As respiratory syncytial virus (RSV) is a respiratory pathogen that causes significant morbidity and mortality in infants, there has always been great interest in the development of a vaccine. In the 1960s, children were immunized with formalin-inactivated (FI)-RSV vaccines. Not only did these vaccines fail to prevent infection, but in most cases they resulted in enhanced disease upon subsequent exposure to the virus. In the intervening years, studies in mice have led to the hypothesis that the enhanced disease is due to an aberrant Th2-biased immune response. Thus, we hypothesized that formulating FI-RSV vaccines with a Th1 promoting adjuvant, such as CpG oligoeoxynucleotides (ODN), would result in the induction of protective immunity against RSV without risk of deleterious effects. We observed in calves that parenterally delivered FI-bovine RSV (BRSV) formulated with CpG ODN resulted in a shift towards a Th1-biased or more balanced immune response that was protective against BRSV.<p> As RSV infects the lung mucosa, vaccines that induce mucosal immunity are desirable. Parenterally delivered vaccines typically induce systemic immunity with low mucosal immune response levels, whereas mucosally delivered vaccines induce systemic and mucosal immunity. However, upon mucosal delivery there is an increased chance of vaccine components being degraded or washed away prior to the induction of immunity. Thus, we added polyphosphazenes (PP) to our mucosal vaccine formulations. PP are synthetic polymers that form non-covalent complexes with other vaccine components, increasing their stability. Intranasally delivered FI-BRSV co-formulated with CpG ODN and PP performed better than FI-BRSV alone, or FI-BRSV formulated with either adjuvant individually, in terms of inducing protective immunity against BRSV in mice. Furthermore, mice that received intranasally-delivered FI-BRSV or BRSV F protein co-formulated with CpG ODN and PP developed higher levels of immunity and protection than mice that received parenterally delivered vaccines. Because of the similarities between BRSV and HRSV, co-formulation of intranasally delivered HRSV vaccines with CpG ODN and PP could prove important in the development of a safe vaccine against HRSV in humans.

As respiratory syncytial virus (RSV) is a respiratory pathogen that causes significant morbidity and mortality in infants, there has always been great interest in the development of a vaccine. In the 1960s, children were immunized with formalin-inactivated (FI)-RSV vaccines. Not only did these vaccines fail to prevent infection, but in most cases they resulted in enhanced disease upon subsequent exposure to the virus. In the intervening years, studies in mice have led to the hypothesis that the enhanced disease is due to an aberrant Th2-biased immune response. Thus, we hypothesized that formulating FI-RSV vaccines with a Th1 promoting adjuvant, such as CpG oligoeoxynucleotides (ODN), would result in the induction of protective immunity against RSV without risk of deleterious effects. We observed in calves that parenterally delivered FI-bovine RSV (BRSV) formulated with CpG ODN resulted in a shift towards a Th1-biased or more balanced immune response that was protective against BRSV.<p> As RSV infects the lung mucosa, vaccines that induce mucosal immunity are desirable. Parenterally delivered vaccines typically induce systemic immunity with low mucosal immune response levels, whereas mucosally delivered vaccines induce systemic and mucosal immunity. However, upon mucosal delivery there is an increased chance of vaccine components being degraded or washed away prior to the induction of immunity. Thus, we added polyphosphazenes (PP) to our mucosal vaccine formulations. PP are synthetic polymers that form non-covalent complexes with other vaccine components, increasing their stability. Intranasally delivered FI-BRSV co-formulated with CpG ODN and PP performed better than FI-BRSV alone, or FI-BRSV formulated with either adjuvant individually, in terms of inducing protective immunity against BRSV in mice. Furthermore, mice that received intranasally-delivered FI-BRSV or BRSV F protein co-formulated with CpG ODN and PP developed higher levels of immunity and protection than mice that received parenterally delivered vaccines. Because of the similarities between BRSV and HRSV, co-formulation of intranasally delivered HRSV vaccines with CpG ODN and PP could prove important in the development of a safe vaccine against HRSV in humans.

Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno respiratório que causa pneumonia, meningite e otite média. A vacina atualmente utilizada, composta de polissacarídeos capsulares (PS) derivados de 23 sorotipos diferentes, tem pouca eficácia em crianças, idosos e em pacientes imunocomprometidos. Vacinas com PS conjugados à proteína são mais eficientes, mas sua produção tem alto custo para ser amplamente utilizada. Além disso, o aumento de isolados clínicos de S. pneumoniae resistentes à antibióticos suporta o desenvolvimento de uma nova e mais eficiente vacina. O uso de bactérias ácido-lácticas (LAB) recombinantes vivas, como um sistema de apresentação do antígeno, representa uma estratégia promissora de vacinação de mucosa, já que são bactérias geralmente consideradas seguras (GRAS-status) e capazes de induzir resposta imune sistêmica e de mucosa. Neste trabalho, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei e Lactobacillus helveticus foram engenheirados para expressão constitutiva de PspA (proteína A de superfície de pneumococo), um importante fator de virulência de S. pneumoniae. As bactérias recombinantes foram capazes de expressar PspA em duas localizações celulares: intracelular ou ancorada à parede celular, como analisado por Western-blot, utilizando anticorpos policlonais produzidos contra PspA recombinante purificada de E. coli. A estimulação humoral do sistema imune foi avaliada em termos de produção de anticorpos anti-PspA do tipo IgG no soro ou do tipo IgA na saliva, após administração intranasal de LABs recombinantes em camundongos. / Streptococcus pneumoniae is an important respiratory pathogen that causes pneumonia, meningitis and otitis media. The current vaccine in use is composed of capsular polysaccharides (PS) derived from 23 different serotypes, and has little efficacy in young children, elderly and in patients with immunodeficiencies. PS-protein conjugate vaccines are more effective, but their production is expensive for widespread use. Moreover, the increase in antibiotic-resistant S. pneumoniae clinical isolates supports the development of new and more effective vaccines. The use of live recombinant lactic acid bacteria (LAB) as antigen delivery and presentation systems represents a promising strategy for mucosal vaccination, since they are generally regarded as safe bacteria (GRAS-status) and are able to elicit both systemic and mucosal immune responses. In this work, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei and Lactobacillus helveticus were engineered for constitutive expression of PspA (Pneumococcal Surface Protein A), an important S. pneumoniae virulence factor. Recombinant bacteria were able to express PspA in two cellular locations: intracellular or cell-surface exposed, as analyzed by Western-blot, using polyclonal antibodies produced against recombinant PspA purified from E. coli. Stimulation of humoral immune system was evaluated in terms of production of anti-PspA IgG in the sera or IgA in saliva, after intranasal administration of recombinant LAB in mice.

Influenza is a serious illness worldwide, causing high morbidity and mortality. 10-20% of world population fall ill with influenza each year and 250 000 - 500 000 people die annually. The most efficacious protection to date is vaccination. Current vaccines are efficient only one season because of fast mutation rate of influenza virus. The effort to create an effective vaccine faces lack of potent adjuvant, which can adequately stimulate and modulate immune system to protect organism from virus infection. Moreover, todays vaccines administered parenterally do not induce immune response on mucosal surfaces. Bacillus firmus, a Gram-positive non-pathogenic bacterium, has strong immmune-modulating properties and is able to induce cross-protection when administered with influenza virus antigens. Immunization with Bacillus firmus stimulates production of neutralizing antibodies, but other mechanisms of its action remain to be elucidated. To better understand the mechanisms how is antiviral immunity enhanced by Bacillus firmus (delipidated fraction, DBF), the effect of immunization with DBF only was studied on mouse model. In last decade it has become obvious that intranasal immunization can induce both systemic and mucosal immune response and in case of influenza it can induce cross-protection. Therefore...

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

A bactéria gram-positiva Streptococcus agalactiae do grupo B (GBS) faz parte da microbiota normal do trato geniturinário humano, sendo um organismo comensal do corpo da mulher. No entanto, em mulheres grávidas, quando há alterações na composição microbiana do canal vaginal, pode ocorrer a proliferação e a infecção pelo GBS. Este microrganismo, em sua forma patogênica oportunista, pode infectar o neonato durante o parto natural, assim como contribuir para infecções urinárias e uterinas durante a gestação. O GBS já foi identificado como um dos responsáveis pela alta taxa de mortalidade neonatal, sendo um dos principais agentes de infecção em recém-nascidos no mundo. Ele também pode ser a causa de infecções nas gestantes, levando a várias complicações, como corioamnionite, endometrite e infecções do trato urinário e do sítio cirúrgico. Pode haver comprometimento da gestação e do feto, com abortamento, morte fetal intrauterina e ruptura da membrana coriônica, levando a parto prematuro - que pode resultar em outras consequências graves. Este trabalho foi desenvolver um modelo vacinal para mucosa sublingual, utilizando o polissacarídeo capsular do Streptococcus agalactiae como antígeno, encapsulado em Nanopartículas de quitosana. Para o estudo de otimização dos parâmetros de fermentação, para aumentar a produtividade de cápsula polissacarídica (PS) presente na superfície celular, utilizou-se o Banco de Dados Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). A adição do suplemento L-Prolina foi o que propiciou a principio, maior relação entre crescimento bacteriano e formação de cápsula polissacarídica. A purificação e extração da cápsula polissacarídica foi realizada com etapas sucessivas de ultra filtração tangencial e precipitação alcóolica dos contaminantes. As caracterizações físico-químicas: difração de raios-X (DRX), cromatografia gasosa (CGMS), ressonância magnética (NMR) e determinação de açúcares pelo método fenol-sulfúrico, foram realizadas para identificação da composição e estrutura monossacarídica de açucares. O PS isolado apresenta ramificações de fucose, manose, glicose, galactose e N-acetil-glucosamina, apresentando estrutura amorfa. A liofilização do polissacarídeo foi realizada para fins de concentração e conservação. A encapsulação do polissacarídeo acoplada quimicamente com OVA, em uma Nanopartícula de quitosana, teve como finalidade aumentar a mucoadesividade e possibilitar maior absorção do antígeno entre as células da junção epitelial das mucosas sublinguais. A partir da análise de DLS (Espalhamento dinâmico de luz), as Nanopartículas apresentaram dimensões entre 200 a 400 nm e o Potencial Zeta acima de 20. O índice de polidispersão (PDI) está dentro do esperado (abaixo de 0.3). A capacidade de encapsulamento em relação à OVA foi de 92,8% dos grupos que continham PS. O teste IgG sérica total mostrou que o grupo G2 (Nanopartícula com Polissacarídeo e Proteína acoplados) foi o que teve maior reatividade no teste de ELISA, pela Análise de Variância (ANOVA) com ferramenta de Bonferrone. O teste sIgA mostrou que o grupo G2 (Nanopartícula com Polissacarídeo e Proteína acoplados) foi o que teve maior concentração de anticorpo sIgA total. Como resultado e conclusão, o polissacarídeo capsular do Streptococcus agalactiae é um bom candidato a antígeno vacinal. / Gram-positive bacteria Streptococcus agalactiae group B (GBS) is part of the normal microbiota of the human genitourinary tract, being a commensal organism of the female body. However, in pregnant women, when there are changes in the microbial composition of the vaginal canal, GBS proliferation and infection may occur. This microorganism, in its opportunistic pathogenic form, can infect the neonate during natural childbirth, as well as contribute to urinary and uterine infections during pregnancy. The GBS has already been identified as one of the responsible for the high neonatal mortality rate, being one of the main agents of infection in newborns in the world. It can also be the cause of infections in pregnant women, leading to various complications such as chorioamnionitis, endometritis, and urinary tract and surgical site infections. There may be pregnancy and fetal impairment, with abortion, fetal intrauterine death, and rupture of the chorionic membrane, leading to premature labor - which can result in other serious consequences. This work was to develop a vaccine model for sublingual mucosa using the capsular polysaccharide of Streptococcus agalactiae as antigen, encapsulated in chitosan nano particles. For the study of optimization of the fermentation parameters, the Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) database was used to increase the productivity of polysaccharide capsule (PS) present on the cell surface. The addition of the L-Proline supplement gave rise to a higher ratio between bacterial growth and polysaccharide capsule formation. The purification and extraction of the polysaccharide capsule was performed with successive stages of tangential ultrafiltration and alcoholic precipitation of the contaminants. The physicochemical characterization of X-ray diffraction (XRD), gas chromatography (CGMS), magnetic resonance (NMR) and determination of sugars by the phenol-sulfuric method were performed to identify the composition and monosaccharide structure of sugars. The isolated PS presents branches of fucose, mannose, glucose, galactose and N-acetyl-glucosamine, presenting amorphous structure. Lyophilization of the polysaccharide was performed for concentration and conservation purposes. The encapsulation of the polysaccharide coupled chemically with OVA in a chitosan nano particle was aimed at increasing mucoadhesiveness and allowing greater absorption of the antigen between the cells of the sublingual mucosal epithelial junction. From the analysis of DLS (dynamic light scattering), the nanoparticles presented dimensions between 200 to 400 nm and the Zeta potential above 20. The polydispersity index (PDI) is within the expected range (below 0.3). The encapsulation capacity for OVA was 92.8% of the groups containing PS. The total serum IgG test showed that the G2 group (Nano particle with Polysaccharide and Protein coupled) was the one that had the highest reactivity in the ELISA test, by Analysis of Variance (ANOVA) with Bonferrone tool. The sIgA test showed that the G2 group (Nanoparticle with Polysaccharide and Protein coupled) had the highest concentration of total sIgA antibody. As a result and conclusion, the capsular polysaccharide of Streptococcus agalactiae is a good candidate for vaccine antigen.

A bactéria gram-positiva Streptococcus agalactiae do grupo B (GBS) faz parte da microbiota normal do trato geniturinário humano, sendo um organismo comensal do corpo da mulher. No entanto, em mulheres grávidas, quando há alterações na composição microbiana do canal vaginal, pode ocorrer a proliferação e a infecção pelo GBS. Este microrganismo, em sua forma patogênica oportunista, pode infectar o neonato durante o parto natural, assim como contribuir para infecções urinárias e uterinas durante a gestação. O GBS já foi identificado como um dos responsáveis pela alta taxa de mortalidade neonatal, sendo um dos principais agentes de infecção em recém-nascidos no mundo. Ele também pode ser a causa de infecções nas gestantes, levando a várias complicações, como corioamnionite, endometrite e infecções do trato urinário e do sítio cirúrgico. Pode haver comprometimento da gestação e do feto, com abortamento, morte fetal intrauterina e ruptura da membrana coriônica, levando a parto prematuro - que pode resultar em outras consequências graves. Este trabalho foi desenvolver um modelo vacinal para mucosa sublingual, utilizando o polissacarídeo capsular do Streptococcus agalactiae como antígeno, encapsulado em Nanopartículas de quitosana. Para o estudo de otimização dos parâmetros de fermentação, para aumentar a produtividade de cápsula polissacarídica (PS) presente na superfície celular, utilizou-se o Banco de Dados Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). A adição do suplemento L-Prolina foi o que propiciou a principio, maior relação entre crescimento bacteriano e formação de cápsula polissacarídica. A purificação e extração da cápsula polissacarídica foi realizada com etapas sucessivas de ultra filtração tangencial e precipitação alcóolica dos contaminantes. As caracterizações físico-químicas: difração de raios-X (DRX), cromatografia gasosa (CGMS), ressonância magnética (NMR) e determinação de açúcares pelo método fenol-sulfúrico, foram realizadas para identificação da composição e estrutura monossacarídica de açucares. O PS isolado apresenta ramificações de fucose, manose, glicose, galactose e N-acetil-glucosamina, apresentando estrutura amorfa. A liofilização do polissacarídeo foi realizada para fins de concentração e conservação. A encapsulação do polissacarídeo acoplada quimicamente com OVA, em uma Nanopartícula de quitosana, teve como finalidade aumentar a mucoadesividade e possibilitar maior absorção do antígeno entre as células da junção epitelial das mucosas sublinguais. A partir da análise de DLS (Espalhamento dinâmico de luz), as Nanopartículas apresentaram dimensões entre 200 a 400 nm e o Potencial Zeta acima de 20. O índice de polidispersão (PDI) está dentro do esperado (abaixo de 0.3). A capacidade de encapsulamento em relação à OVA foi de 92,8% dos grupos que continham PS. O teste IgG sérica total mostrou que o grupo G2 (Nanopartícula com Polissacarídeo e Proteína acoplados) foi o que teve maior reatividade no teste de ELISA, pela Análise de Variância (ANOVA) com ferramenta de Bonferrone. O teste sIgA mostrou que o grupo G2 (Nanopartícula com Polissacarídeo e Proteína acoplados) foi o que teve maior concentração de anticorpo sIgA total. Como resultado e conclusão, o polissacarídeo capsular do Streptococcus agalactiae é um bom candidato a antígeno vacinal. / Gram-positive bacteria Streptococcus agalactiae group B (GBS) is part of the normal microbiota of the human genitourinary tract, being a commensal organism of the female body. However, in pregnant women, when there are changes in the microbial composition of the vaginal canal, GBS proliferation and infection may occur. This microorganism, in its opportunistic pathogenic form, can infect the neonate during natural childbirth, as well as contribute to urinary and uterine infections during pregnancy. The GBS has already been identified as one of the responsible for the high neonatal mortality rate, being one of the main agents of infection in newborns in the world. It can also be the cause of infections in pregnant women, leading to various complications such as chorioamnionitis, endometritis, and urinary tract and surgical site infections. There may be pregnancy and fetal impairment, with abortion, fetal intrauterine death, and rupture of the chorionic membrane, leading to premature labor - which can result in other serious consequences. This work was to develop a vaccine model for sublingual mucosa using the capsular polysaccharide of Streptococcus agalactiae as antigen, encapsulated in chitosan nano particles. For the study of optimization of the fermentation parameters, the Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) database was used to increase the productivity of polysaccharide capsule (PS) present on the cell surface. The addition of the L-Proline supplement gave rise to a higher ratio between bacterial growth and polysaccharide capsule formation. The purification and extraction of the polysaccharide capsule was performed with successive stages of tangential ultrafiltration and alcoholic precipitation of the contaminants. The physicochemical characterization of X-ray diffraction (XRD), gas chromatography (CGMS), magnetic resonance (NMR) and determination of sugars by the phenol-sulfuric method were performed to identify the composition and monosaccharide structure of sugars. The isolated PS presents branches of fucose, mannose, glucose, galactose and N-acetyl-glucosamine, presenting amorphous structure. Lyophilization of the polysaccharide was performed for concentration and conservation purposes. The encapsulation of the polysaccharide coupled chemically with OVA in a chitosan nano particle was aimed at increasing mucoadhesiveness and allowing greater absorption of the antigen between the cells of the sublingual mucosal epithelial junction. From the analysis of DLS (dynamic light scattering), the nanoparticles presented dimensions between 200 to 400 nm and the Zeta potential above 20. The polydispersity index (PDI) is within the expected range (below 0.3). The encapsulation capacity for OVA was 92.8% of the groups containing PS. The total serum IgG test showed that the G2 group (Nano particle with Polysaccharide and Protein coupled) was the one that had the highest reactivity in the ELISA test, by Analysis of Variance (ANOVA) with Bonferrone tool. The sIgA test showed that the G2 group (Nanoparticle with Polysaccharide and Protein coupled) had the highest concentration of total sIgA antibody. As a result and conclusion, the capsular polysaccharide of Streptococcus agalactiae is a good candidate for vaccine antigen.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

Chitosan is a biocompatible and biodegradable mucoadhesive polymer with unique advantages, such as the distinct trait of opening the junctions to allow paracellular transport of antigen and good tolerability. However, the poor solubility of chitosan in neutral or alkalinized media has restricted its applications in the pharmaceutical field. Chitosan can be easily carboxymethylated to improve its solubility in aqueous media, while its biodegradability and biocompatibility are preserved. Apart from this, carboxymethyl chitosan (CMCS) can be easily processed into nanoparticles which highlight its suitability and extensive usage for preparing different drug delivery formulations. The present study deals with the development and characterization of a delivery system based on CMCS nanoparticles using ovalbumin as model protein. We demonstrated that ovalbumin loaded nanoparticles were successfully synthetized using calcium chloride as a cross-linker by ionic gelation. The nanoparticles exhibited an average size of approximately 169 nm and presented a pseudo-spherical shape. The nanoparticles size increased according to the addition of CaCl2 due to the strong electrostatic attraction. During storage the nanoparticles size increased was attributed to swelling and aggregation. The loading efficiency of ovalbumin was found to be 17%. Confocal microscopy clearly showed the association between ovalbumin and CMCS chains into nanoparticles. Therefore, we suggest these nanoparticles can be considered as an attractive and promising carrier candidate for proteins and antigens. The major challenge that limits the use of such carriers is their instability in an aqueous medium. Thus, the next step of this work was to determine the robustness of several formulations using distinct freeze-drying protocols. This study demonstrated that mannitol in concentration of 10% (w/v) is well suited to preserve ovalbumin loaded CMCS nanocapsules from aggregation during lyophilization and subsequent reconstitution. Importantly, the results showed that an annealing step has a huge impact on porosity of freeze-dried cake by nearly complete crystallization of mannitol, once the crystalline matrix prevents the partial collapse and the formation of larger pores observed without annealing. Therefore, the usual observation that annealing increases the pore size due to growth of ice crystal size does not always apply, at least when crystallization of solute is involved. Since all characterizations and stability studies had been performed, the main purpose of this study was to develop a stable antigen delivery system for oral immunization using CMCS and inactivated rabies virus (RV) as the antigen. RV loaded nanoparticles was found to enhance both systemic (IgG) and local (IgA) immune responses against RV after oral delivery in mice. The effective doses 50% were 50-times higher than the negative controls, indicating that the immune response started only after the third boosting dose. Furthermore, enough neutralizing antibodies was produced to be protected against the harmful effects of the rabies virus. It is therefore concluded, that the CMCS nanoparticles formulated in this study, are suitable for oral vaccine delivery, and can be suggested as a promising delivery system for a diverse range of antigens as well as a gene/protein delivery system, especially for those positively charged. Since several approaches show that effective intervention in airway allergic inflammation can be achieved with allergen-activated interleukin-10-secreting cells, the final part of this work was dedicated to assessing whether IL-10 loaded chitosan nanoparticles (IL10-CSNPs) could be used as a possible inhalable therapeutic tool for preventing exacerbations in asthmatic patients. As positive controls, we also assess whether interleukin 17A and interleukin 9 have the ability to stimulate human airway smooth muscle (HASM) cell contractility using magnetic twisting cytometry (MTC). Significant decreased baseline cell stiffness was observed in HASM cells pre-treated with IL-10, but not with IL10-CSNPs, whereas treatment with IL-17A significantly enhanced baseline cell stiffening. Our findings reveal a previously unknown mechanism underlying immunotherapy for prevention and treatment of asthma. / A quitosana é um polímero mucoadesivo biocompatível e biodegradável, com vantagens únicas, tais como a característica distinta de abrir as junções que permitim o transporte paracelular de antígenos e boa tolerabilidade. No entanto, sua baixa solubilidade em meios neutros ou alcalinizados tem restringido suas aplicações no campo farmacêutico. A quitosana pode ser facilmente carboximetilada para melhorar de sua solubilidade em meios aquosos, enquanto sua biodegradabilidade e biocompatibilidade são preservadas. Além disso, a carboximetilquitosana (CMCS) pode ser facilmente processada na forma de nanopartículas, o que destaca sua adequabilidade para uso extensivo no preparo de sistemas de delivery de medicamentos. O presente estudo trata do desenvolvimento e caracterização de um sistema de delivery baseado em nanopartículas de CMCS utilizando ovalbumina como proteína modelo. Nós demonstramos que as nanopartículas carregadas com ovalbumina foram sintetizadas com sucesso utilizando cloreto de cálcio como agente de reticulação por gelificação iônica. As nanopartículas exibiram um tamanho médio de aproximadamente 169 nm e apresentaram uma forma pseudo-esférica. O tamanho das nanopartículas aumentou de acordo com a adição de CaCl2 devido à forte atração eletrostática. Durante o armazenamento, o tamanho aumentado das nanopartículas foi atribuído a incorporação de água e agregação. A eficiência de encapsulamento da ovalbumina foi de aproximadamente 17%. A microscopia confocal mostrou claramente a associação entre ovalbumina e a cadeias de CMCS nas nanopartículas. Sugerimos, portanto, que tal sistema pode ser considerado como candidato atraente e promissor para o carreamento de proteínas e antígenos. O principal desafio que limita o uso desses carreadores consiste na instabilidade em meio aquoso. Assim, o próximo passo deste trabalho foi determinar a robustez de várias formulações utilizandose diferentes protocolos de liofilização. Este estudo demonstrou que o manitol em uma concentração de 10% (p/v) é adequado para preservar da agregação as nanocápsulas de CMCS carregadas com ovalbumina durante a liofilização e subsequente reconstituição. Mais importante, os resultados mostraram que uma etapa de annealing tem um enorme impacto sobre a porosidade da amostra liofilizada devido a quase completa cristalização do manitol, uma vez que a matriz cristalina evita o colapso parcial e a formação de poros maiores observados na ausência do annealing. Portanto, a observação comum de que o annealing aumenta o tamanho doporos devido ao crescimento dos cristais de gelo nem sempre se aplica, pelo menos quando a cristalização de um soluto está envolvida. Uma vez que todas as caracterizações e estudos de estabilidade foram realizados, o principal objetivo deste estudo foi desenvolver um sistema estável de delivery de antígeno para imunização oral utilizando CMCS e vírus rábico inativado (RV) como antígeno. Verificou-se que as nanopartículas carregadas com RV aumentam as respostas imune sistêmica (IgG) e local (IgA) contra o RV após administração oral em camundongos. As doses efetivas 50% foram 50 vezes maiores que os controles negativos, indicando que a resposta imune foi iniciada apenas após a terceira dose da vacina. Além disso, foram produzidos anticorpos neutralizantes suficientes para proteção contra os efeitos nocivos do vírus rábico. Conclui-se, portanto, que as nanopartículas de CMCS formuladas neste estudo, são adequadas para o delivery oral de vacinas, e podem ser sugeridas como um sistema promissor de delivery para uma gama diversa de antígenos, bem como para o delivery de genes/proteínas, especialmente para aqueles carregados positivamente. Uma vez que diversas abordagens mostram que uma intervenção efetiva em casos de inflamação alérgica de vias aéreas pode ser conseguida por meio de células secretoras de interleucina 10 (IL-10) mediante ativação por alergenos, a parte final deste trabalho esteve dedicada a avaliação de nanopartículas de quitosana carregadas com IL-10 (IL10-CSNPs) como possível ferramenta terapêutica inalável para prevenção de exacerbações em pacientes asmáticos. Como controles positivos, avaliou-se adicionalmente se as interleucinas 17A (IL-17A) e 9 (IL-9) possuem a capacidade de estimular a contratilidade de células humanas de músculo liso de vias aéreas humanas (HASM) por meio de citometria de torção magnética (MTC). Uma diminuição significativa da rigidez celular basal foi observada em células HASM pré-tratadas com IL-10, mas não com IL10-CSNPs, enquanto que o tratamento com IL-17A aumentou significativamente a magnitude rigidez celular basal. Nossos resultados revelam um mecanismo previamente desconhecido subjacente à imunoterapia para prevenção e tratamento da asma.

La vaccination muqueuse est un moyen efficace de lutter contre les pathogènes qui utilisent les muqueuses comme porte d’entrée. Cependant, la vaccination muqueuse avec des antigènes non réplicatifs nécessite l’utilisation d’adjuvants. Les molécules de la famille de la toxine du choléra, l’entérotoxine thermolabile d’E.coli (LT), la toxine du choléra (CT) ainsi que le mutant LT-R192G et les sous-unités B non toxiques de ces toxines (LTB et CTB) ont été montrées augmenter les réponses immunitaires contre des antigènes coadministrés par voie muqueuse. Cependant leur mécanisme d’action est complexe et reste encore mal connu et des différences entre molécules entières et sous-unités B ont été rapportées ainsi que, pour une même molécule, des différences selon le modèle utilisé. Dans ce travail, nous avons étudié les effets de ces cinq molécules sur les réponses anticorps ainsi que sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d’immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirus (VLP-2/6). Chez les souris non immunisées, nous avons montré que ces molécules, à l’exception de la CTB, diminuent in vitro les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+Foxp3+, probablement par un mécanisme d’apoptose. Chez les souris immunisées, toutes les molécules étudiées induisent une même réponse anticorps sérique et fécale spécifique des VLP-2/6, qu’il s’agisse des molécules entières connues pour leur fort pouvoir adjuvant ou des sous-unités B qui, elles, ont été rapportées avoir un plus faible effet adjuvant voire un effet tolérogène dans certaines études. Concernant la réponse T CD4, les réponses spécifiques de l’antigène et de l’adjuvant ont été analysées. Des différences importantes ont été mises en évidence entre ces molécules. Notamment, seules les molécules entières (LT, LT-R192G et CT) induisent la production d’IL-2 et l’activation de lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3- mémoires spécifiques de l’antigène tout en permettant la mise en place d’une régulation médiée par des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (boucle d’autorégulation), qui pourraient jouer un rôle majeur lors d’une réponse secondaire, afin d’éviter les réactions inflammatoires délétères. Malgré ces différences, toutes les molécules étudiées induisent la production d’IL-17, suggérant le rôle majeur de cette cytokine dans l’effet adjuvant.L’influence de la voie d’administration sur ces effets est en cours d’étude grâce à la comparaison avec la voie intranasale / Mucosal immunization is an important goal of vaccine development to protect against pathogens that use mucosa as portals of entry. However, the use of non-replicating antigens requires the addition of adjuvants.Cholera-like enterotoxins, cholera toxin (CT) from Vibrio cholerae and the heat-labile enterotoxin (LT) from toxinogenic strains of E. coli, as well as the mutant LR-192G and their B subunits (CTB and LTB) have been shown to increase immune responses against unrelated co-administered antigens by mucosal routes. However, their mechanism of action is very complex and not completely understood and differences exist between holotoxins and B subunits and within molecules, differences exist between the models used.In this work, we have studied the effects of these five molecules on antibody responses and on CD4+ T cell responses in a murine model of intrarectal immunization using rotavirus-like particles (2/6-VLP). In non-immunized mice, we have shown that all molecules, except CTB, decreased CD4+CD25+Foxp3+ natural regulatory T cells, probably by induction of apoptosis.In immunized mice, all molecules induced similar VLP-2/6 specific systemic and fecal antibody responses, teither he holotoxins, which are well known for their strong adjuvanticity or their B subunits with a less strong adjuvanticity but with also a tolerogenic effect in some studies.Regarding the CD4+ T cell response, antigen- and adjuvant- specific responses have been analysed. Important differences have been highlighted between the molecules. Among others things, only whole toxins (LT, LT-R192G and CT) trigger IL-2 production and activation of antigen specific memory CD4+CD25+Foxp3- T cells and at the same time antigen specific CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells are activated which may control the effector response (Feedback loop regulation) and avoid deleterious inflammation. In spite of these differences, all studied molecules triggered IL-17 production, suggesting the major role of this cytokine in adjuvanticity. We are currently comparing the intrarectal and intranasl routes in order to evaluate the role played by the route of immunisation in different effects of these molecules