cohorte de 2996 femmes canadiennes-françaises âgées entre 37 et 101 ans composée de 2172 individus issus de 321 familles et de 824 individus non apparentés. Deux tissus biologiques ont été recueillis : le sang périphérique (PMN, monocytes, lymphocytes T, lymphocytes B) et des cellules buccales. Le ratio de l’ICX a été déterminé par la méthode HUMARA, l’analyse de gènes associés à l’hématopoïèse clonale (19 gènes) a été faite par la méthode de séquençage NGS, et la cohorte a été génotypée à 700 625 loci polymorphiques de l’ADN (SNP). Des analyses bioinformatiques ont été - iv - appliquées pour étudier la contribution génétique au biais de l’ICX. Nous démontrons que : (i) le biais de l’ICX est plus prévalent dans les cellules sanguines par rapport aux cellules épithéliales et maximal dans les cellules myéloïdes; (ii) le biais augmente avec l’âge seulement dans les cellules sanguines et que cette influence est plus marquée pour les neutrophiles; (iii) la concordance du biais est très importante pour les différents types cellulaires sanguins, suggérant un mécanisme opérant au niveau de la CSH ; (iv) il y a une composante héréditaire liée au biais de l’ICX; (v) la présence de mutations acquises (TET2, DNMT3A, etc.) explique seulement une partie du biais ; (vi) à l’aide d’analyses par liaison génétique la présence d’une région sur le chromosome X à Xq21 (LOD score 4.9) qui est associée au biais des lymphocytes T et une autre sur le chromosome 1 à 1q21 (LOD score 6) qui est associée au biais des neutrophiles. Nous avons départagé la contribution liée à l’acquisition de mutations somatiques et identifié pour la première fois des régions liées à une prédisposition génétique. Nos travaux se poursuivront d’une part par l’analyse de gènes candidats dans les régions identifiées, et d’autre part nous tenterons d’identifier les cibles génétiques qui confèrent un potentiel de transformation maligne en utilisant une approche basée sur l’analyse du méthylome, de l’hydroxyméthylome et du transcriptome que nous venons de valider. Notre étude démontre la complexité de l’adaptation de l’hématopoïèse au vieillissement et ouvre des portes sur l’identification de facteurs prédisposant aux cancers hématologiques. / Hematopoietic stem cells (HSC) ensure a constant lifelong production of blood cells, but are vulnerable to acquisition of mutations, which may lead to malignant transformation. Mutations that confer a growth advantage will lead to clonal derivation of cells. The study of clonality is central to the understanding of hematopoiesis adaptation to aging. Historically, the first clonality assays were based on the principle of X-chromosome inactivation (XCI) in women. Women are mosaics with half the cells with the paternal X active and the other half with the maternal one. A skewing from the theoretical 1:1 ratio between these two populations of cells could infer clonal derivation of cells. More than 20 years ago, our team demonstrated, through analysis of (XCI) in women, that skewing increases with age. This intriguing phenomenon can be explained by several etiology including hemizygous selection (one of the 2 Xs has stronger alleles) or the acquisition of mutations giving a growth advantage. The first etiology is genetically predetermined and the second, acquired in somatic cells of bone marrow. We hypothesize that these two phenomena coexist and can be distinguished with a genomic approach. To test our hypothesis, we investigated skewing in a cohort of 2996 French-Canadian women aged 37 to 101 comprised of 2172 related individuals from 321 families and 824 unrelated individuals. We analyzed XCI ratios at the HUMARA locus in epithelial cells, neutrophils, T-cells, monocytes, B-lymphocytes. We genotyped the cohort for clonal hematopoiesis and looked for germline heritable components by genome wide association studies and linkage analyses. We document that skewing was more prevalent in blood cells than in epithelial cells, and maximal in myeloid cells. Skewing increases with age only in blood cells. Intra- vi - individual correlation of skewing blood cell types was strongly correlated, suggesting selection influences operating at the HSC. Sibship analyses demonstrated heritability which was strongest when parental origin of skewing was taken into account. Clonal hematopoiesis accounted only for a small proportion of the skewing trait but its importance increased in the very old. Linkage analysis identified a region at Xq21 for skewing occurring in T-cells (LOD score 4.9) suggesting a hemizygous cell selection influence. We also identified a region at 1q21 for skewing in neutrophils (LOD score 6) suggesting a gene-gene interaction with Xlinked genes. We have demonstrated that age-associated skewing is a complex trait caused in part by acquired mutations and genetic predisposition variants. We will pursue our investigation using a candidate gene approach in the two identified regions and will try to identify genetic targets of oncogenic potential by a method based on analysis of the methylome, hydroxymethylome and transcriptome that was have validated in this cohort. This thesis demonstrates the complexity of the adaptation mechanisms of hematopoiesis to aging and set the stage to identification of factors predisposing to hematological cancers.

La régulation de l’expression génique chez les mammifères dépend de l’organisation tridimensionnelle des chromosomes, en particulier à l’échelle des communications entre les séquences régulatrices et leurs promoteurs cibles. Ainsi, les chromosomes sont organisés en une nouvelle architecture consistant en domaines d’interactions topologiques (TADs, acronyme anglais). Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans cette architecture et leurs importances au cours du développement embryonnaire, pour un locus bien particulier, le Xic (acronyme anglais pour X-inactivation centre). Le Xic contient les éléments régulateurs nécessaires pour initier l’inactivation du chromosome X (ICX), un phénomène épigénétique spécifique du développement des mammifères femelles, rendant l’un des deux chromosomes X inactif du point de vue transcriptionnelle. L’ICX permet d’égaliser l’expression des gènes liés au X entre les sexes chez les mammifères. Le Xic est organisé au moins en deux TADs mais une partie du locus reste encore non identifiée. Je présente ici une analyse fonctionnelle approfondie des différents éléments régulateurs au sein du Xic, comprenant des enhancers, des gènes d’ARNs non codants et des éléments structurels. Après avoir créé une série d’allèles mutés chez la souris et les cellules souches embryonnaires murines, j’ai caractérisé l’impact de ces réarrangements génomiques sur le paysage structurel et transcriptionnel du Xic. J’ai identifié des nouveaux acteurs dans la régulation de ce locus, en particulier des séquences régulatrices conservées chez les mammifères placentaires et des éléments structurels importants pour la formation d’une frontière entre les deux TADs du Xic, importante pour leur séparation et régulation. Je décris aussi la découverte de communication entre ces TADs, ce qui constitue un mécanisme inédit de régulation génique pendant le développement. Ce travail contribue à un nouveau niveau de compréhension des lois qui régissent l’organisation des TADs dans le contexte de la régulation génique chez les mammifères. / Mammalian gene regulatory landscapes rely on the folding of chromosomes in the recently discovered topologically associating domains (TADs), which ensure appropriate communication between cis-regulatory elements and their target promoters. The aim of my PhD project was to characterise the molecular mechanisms that govern this novel architecture and its functional importance in the context of a critical and developmentally regulated locus, the X-inactivation centre (Xic). The Xic contains the necessary elements to trigger X-chromosome inactivation, an epigenetic phenomenon that occurs during the development of female mammals to transcriptionally silence one of the X-chromosomes and equalise X-linked gene expression between sexes. The Xic is partitioned into at least two TADs, but its full extent is unknown. Here, I present a comprehensive functional analysis of different cis-regulatory elements within the Xic, including enhancer-like regions, long noncoding RNA loci and structural elements. Upon generating a series of mutant alleles in mice and murine embryonic stem cells, I characterised the impact of these genomic rearrangements in the structural and transcriptional landscape of the Xic and identified novel players in the regulation of this locus, including cis-acting elements conserved across placental mammals and structural elements critical for the insulation between the Xic TADs. I also found evidence for communication across TADs at this locus, which provides new insights into how regulatory landscapes can work during development. This study also extends our understanding of the rules governing the organisation of TADs and their chromatin loops in the context of mammalian gene regulation. / Nos mamíferos, a regulação da expressão genética depende da organização tridimensional dos cromosomas, em particular ao nível da comunicação regulatória entre promotores e enhancers. A esta escala, descobriu-se recentemente que os cromossomas estão organizados em domínios de interações topológicas (conhecidos como TADs, no acrónimo inglês) que se pensa providenciarem uma base estrutural para as paisagens de regulação transcricional dos genes. O meu projecto de tese teve como objectivo caracterizar os mecanismos moleculares responsáveis por esta arquitectura e a sua importância funcional no contexto de um locus crítico para o desenvolvimento embrionário, o centro de inactivação do cromossoma X (Xic, acrónimo inglês). O Xic contém os elementos genéticos necessários e suficientes para iniciar a inactivação do cromossoma X, um fenómeno epigenético que ocorre durante o desenvolvimento das fêmeas de mamíferos para silenciar um dos cromosomas X e igualar a expressão dos genes do X entre indivíduos XX e XY. O Xic está organizado em pelo menos dois TADs, mas o seu intervalo genético completo permanece desconhecido. Apresento nesta tese uma análise funcional e detalhada de diferentes sequências reguladoras presentes no Xic, incluindo regiões do tipo enhancer, genes de ARNs não codificantes e elementos estruturais. Após a criação de diversos alelos mutantes (deleções, inserções, inversões) em ratinho e em células estaminais embrionárias, através das recentes técnicas de engenharia genética, TALENs e CRISPR/Cas9, caracterizei o impacto destes rearranjos genéticos na paisagem topológica e transcricional do Xic, o que permitiu a identificação de novos actores moleculares na regulação deste locus. Em particular, descobrimos sequências de regulação transcricional altamente conservadas em mamíferos placentários e elementos estruturais importantes para a formação da fronteira entre os dois TADs do Xic. Descrevo também evidência de que há comunicação entre os dois TADs neste locus, o que compromete os modelos actuais do modus operandis dos TADs, e por isso contribui para um novo nível de compreensão dos mecanismos que regulam a expressão genética durante o desenvolvimento.