Lungenkrebs ist nicht nur eine der häufigsten Krebsarten, sondern auch für die Mehrzahl der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich. Die erheblichen Auswirkungen solcher Tumore werden anhand einer Fünf-Jahres-Überlebensrate von nur 20% und 1,8 Millionen Todesfällen deutlich. Die Mehrzahl aller Fälle (85%) sind als nicht-kleinzellige Lungenkarzinome (non-small-cell lung cancer (NSCLC)) zu klassifizieren. Da solche Tumore häufig mit Rauchen in Zusammenhang stehen, gilt NSCLC als immunogener Krebstyp. Folglich werden charakteristische onkogene Treibermutationen in Genen wie z.B. epidermal growth factor receptor (EGFR) oder anaplastic lymphoma kinase (ALK) häufig beobachtet. In Übereinstimmung mit dieser hohen Mutationsrate hat die Therapie mit Immuncheckpoint-Inhibitoren (immune checkpoint inhibition (ICI)), bei der in erster Linie Antikörper gegen programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) zum Einsatz kommen, in den letzten Jahrzehnten die Therapieoptionen und die Prognose für NSCLC revolutioniert. Eine Ansprechrate von etwa 20% auf eine Monotherapie mit ICIs bedeutet jedoch gleichzeitig, dass die Mehrheit der Patienten, insbesondere solche mit EGFR- oder ALK-Mutationen, überhaupt nicht von ICI-Therapien profitieren. Neben dieser primären Resistenz kommt es ebenfalls vor, dass Tumore nach einem anfänglichen Ansprechen durch sekundäre Resistenzentwicklung weiter fortschreiten. Diese Grenzen der derzeitigen Behandlungsmethoden könnten in Zukunft durch bispezifische Antikörper (bispecific antibodies (biABs)), welche T Zellen mit Tumorzellen verbinden, in Kombination mit ICI erweitert werden. Um den Fortschritt von solchen T Zell-basierten Immuntherapien zu beschleunigen, ist es unerlässlich die molekularen Mechanismen von Resistenzen besser zu verstehen, wirksame Kombinationsansätze zu entwickeln und geeignete Richtlinien für die Patientenstratifizierung aufzustellen. Weitere Forschungsarbeiten dazu, wie Immunität gegenüber Tumorzellen auch in Subtypen mit Treibermutationen erhöht werden kann, sind dringend nötig um die Überlebensrate bei NSCLC zu verbessern. Die vorlegende Arbeit adressiert diese Herausforderungen und zielt darauf ab, biABvermittelte T Zell-Immunantworten in NSCLC zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde ein CRISPR/Cas9 Screen in der NSCLC-Zelllinie NCI-H1975, welche EGFR mutiert ist, durchgeführt. Eine fokussierte sgRNA Bibliothek wurde in diese Zellen eingebracht bevor aktivierte CD8+ T Zellen sowie ein biAB zugegeben wurden. Diese Behandlung führte zur Abreicherung von sgRNAs, die Gene editieren, welche T Zell-vermittelten Zelltod hemmen. Durch diese Ausrichtung des CRISPR/Cas9 Screens konnten somit Resistenz vermittelnde Gene identifiziert werden. Nach erfolgreicher Durchführung folgte eine tiefergehende Validierung, welche schließlich die Gene ankyrin repeat and MYND domain containing 1 (ANKMY1) und chromosome 22 putative open reading frame 46 (C22orf46) als bisher unbekannte Regulatoren von Resistenz gegenüber T Zellen bestätigte. Aufbauend auf diesen Ergebnissen zielte der zweite Teil der Arbeit darauf ab, die Funktion sowie wichtige Eigenschaften von C22orf46 eingehender zu analysieren. Dazu wurden sowohl Experimente in weiteren NSCLC-Zelllinien als auch mit Chemotherapeutika durchgeführt, welche eine breitere Beteiligung von C22orf46 in verschieden NSCLC-Subtypen sowie an anti-apoptotischen Signalwegen nahelegten. Außerdem wurde ein eGFP-tagging Ansatz entwickelt um sowohl aufzuklären, ob es sich um ein protein-kodierendes Gen handelt als auch, welche subzelluläre Lokalisierung vorherrscht. Diese Experimente bestätigten zum ersten Mal, dass der offene Leserahmen FLJ2358 von C22orf46 für ein nukleolares Protein kodiert. Weiterhin ergab die RNA-Sequenzierung von C22orf46-Knockout-Zellen eine veränderte Expression mehrerer immunmodulatorischer Moleküle, darunter bekannte Faktoren, die für das Engagement von T-Zellen relevant sind, wie IL-10 oder CXCL11. Des Weiteren wurden Transkriptom-Veränderungen festgestellt, die mit einer schlechteren Prognose bei Lungenkrebs korrelieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das von C22orf46 kodierte und im Nukleolus exprimierte Protein eine entscheidende Rolle in anti-apoptotischen Signalwegen spielt und mit der Immunresistenz von NSCLC-Zellen in Verbindung steht. Diese Ergebnisse bilden eine wichtige Grundlage für künftige Studien, in welchen nachgeschaltete Signalwege und Interaktionspartner im Detail erforscht werden sollten. Da die funktionellen Daten zu C22orf46 aus in vitro Experimenten stammen, sind weitere Untersuchungen in einer komplexeren Immunumgebung, z. B. in einem Modellorganismus, erforderlich, um die Übertragbarkeit der Resultate zu prüfen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erhöhen das Verständnis von Resistenzen gegenüber T Zell-basierten Therapien und sind geeignet die Patientenstratifizierung in Zukunft zu verbessern. / Lung cancer is not only a prevalent cancer type but also accounts for the majority of cancer-related deaths globally, emphasizing its substantial impact. The five-year survival rate stands at only 20%, with 1.8 million deaths recorded annually. Non-small-cell lung cancer (NSCLC) constitutes the most frequent subtype, representing 85% of all cases. As these tumors are often associated with smoking exposure, NSCLC is considered an immunogenic cancer type. Consequently, characteristic oncogenic driver mutations in genes such as epidermal growth factor receptor (EGFR) or anaplastic lymphoma kinase (ALK) are observed. In well accordance with this high mutational burden, immune checkpoint inhibition (ICI) primarily utilizing anti-programmed cell death protein 1 (PD-1) or anti-programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) antibodies, revolutionized the therapy options and prognosis for NSCLC in recent decades. However, an response rate around 20% to ICI monotherapy at the same time means that the majority of patients, especially EGFR- or ALK-mutant ones, are not benefiting at all from ICI (primary resistance) or tumors still progress after an initial response (secondary resistance) which clearly illustrates the limitations of the current treatment pathways. T cell engaging bispecific antibodies (biABs) in combination with ICI could enhance therapy efficiencies in the future. To expedite the progress of T cell based immunotherapies, research aims to better understand molecular mechanisms of resistance, to develop effective combination approaches and to establish suitable guidelines for patient stratification. To date, such strategies to enhance anti-tumor immunity even in subgroups with oncogenic driver mutations and to allow long-term survival remain urgent but unmet clinical needs. To address these challenges, this thesis aimed to provide mechanisms increasing the biAB mediated T cell killing in NSCLC. To this end, pooled loss-of-function CRISPR/Cas9 screening was established in the EGFR-mutant NCI-H1975 cell line with a focused single guide RNA (sgRNA) library. Direct challenging of knockout cells with isolated cytotoxic T cells (CTLs) by means of a biAB led to depletion of sgRNAs targeting genes inhibiting T cell mediated killing. Successful implementation of this functional screening, along with thorough hit gene validation, identified ankyrin repeat and MYND domain containing 1 (ANKMY1) and chromosome 22 putative open reading frame 46 (C22orf46) as previously unknown mediators of T cell resistance in NSCLC. Building on these results, the thesis further aimed to analyze the role and characteristics of C22orf46 in depth. Through experiments with anti-neoplastic drugs and validation in the A549 NSCLC cell line, a broader involvement of C22orf46 in anti-apoptotic signaling across different NSCLC subtypes is suggested. This observation aligns with two recent studies presenting C22orf46’s contribution to tumor progression. Additionally, an eGFP-tagging approach was developed to elucidate both the protein-coding ability and subcellular localization of C22orf46. This approach for the first time confirmed that the open reading frame (ORF) FLJ2358 of C22orf46 encodes a nucleolar protein. Finally, RNA sequencing of C22orf46 knockout cells revealed altered expression of several immunomodulatory molecules, including well established factors relevant to T cell engagement, such as interleukin (IL)-10 or C-X-C motif chemokine ligand 11 (CXCL11), as well as transcriptome alterations correlating with a worse prognosis in lung cancer. In conclusion, the nucleolar protein encoded by C22orf46 plays a crucial role in antiapoptotic signaling and is associated with immune suppression in NSCLC. These findings provide a solid foundation for future studies to elucidate downstream pathways and interaction partners in detail. While the functional data on C22orf46 originates from in vitro experiments, further research in a more complex immune environment, such as a model organism, is required to test the transferability of the findings. The results of this thesis are suited to enhance the understanding of immune resistance but also patient stratification and could thereby provide greatly needed improvements for NSCLC patients in the future.

RUNX1 est un facteur de transcription essentiel pour l’hématopoïèse et joue un rôle important dans la fonction immunitaire. Des mutations surviennent dans ce gène chez 5 à 13% des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LMA) (RUNX1mut) et définissent un sous-groupe particulier de LMA associé à un pronostic défavorable. En conséquence, il est nécessaire de procéder à une meilleure caractérisation génétique et de concevoir des stratégies thérapeutiques plus efficaces pour ce sousgroupe particulier de LMA. Bien que la plupart des mutations trouvées dans le gène RUNX1 dans la LMA soient supposément acquises, des mutations germinales dans RUNX1 sont observées chez les patients atteints du syndrome plaquettaire familial avec prédisposition aux hémopathies malignes (RUNX1-FPD, FPD/AML). En outre, 44 % des individus atteints évoluent vers le développement d’une LMA. Suite au séquençage du transcriptome (RNA-Seq) d’échantillons de la cohorte Leucégène, nous avons montré que le dosage allélique de RUNX1 influence l’association avec des mutations coopérantes, le profil d’expression génique et la sensibilité aux médicaments dans les échantillons primaires de LMA RUNX1mut. Aussi, la validation des mutations trouvées chez RUNX1 a mené à la découverte que 30% des mutations identifiées dans notre cohorte de LMA étaient d’origine germinale, révélant une proportion plus élevée qu’attendue de cas de mutations RUNX1 familiales. Un crible chimique a, quant à lui, révélé que la plupart des échantillons RUNX1mut sont sensibles aux glucocorticoïdes (GCs) et nous avons confirmé que les GCs inhibent la prolifération des cellules de LMA et ce, via l’interaction avec le récepteur des glucocorticoïdes (Glucocorticoid Receptor, GR). De plus, nous avons observé que les échantillons contenant des mutations RUNX1 censées entraîner une faible activité résiduelle étaient plus sensibles aux GCs. Nous avons aussi observé que la co-association de certaines mutations, SRSF2mut par exemple, et les niveaux de GR contribuaient à la sensibilité aux GCs. Suite à cela, la sensibilité acquise aux GCs a été obtenue en régulant négativement l’expression de RUNX1 dans des cellules LMA humaines, ce qui a été accompagné par une régulation positive de GR. L’analyse de transcriptome induit par GC a révélé que la différenciation des cellules de LMA induite par GCs pourrait être un mécanisme en jeu dans la réponse antiproliférative associée à ces médicaments. Plus important encore, un criblage génomique fonctionnel a identifié le répresseur transcriptionnel PLZF (ZBTB16) comme un modulateur spécifique de la réponse aux GCs dans les cellules LMA sensibles et résistantes. Ces observations fournissent une caractérisation supplémentaire de la LMA RUNX1mut, soulignant l’importance de procéder à des tests germinaux pour les patients porteurs de mutations RUNX1 délétères. Nos résultats ont également identifié un nouveau rôle pour RUNX1 dans le réseau de signalisation de GR et montrent l’importance d’investiguer le repositionnement des GCs pour traiter la LMA RUNX1mut dans des modèles précliniques. Enfin, nous avons fourni des indications sur le mécanisme d’action des GCs, en montrant que PLZF s’avère un facteur important favorisant la résistance aux GCs dans la LMA. / RUNX1 is an essential transcription factor for definite hematopoiesis and plays important roles in immune function. Mutations in RUNX1 occur in 5-13% of Acute Myeloid Leukemia (AML) patients (RUNX1mut ) and are associated with adverse outcome, thus highlighting the need for better genetic characterization and for the design of efficient therapeutic strategies for this particular AML subgroup. Although most RUNX1 mutations in AML are believed to be acquired, germline RUNX1 mutations are observed in the familial platelet disorder with predisposition to hematologic malignancies (RUNX1-FPD, FPD/AML) in which about 44% of affected individuals progress to AML. By performing RNA-sequencing of the Leucegene collection, we revealed that RUNX1 allele dosage influences the association with cooperating mutations, gene expression profile, and drug sensitivity in RUNX1mut primary AML specimens. Validation of RUNX1 mutations led to the discovery that 30% of RUNX1 mutations in our AML cohort are of germline origin, indicating a greater than expected proportion of cases with familial RUNX1 mutations. Chemical screening showed that most RUNX1mut specimens are sensitive to glucocorticoids (GC) and we confirmed that GCs inhibit AML cell proliferation via interaction with the Glucocorticoid Receptor (GR). We observed that specimens harboring RUNX1 mutations expected to result in low residual RUNX1 activity were most sensitive to GCs, and that co-associating mutations, such as SRSF2mut, as well as GR levels contribute to GC-sensitivity. Accordingly, acquired GC-sensitivity was achieved by negatively regulating RUNX1 expression in human AML cells, which was accompanied by upregulation of the GR. GC-induced transcriptome analysis revealed that GC-induced differentiation of AML cells might be a mechanism at play in the antiproliferative response to these drugs. Most critically, functional genomic screening identified the transcriptional repressor PLZF (ZBTB16) as a specific modulator of the GC response in sensitive and resistant AML cells. These findings provide additional characterization of RUNX1mut AML, further stressing the importance of germline testing for patients carrying deleterious RUNX1 mutations. Our results also identified a novel role for RUNX1 in the GR signaling network and support the rationale of investigating GC repurposing for RUNX1mut AML in preclinical models. Finally, we provided insights into the mechanism of action of GCs, which positions PLZF as an important factor promoting resistance to glucocorticoids in AML.

L’anémie falciforme (AF) est une maladie monogénique dans laquelle la polymérisation d’une hémoglobine anormale (hémoglobine S, Hb S) entraine la déformation et la destruction du globule rouge. L’AF est associée à de nombreuses complications cliniques avec une très grande hétérogénéité dans son expression. En dehors de l’impact important de l’hémoglobine fœtale (Hb F), cette variabilité est mal comprise et peu d’outils sont disponibles afin d’identifier les patients à risque de complications. Nous avons utilisé différentes approches afin d’étudier les déterminants génétiques constitutionnels et somatiques de l’expression de l’AF ainsi que leur utilité dans la prise en charge des patients. Dans un premier temps, nous avons montré que les scores polygéniques pour les traits sanguins étaient moins performants chez les individus avec AF que sans. Nous avons montré que cette différence était en partie liée au poids d’autres déterminants génétiques et identifié un effet épistatique entre l’AF et le variant nul Duffy qui avait un effet très réduit en présence d’AF. Nous avons ensuite montré qu’un score polygénique simple pour l’Hb F expliquait une grande partie de sa variance et permettait d’améliorer la modélisation des crises de douleurs. Pour finir, à partir d’une réanalyse de la plus grande cohorte de patients avec AF ainsi que par randomisation mendélienne, nous avons montré l’effet causal protecteur de l’Hb F sur les accidents vasculaires cérébraux. Dans un second temps, nous avons analysé un crible génétique ciblé sur la densité du globule rouge, paramètre influençant la polymérisation de l’Hb S. Nous avons identifié de nombreux variants ayant un effet causal sur la densité à des fins de validation fonctionnelle. Pour finir, nous avons montré que l’AF influençait l’apparition d’une hématopoïèse clonale. Cette dernière était en effet détectée chez des patients plus jeunes et avait une prévalence plus élevée chez les individus avec AF que sans. En résumé, ce travail apporte un éclairage nouveau sur les conséquences de l’AF en montrant son influence sur l’expression de déterminants génétiques constitutionnels et somatiques. Ces déterminants représentent des outils pouvant permettre d’améliorer la prise en charge des patients avec AF. / Sickle cell disease (SCD) is a monogenic disorder leading to the polymerization of an abnormal hemoglobin (hemoglobin S, Hb S), that deforms the red cell, eventually leading to its destruction. SCD is associated with numerous complications with a great heterogeneity in its expression. Beside the important impact of fetal hemoglobin (Hb F), this variability is poorly understood, and few tools are available in the clinic to identify patients at high risk of complications. We used several approaches to study constitutional and somatic genetic determinants of SCD expression and their utility in patients’ management. First, we showed that polygenic scores for hematological traits were less performant in individuals with SCD than without. We showed that this difference was partly due to other genetic determinants and identified an epistatic effect between SCD and the Duffy antigen/chemokine receptor (DARC) null variant, which had a markedly reduced effect in SCD. We then showed that a simple polygenic score for Hb F explained a large part of the variance and improved modeling of pain crises. Based on the largest SCD cohort reanalysis and using Mendelian randomization, we showed that Hb F had a causal protective effect against stroke. Second, we analyzed a CRISPR-Cas9 targeted screening for red cell density, which influences Hb S polymerization. We identified many variants that influenced density as candidate to functional validations. Finally, we showed that SCD influenced the occurrence of clonal hematopoiesis. Clonal hematopoiesis was detected in younger patients and had an increased prevalence in individuals with SCD than without. In sum, this work shed light on a new category of consequences of SCD by showing its influence on the expression of constitutional and somatic determinants. These determinants are tools that can be used to improve the management of patients with SCD.