Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La pollinisation et la fécondation induisent, dans le pistil, l'expression de nombreux messagers. Certains de ceux-ci sont nouvellement produits tandis que d'autres voient leur expression augmenter. Ce mémoire expose les résultats obtenus pour trois de ces gènes induits par la pollinisation et/ou la fécondation chez Solanum chacoense Bitt., une pomme de terre sauvage. Le premier, SPP2, est une désoxygénase de fonction inconnue de la famille des 2-oxoglutarate dépendantes, que les identités de séquence rapprochent d'enzymes impliquées dans les voies de biosynthèse d'alcaloïdes. Ce clone fut isolé simultanémment de deux banques d'ADNc construites à partir de pistils pollinisés depuis 48 heures (banque PP48) et 96 heures (banque 0v96), par la méthode d'hybridation soustractive. Le second gène, l'ACC oxydase qui est l'enzyme responsable de transformer l'ACC en éthylène, fut isolé dans la banque d'ADNc PP48 par la méthode du criblage différentiel. Le corps de ce mémoire traite principalement de ces deux premiers gènes, le troisième nommé SPP30 étant présenté en annexe sous forme d'article manuscrit, afin de mieux cerner la discussion. Ce troisième gène, SPP30, est très fortement homologue à un antigène de surface de Plasmodium falciparum, l'agent causal de la malaria, et fut isolé dans la banque d'ADNc PP48 par hybridation soustractive. L'ACC oxydase est un gène qui a déjà été caractérisé chez un grand nombre d'espèces de plantes. Depuis longtemps déjà il est établi que l'ACC oxydase est une importante enzyme de la voie de biosynthèse de l'éthylène, et que ce dernier est connu pour ses effets au niveau de la sénescence des pièces florales, sénescence qu'induisent les événements de pollinisation et de fécondation chez les végétaux. Pour cette raison, nous n'avons pas poussé très avant sa caractérisation. Une hybridation d'ARN de type northern démontre tout de même que, chez Solanum chacoense, l'expression de l'ACC oxydase augmente fortement dans le pistil suite à une pollinisation de 48 heures. L'intérêt du clone SPP2, quant à lui, nous est apparu grandissant au fur et à mesure que sa caractérisation progressait. Nous avons réussi, par le biais de nombreuses expérimentations, a démontrer que les ARNm de la désoxygénase SPP2 sont non seulement induits dans les ovaires matures par la pollinisation (compatible ou non), mais également par la fécondation et la blessure du style. On ne peut détecter les ARNm de SPP2 dans le style des fleurs matures, car son patron d'expression régresse de l'extrémité du style jusqu'à l'ovaire, et cela en fonction du développement floral. On constate aussi que l'augmentation de l'expression de SPP2 que l'on peut observer dans les ovaires matures de S. chacoense suite à la pollinisation et la fécondation, n'est pas le résultat du développement floral normal des fleurs. De plus, la période durant laquelle l'expression de SPP2 est maximale, correspond en fait à la période de réceptivité de la fleur à la fécondation. Finalement, le patron d'expression de SPP2 coïncide avec la zone d'abcission du style. Le patron d'expression de SPP2 nous laisse penser que cette enzyme pourrait être impliquée dans la voie de biosynthèse de métabolites secondaires pouvant jouer un rôle dans le guidage et la croissance des tubes polliniques vers les ovules. Aussi, la forme que prend l'expression des ARNm de SPP2 au niveau de la base du style, nous laisse penser que SPP2 pourrait également jouer un rôle de marqueur cellulaire entre le style et l'ovaire. Finalement, on sait que SPP2 est principalement exprimée au niveau du pistil, des feuilles et des fruits, et que son expression coïncide (dans les fleurs) avec la période pendant laquelle les fleurs de S. chacoense sont réceptives à la pollinisation et à la fécondation, alors que sa diminution coïncide avec la période à partir de laquelle la fécondation ne peut plus avoir lieu chez les fleurs. Tout ceci nous laisse penser que notre désoxygénase (présente de façon constitutive et induite par la pollinisation, la fécondation ou la blessure), pourrait être impliquée dans la voie de biosynthèse d'un métabolite secondaire tels qu'un alcaloïde possédant des propriétés anti-microbiennes ou encore, anti-herbivores.

Nous sommes toujours aux prises avec la pandémie de SARS-CoV-2 plus de deux ans après son début. Le virus a depuis accumulé de nombreuses mutations qui ont mené à différentes souches virales au long de la pandémie. Plusieurs de ces mutations sont récurrentes: il y a un excès de mutations C > U dans les génomes viraux, certains codons sont fréquemment mutés vers différents acides aminés et certaines mutations sont convergentes, c’est-à-dire que la même substitution est apparue de manière indépendante sur différentes lignées. Dans ce mémoire, nous avons identifiés différentes manières par lesquelles le SARS-CoV-2 évolue à travers l’étude de ces mutations récurrentes et évaluons leur impact sur l’évasion immunitaire. Premièrement, nous avons déterminés que les mutations C > U sont responsable de l’introduction et du retrait préférentiel d’acides aminés spécifiques dans les épitopes viraux. Nous avons déterminé la significativité statistique de ces patrons de mutation à l’aide de simulations génomiques virales. Deuxièmement, nous avons participé à la surveillance des variants au Québec durant la deuxième vague de la pandémie, qui s’est déroulée d’août 2020 à mars 2021. C’était une période intéressante pour la diversité virale, puisque les restrictions de déplacement ont créé de multiples poches de variants locaux en compétition les uns avec les autres qui partagent des mutations convergentes. Notamment, nous reportons que les lignées B.1.160 et B.1.1.176 comptaient pour 50% des échantillons séquencés au sommet de la deuxième vague dans la province. Finalement, nous avons analysé les patrons mutationnels intra-hôte qui sont apparus de novo dans le contexte d’infections au SARS-CoV-2 de longue durée chez des patients atteints de cancers hématologiques. Une de ces patientes est une patiente québécoise infectée par B.1.160 et dans laquelle nous avons identifié la présence d’un réservoir viral. Nous avons également trouvé des éléments probants montrant différentes quasiespèces virales avec des propriétés d’évasion immunitaire. Nos résultats permettent de mieux comprendre les différentes manières dont les pressions sélectives façonnent l’évolution virale. / We are still living in the SARS-CoV-2 pandemic over two years after its start. The virus has since accumulated many mutations that have led to different viral strains throughout the pandemic. Several of these mutations are recurrent: there is an excess of C > U substitutions in viral genomes, some codons are frequently mutated to different amino acids, and some mutations are convergent, meaning that the same substitution has occurred independently on different lineages. In this thesis, we identified different ways in which SARS-CoV-2 evolves through these recurrent mutations and assess their impact on immune escape. First, we determined that C > U mutations drive the preferential introduction and removal of specific amino acids in viral epitopes. Using genetic simulations, we determined the statistical significance of these patterns. Second, we participated in the surveillance of variants in Quebec during the second wave of the pandemic that went from the end of August 2020 to the end of March 2021. This was an interesting period of viral diversity owing to imposed travel restrictions that created competition between multiple pockets of local strains that share convergent mutations. Notably, we found that lineages B.1.160 and B.1.1.176 account for 50% of samples sequenced at the height of the second wave in the province. Finally, we analyzed intra-host mutational patterns that arose de novo in the context of long-term infections of patients with hematological cancers, one of which was from Québec and infected by B.1.160. We have identified a pattern consistent with the presence of a viral reservoir in this patient. We have also found evidence of different viral quasispecies with immune escape properties. These results shed light on different ways in which selective pressures shape the evolution of SARS-CoV-2.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent une production constante des cellules sanguines tout au long de la vie, mais sont vulnérables à l’acquisition de mutations pouvant mener à une transformation maligne. Les mutations qui confèrent un avantage de croissance entraîneront une prolifération clonale. L’étude de la clonalité est centrale à la compréhension de ces phénomènes. Historiquement, l’analyse de la clonalité a été possible grâce au principe de l’inactivation du chromosome X (ICX) chez les femmes qui entraîne la création de deux populations cellulaires, celle avec le X-paternel actif et celle avec le X-maternel actif. Une déviation (biais) de la proportion théorique de 1 :1 entre ces deux populations peut supposer une dominance clonale. Nous avons démontré un biais significatif de l’ICX chez les femmes avec l’âge. Ce phénomène peut être expliqué par plusieurs causes dont la sélection hémizygote (un des deux X possède des allèles plus forts que l’autre) et l’acquisition de mutations dans une CSH. Nous posons l’hypothèse que ces deux phénomènes coexistent et peuvent être distingués par une approche génomique. Nous avons recruté une cohorte de 2996 femmes canadiennes-françaises âgées entre 37 et 101 ans composée de 2172 individus issus de 321 familles et de 824 individus non apparentés. Deux tissus biologiques ont été recueillis : le sang périphérique (PMN, monocytes, lymphocytes T, lymphocytes B) et des cellules buccales. Le ratio de l’ICX a été déterminé par la méthode HUMARA, l’analyse de gènes associés à l’hématopoïèse clonale (19 gènes) a été faite par la méthode de séquençage NGS, et la cohorte a été génotypée à 700 625 loci polymorphiques de l’ADN (SNP). Des analyses bioinformatiques ont été - iv - appliquées pour étudier la contribution génétique au biais de l’ICX. Nous démontrons que : (i) le biais de l’ICX est plus prévalent dans les cellules sanguines par rapport aux cellules épithéliales et maximal dans les cellules myéloïdes; (ii) le biais augmente avec l’âge seulement dans les cellules sanguines et que cette influence est plus marquée pour les neutrophiles; (iii) la concordance du biais est très importante pour les différents types cellulaires sanguins, suggérant un mécanisme opérant au niveau de la CSH ; (iv) il y a une composante héréditaire liée au biais de l’ICX; (v) la présence de mutations acquises (TET2, DNMT3A, etc.) explique seulement une partie du biais ; (vi) à l’aide d’analyses par liaison génétique la présence d’une région sur le chromosome X à Xq21 (LOD score 4.9) qui est associée au biais des lymphocytes T et une autre sur le chromosome 1 à 1q21 (LOD score 6) qui est associée au biais des neutrophiles. Nous avons départagé la contribution liée à l’acquisition de mutations somatiques et identifié pour la première fois des régions liées à une prédisposition génétique. Nos travaux se poursuivront d’une part par l’analyse de gènes candidats dans les régions identifiées, et d’autre part nous tenterons d’identifier les cibles génétiques qui confèrent un potentiel de transformation maligne en utilisant une approche basée sur l’analyse du méthylome, de l’hydroxyméthylome et du transcriptome que nous venons de valider. Notre étude démontre la complexité de l’adaptation de l’hématopoïèse au vieillissement et ouvre des portes sur l’identification de facteurs prédisposant aux cancers hématologiques. / Hematopoietic stem cells (HSC) ensure a constant lifelong production of blood cells, but are vulnerable to acquisition of mutations, which may lead to malignant transformation. Mutations that confer a growth advantage will lead to clonal derivation of cells. The study of clonality is central to the understanding of hematopoiesis adaptation to aging. Historically, the first clonality assays were based on the principle of X-chromosome inactivation (XCI) in women. Women are mosaics with half the cells with the paternal X active and the other half with the maternal one. A skewing from the theoretical 1:1 ratio between these two populations of cells could infer clonal derivation of cells. More than 20 years ago, our team demonstrated, through analysis of (XCI) in women, that skewing increases with age. This intriguing phenomenon can be explained by several etiology including hemizygous selection (one of the 2 Xs has stronger alleles) or the acquisition of mutations giving a growth advantage. The first etiology is genetically predetermined and the second, acquired in somatic cells of bone marrow. We hypothesize that these two phenomena coexist and can be distinguished with a genomic approach. To test our hypothesis, we investigated skewing in a cohort of 2996 French-Canadian women aged 37 to 101 comprised of 2172 related individuals from 321 families and 824 unrelated individuals. We analyzed XCI ratios at the HUMARA locus in epithelial cells, neutrophils, T-cells, monocytes, B-lymphocytes. We genotyped the cohort for clonal hematopoiesis and looked for germline heritable components by genome wide association studies and linkage analyses. We document that skewing was more prevalent in blood cells than in epithelial cells, and maximal in myeloid cells. Skewing increases with age only in blood cells. Intra- vi - individual correlation of skewing blood cell types was strongly correlated, suggesting selection influences operating at the HSC. Sibship analyses demonstrated heritability which was strongest when parental origin of skewing was taken into account. Clonal hematopoiesis accounted only for a small proportion of the skewing trait but its importance increased in the very old. Linkage analysis identified a region at Xq21 for skewing occurring in T-cells (LOD score 4.9) suggesting a hemizygous cell selection influence. We also identified a region at 1q21 for skewing in neutrophils (LOD score 6) suggesting a gene-gene interaction with Xlinked genes. We have demonstrated that age-associated skewing is a complex trait caused in part by acquired mutations and genetic predisposition variants. We will pursue our investigation using a candidate gene approach in the two identified regions and will try to identify genetic targets of oncogenic potential by a method based on analysis of the methylome, hydroxymethylome and transcriptome that was have validated in this cohort. This thesis demonstrates the complexity of the adaptation mechanisms of hematopoiesis to aging and set the stage to identification of factors predisposing to hematological cancers.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est le cancer le plus fréquent chez les enfants. Malgré le fait que plus de 80% des enfants atteints de LLA sont aujourd'hui guéris de leur maladie, ce succès a toutefois un prix élevé, car l’exposition aux médicaments cytotoxique et/ou à l’irradiation pendant une période vulnérable du développement de l’enfant peut entraîner des conséquences à long terme. En effet, environ 60% des enfants ayant survécu à une LLA devront vivre avec des problèmes de santé liés au traitement, également appelés effets indésirables tardifs (late-adverse effects, LAEs). Parmi ces derniers, on notera des problèmes métaboliques, l’ostéoporose, une altération des fonctions cognitives ou cardiaques, ainsi que la dépression et l’anxiété. Si certains survivants ne présentent aucune de ces complications, d'autres peuvent en avoir plusieurs. Différents facteurs peuvent contribuer à cette variabilité, notamment le traitement reçu, les caractéristiques de la maladie, les habitudes de vie et, surtout, la constitution génétique du patient. Ce projet s'est concentré sur les biomarqueurs génétiques permettant d'identifier les individus les plus susceptibles de souffrir de LAEs. Récemment, une étude exhaustive (évaluations cliniques, psychosociales et biochimiques) s’est déroulée au CHU Sainte-Justine pour caractériser chacune de ces morbidités chez 250 survivants de la LLA de l'enfant (cohorte PETALE). De plus, on a obtenu le profil génétique de chaque participant. Nous avons utilisé cet ensemble de données et des outils statistiques et bio-informatiques pour réaliser des études d'association comparant la fréquence des variants génétiques chez les survivants ayant développé ou non des LAEs; en particulier, les complications cardiovasculaires et neurocognitives, ainsi que les troubles de l'humeur tels que l'anxiété et la dépression. D'autres facteurs de risque tels que les caractéristiques de traitement et/ou de la leucémie ont été pris en compte lors de l'analyse pour dériver les meilleurs prédicteurs génétiques. Ainsi, en utilisant l'approche des gènes candidats, nous avons identifié les variants communs des gènes MTR, PPARA, ABCC3, CALML5, CACNB2 et PCDHB10 qui étaient associés à des déficits de performance des tests neurocognitifs, tandis que les variants des gènes SLCO1B1 et EPHA5 étaient associés à l'anxiété et à la dépression. Deux variants, rs1805087 dans le gène MTR et rs58225473 dans le gène CACNB2 sont particulièrement intéressants, car ces associations ont été validées dans la cohorte de réplication SJLIFE (St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA). Les analyses d'association ont été complémentées par une étude d'association à l'échelle de l'exome, qui a identifié plusieurs gènes supplémentaires comme des modulateurs potentiels du risque de développer des complications neurocognitives liées au traitement (gènes AK8 et ZNF382), ainsi que l'anxiété et la dépression (gènes PTPRZ1, MUC16, TNRC6C-AS1, APOL2, C6orf165, EXO5, CYP2W1 et PCMTD1). Le variant rs61732180 du gène ZNF382 a ensuite été validé dans la cohorte de réplication SJLIFE. Également, nous avons effectué des analyses d’association concernant les complications cardiaques liées au traitement qui ont identifié plusieurs nouveaux marqueurs associés à ces complications dans les gènes TTN, NOS1, ABCG2, CBR1, ABCC5, AKR1C3, NOD2 et ZNF267. De plus, nous avons résumé les connaissances actuelles sur les marqueurs pharmacogénomiques qui ont été associés aux effets de cardiotoxicités, induites par les anthracyclines, qui affectent les patients atteints de cancer pédiatrique. Nous avons également inclus un aperçu de l'applicabilité des résultats rapportés, notamment ceux qui ont été validés dans la cohorte PETALE. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux complications qui surviennent après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Nous avons appliqué des approches bio-informatiques et statistiques similaires pour obtenir un profil plus complet de la composante génétique derrière ces complications potentiellement mortelles. Ainsi, une étude d'association à l'échelle de l'exome a été réalisée dans une cohorte de patients pédiatriques subissant une greffe de cellules souches hématopoïétiques après un régime de conditionnement contenant du busulfan. Nous avons identifié de nouvelles variations génétiques conférant un risque plus élevé de syndrome d'obstruction sinusoïdale (notamment dans les gènes UGT2B10, BHLHE22, et KIAA1715) et de maladie aiguë du greffon contre l'hôte (dans les gènes ERC1, PLEK, NOP9 et SPRED1), qui pourraient être utiles pour des stratégies personnalisées de prévention et de traitement. Ces travaux contribuent à la compréhension de l'influence des facteurs génétiques sur le risque de développer des complications liées au traitement, tant au cours du traitement qu'à long terme. De plus, les marqueurs génétiques signalés ainsi que d'autres facteurs de risque connus peuvent conduire à des modèles de prédiction identifiant les patients à risque accru de ces complications. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer in children. Even though more than 80% of children with ALL are now cured of their disease, this success comes at a high price as exposure to cytotoxic drugs and/or radiation during a vulnerable period of child development may have long-term consequences. In fact, approximately 60% of children who survive ALL will have to live with treatment-related health problems, also called late-adverse effects (LAEs). These include metabolic problems, osteoporosis, impaired cardiac or cognitive functions, as well as depression and anxiety. While some survivors do not have any of these complications, others may have more than one. Different factors can contribute to this variability, in particular, the treatment received, the characteristics of the disease, the lifestyle, and, above all, the genetic makeup of the patient. This project focused on genetic biomarkers capable of identifying the individuals most likely to suffer from LAEs. Recently, an exhaustive study (clinical, psychosocial, and biochemical evaluations) took place at Sainte-Justine University Health Center (Montreal, Canada), with the goal to characterize each of these morbidities in 250 survivors of childhood ALL (PETALE cohort). In addition, the genetic profile of each participant was obtained, and we used statistical and bioinformatics tools to perform association studies on this dataset in order to compare the frequency of genetic variants in survivors with or without LAEs. We evaluated cardiovascular and neurocognitive complications, as well as mood disorders such as anxiety and depression. Other risk factors, such as treatment and/or leukemia characteristics were also considered during the analysis to derive the best genetic predictors. Thus, using the candidate gene approach, we identified common variants in the MTR, PPARA, ABCC3, CALML5, CACNB2, and PCDHB10 genes that were associated with deficits in neurocognitive tests performance, whereas variants in the SLCO1B1 and EPHA5 genes were associated with anxiety and depression. Two variants, rs1805087 in the MTR gene and rs58225473 in the CACNB2 gene, are of particular interest since these associations were validated in an independent SJLIFE replication cohort (St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA). The association analyses were complemented by an exome-wide association study, which identified several additional genes as potential modulators of the risk of developing treatment-related neurocognitive complications (genes AK8 and ZNF382), as well as anxiety and depression (genes PTPRZ1, MUC16, TNRC6C-AS1, APOL2, C6orf165, EXO5, CYP2W1, and PCMTD1). Variant rs61732180 in the ZNF382 gene was further validated in the replication SJLIFE cohort. To a great extent, we performed association analyses regarding treatment-related cardiac complications which identified several novel markers associated with these toxicities in the TTN, NOS1, ABCG2, CBR1, ABCC5, AKR1C3, NOD2, and ZNF267 genes in survivors of childhood ALL. In addition, we summarized the current knowledge on pharmacogenomic markers related to anthracycline-induced cardiotoxicity affecting pediatric cancer patients. We also included a brief overview of the applicability of reported findings to the PETALE cohort, validating several of them. Besides, we were interested in the complications that arise after a hematopoietic stem cell transplantation. We applied similar bioinformatics and statistical approaches to gain a more complete insight into the genetic component behind these life-threatening complications. Thus, an exome-wide association study was performed in a cohort of pediatric patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation following a conditioning regimen containing busulfan. Our results identified new genetic variations conferring a higher risk of sinusoidal obstruction syndrome (notably in the UGT2B10, BHLHE22, and KIAA1715 genes) and acute graft-versus-host disease (ERC1, PLEK, NOP9, and SPRED1 genes), which could be useful for personalized prevention and treatment strategies. This work contributes to the understanding of the influence of genetic factors on the risk of developing treatment-related complications, both during treatment and in the long term. Furthermore, the reported genetic markers along with other known risk factors can lead to prediction models identifying patients at increased risk for these complications.