L’asthme est une maladie des bronches qui affecte environ 300 millions de personnes mondialement. L’asthme sévère représente 10% de cette population et certains de ces asthmatiques ont des symptômes incontrôlés et une éosinophilie pulmonaire persistante malgré la prise quotidienne de fortes doses de corticostéroïdes. Un nombre élevé d’éosinophiles dans les voies aériennes est associé avec des symptômes incontrôlés, des exacerbations fréquentes et la sévérité de l’asthme. L’identification des facteurs responsables de cette éosinophilie est donc primordiale. Par conséquent, le but général de ma thèse était de comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité. Le recrutement des éosinophiles du sang vers la lumière bronchique nécessite, entre autres, la participation de chimioattractants, de l’interleukine-5 et de molécules d’adhésion. Les éotaxines, CCL11, CCL24 et CCL26, sont des chimioattractants puissants et sélectifs pour l’éosinophile puisqu’elles se lient principalement sur le récepteur CCR3 présent sur l’éosinophile. Notre premier objectif était de comparer l’effet des différentes éotaxines sur la migration des éosinophiles d’asthmatiques et de sujets sains. Par la suite, nous avons focalisé nos études sur l’importance de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Étant donné que la CCL26 n’est pas exprimée chez les rongeurs, les études portant sur la CCL26 sont limitées comparativement à celles sur la CCL11 et la CCL24. À cet égard, notre deuxième objectif était d’évaluer le rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité et de caractériser l’effet de l’IL-13 sur la production de la CCL26 par les cellules épithéliales bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Ensuite, le troisième objectif était d’investiguer les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les cellules épithéliales bronchiques. Le quatrième objectif a permis d’évaluer l’importance de l’IL-5 dans le recrutement des éosinophiles, en étudiant l’effet de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles induite par des médiateurs lipidiques, tels que l’acide 5-oxo-éicosatétraénoïque, la prostaglandine D2 et le 2- arachidonoyl-glycérol. Finalement, pour le cinquième objectif, nous avons évalué l’importance de la périostine, une protéine impliquée dans l’adhésion des éosinophiles, dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme. Pour conclure, les résultats obtenus dans cette thèse favoriseront l’identification de possibles cibles thérapeutiques pour diminuer l’éosinophilie pulmonaire persistante observée chez les asthmatiques sévères.

La fusion entre des cellules de rate de souris immunisées avec des suspensions de tumeurs primaires mammaires humaines et des cellules d'une lignée de myélome de souris a permis d’obtenir des anticorps monoclonaux reconnaissant les cellules épithéliales. De cette banque d'anticorps, trois réagissent contre des filaments cytoplasmiques. La caractérisation de ces anticorps monoclonaux a été faite à l'aide de techniques d'immunohistochimie, immunofluorescence et immunoperoxydase, en utilisant différentes lignées cellulaires humaines et différents tissus épithéliaux et non-épithéliaux humains, afin de connaître la spécificité des anticorps. Le poids moléculaire relatif des protéines reconnues par les anticorps a été déterminé par immunodétection de type western après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose. Les résultats présentés dans ce mémoire concernent uniquement la caractérisation d'un anticorps monoclonal, 1B6, qui reconnaît spécifiquement plusieurs cytokératines. Par sa spécificité, cet anticorps est un marqueur des cytokératines, donc des cellules d'origine épithéliale normales et tumorales. Il représente ainsi un outil utile et unique à notre connaissance pour le diagnostic, en pathologie, de métastases d'origine épithéliale. Au niveau de la recherche fondamentale, il constitue un outil intéressant pour l'étude, entre autres de la différenciation cellulaire épithéliale et du rôle des cytokératines. / Montréal Trigonix inc. 2018

Introduction. La distribution asymétrique des composantes cellulaires au sein des cellules épithéliales résulte en une polarité apico-basale, laquelle divise la cellule en un domaine apical, un domaine latéral et un domaine basal. Cette polarité est essentielle à la physiologie des tissus épithéliaux et à l’homéostasie des organes. D’ailleurs, la perte de polarité épithéliale favorise la progression tumorale. Crumbs est une protéine de la polarité limitant la progression tumorale. Chez la drosophile, la protéine Yurt, associée au cortex cellulaire, inhibe Crumbs. De plus, les orthologues humains de Yurt – EPB41L5 et EPB41L4B – sont surexprimés dans plusieurs cancers. Leur surexpression amplifie la formation de métastases et est donc associée à un mauvais pronostic. Ces protéines seraient de bonnes cibles thérapeutiques, mais leurs modes de régulation sont peu connus. Nous émettons l’hypothèse que la localisation subcellulaire est importante pour la régulation de Yurt et ses orthologues. Ce projet vise à 1) définir les domaines de Yurt lui permettant de lier le cortex cellulaire et 2) déterminer les mécanismes régissant cette localisation. Méthodologie et résultats. Nous avons procédé à une analyse structure-fonction couplée à des immunofluorescences pour identifier les domaines protéiques responsables de la localisation corticale de Yurt. Diverses troncations et délétions au sein de la protéine nous ont permis d’identifier un motif basique et hydrophobe et un domaine Pleckstrin Homology-like au sein du domaine FERM permettant de cibler Yurt au cortex. Cette association se fait par des interactions électrostatiques avec des lipides membranaires. Conclusion. Nous avons mis en lumière de nouveaux mécanismes régulant la protéine Yurt. Ces connaissances pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en oncologie ciblant les orthologues humains de Yurt. / Introduction. Epithelial polarity is characterized by the asymmetrical distribution of cellular components in epithelial cells, which divides the cell into an apical domain, a lateral domain, and a basal domain. This polarity is essential for proper tissue function and the homeostasis of organs. Indeed, loss of epithelial polarity contributes to cancer progression. Crumbs is a polarity protein that limits tumour progression. In Drosophila, the protein Yurt, which associates to the cell cortex, limits the activity of Crumbs. Moreover, the human orthologs of Yurt – EPB41L5 and EPB41L4B – are overexpressed in many cancers. This overexpression increases metastasis formation and is thus associated with a poor prognosis. These proteins represent potential targets in the treatment of cancer, but little is known about their modes of regulation. We hypothesize that subcellular localization is important for the regulation of Yurt and its human orthologs. The aims of this project are to 1) define which domains of Yurt target it to the cell cortex and 2) determine the mechanisms responsible for this localization. Methodology and results. We performed a structure-function analysis coupled to immunofluorescence to identify the protein domains responsible for the cortical localization of Yurt. Many truncations and deletions were tested and allowed the identification of one basic and hydrophobic motif along with a Pleckstrin Homology-like domain within the FERM domain that are essential for Yurt’s cortical localization. This localization is mediated by electrostatic interactions with membrane lipids. Conclusion. We have successfully identified novel mechanisms regulating Yurt localization. These findings could contribute to the development of new therapeutics in oncology that target the human orthologs of Yurt.

Le régulateur transcriptionnel Cux1 est impliqué dans le processus de migration des cellules cancéreuses. Dans un modèle d’inflammation intestinale de type colite expérimentale, l’absence de Cux1 entraîne une perte de la restitution de l'épithélium intestinal. Ceci nous a amenés à poser l’hypothèse que Cux1 serait fonctionnellement impliqué dans le processus de migration cellulaire lors de la régénération épithéliale en contexte de maladies inflammatoires intestinales. En utilisant des conditions de culture limitant la prolifération, une diminution de la réponse migratoire des cellules épithéliales a été observée en absence de Cux1. Cette diminution de migration a été accompagnée d’une perte du remaniement du cytosquelette d'actine et d’une diminution du nombre de lamellipodes formés au front de migration. En vérifiant l’activité des voies classiques de migration RhoA et Rac1, une modulation des modifications post-traductionnelles sur chacune des protéines terminales de ces voies a été observée. Une augmentation du niveau de phosphorylation inhibitrice sur sérine 3 de la cofiline et une diminution de la phosphorylation activatrice sur la protéine ribosomale S6 ont été observées en absence de Cux1. Toutefois, ces protéines ne sont pas des cibles transcriptionnelles du régulateur Cux1. Une analyse par micropuce a permis d’identifier de nouveaux substrats de Cux1 pertinents au processus de restitution épithéliale. Ainsi, les gènes FgfR2, Shc4 et Vav2 ont été découverts pour être impliqués autant au niveau cellulaire que physiologique en contexte inflammatoire. De plus, Cux1 semble en mesure de cibler directement ces trois promoteurs. Un essai de récupération du phénotype en inhibant la voie RhoA a permis d'observer un rétablissement partiel de la réponse migratoire des cellules n’exprimant pas Cux1, suggérant que Vav2 et la voie Rac1 auraient une importance dans cette restitution épithéliale intestinale. Des modulations de gènes impliqués dans la restitution ont été observées par séquençage des ARNs chez des souris mutantes pour Cux1.

La sécheresse oculaire est une maladie multifactorielle invalidante affectant la qualité de vie des patients. Elle constitue un réel problème de santé publique du fait sa prévalence élevée chez les personnes âgées. Les étiologies et les facteurs de risque nombreux de cette pathologie déclenchent une succession de conséquences créant un cercle vicieux autoentretenu où l’instabilité du film lacrymal et l’hyperosmolarité jouent un rôle central. L’intégrité de la surface oculaire est un élément déterminant qui influence l’impact de l’hyperosmolarité directement au niveau des cellules épithéliales conjonctivales. Le chlorure de benzalkonium (BAK), principal conservateur des collyres, altère l’intégrité du film lacrymal provoquant une sécheresse oculaire chez les patients. Le but de notre travail était au travers de la mise au point d’un modèle de sécheresse oculaire in vitro, de comprendre la part respective et combinée des effets du xénobiotique et de la composante physiopathologique sur le comportement des cellules conjonctivales. L’hyperosmolarité et le BAK entrainent tous les deux, et à des niveaux d’intensité différents, des réponses cytotoxiques avec induction de stress oxydant, de conditions pro-inflammatoires (chimiokine CCL2, expression de HLA DR) et d’apoptose sur les cellules conjonctivales. L’adjonction de BAK à ces conditions potentialise les effets délétères déjà mis en évidence avec l’hyperosmolarité seule. Ce travail montre pour la première fois au niveau de la surface oculaire les effets potentialisateurs d’un toxique en conditions physiopathologiques. Ce modèle hyperosmolaire de sécheresse oculaire représente un nouvel outil pour analyser la toxicité de facteurs de risque environnementaux ou iatrogènes de manière fiable et reproductible. / Dry eye is a multifactorial disease affecting patients’ quality of life and currently constitutes a public health problem because of its high prevalence in elderly people. The etiologies and risk factors of this disease induce a series of consequences creating a self-perpetuating vicious cycle where tear film instability and hyperosmolarity play a central role. The integrity of the ocular surface is a determining factor that influences the impact of hyperosmolarity directly at the level of conjunctival epithelial cells. Benzalkonium chloride (BAK), the mainly used eye drop preservative, alters tear film integrity and may induce or favor dry eye. The purpose of this study was, besides developing an in vitro dry eye model, to describe the respective and combined effects of the xenobiotics and the pathophysiological component on the conjunctival cell behavior. Hyperosmolarity and BAK, although at different intensity levels, both induce cytotoxic responses with oxidative stress, proinflammatory responses (CCL2 chemokine, expression of HLA-DR) and apoptosis in conjunctival cells. The addition of BAK to these hyperosmolar conditions potentiates the deleterious effects already identified with hyperosmolarity alone. This work reports for the first time the potentiating effects of a toxic in pathophysiological conditions. This hyperosmolar dry eye model offers a new reliable and reproducible tool to investigate the environmental and iatrogenic toxicity on ocular cells in vitro.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 juillet 2023) / Au cours du développement et lors du maintien de l'homéostasie chez les adultes, divers processus sont nécessaires pour maintenir l'architecture tissulaire. Par exemple, dans les tissus épithéliaux, la distribution asymétrique des composantes cellulaires menant à la formation de domaines distincts ainsi que la formation des jonctions sont des processus cellulaires clés qui doivent être finement régulés pour maintenir la structure et la fonction épithéliales. La dérégulation de l'un de ces processus peut entraîner des défauts dans l'architecture épithéliale et contribuer à la progression de maladies comme le cancer. Dans les dernières années, un nombre croissant d'études ont mis en évidence un lien entre la signalisation des récepteurs EPH et le développement et le maintien de l'homéostasie des tissus épithéliaux. Notamment, les récepteurs EPH interagissent avec des protéines impliquées dans des processus tels que l'établissement et le maintien de la polarité des cellules épithéliales et des jonctions cellulaires. La dérégulation de la signalisation des récepteurs EPH a aussi été associée à des défauts d'orientation de division cellulaire. Nous avons émis l'hypothèse qu'un sous-groupe de récepteurs EPH coordonne la morphogénèse épithéliale en interagissant avec des protéines impliquées dans la polarité apico-basale. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé la culture tridimensionnelle de cellules Caco-2, une lignée du cancer du côlon. Nous avons d'abord montré qu'au moins deux des quatorze récepteurs EPH (EPHA1 et -B4) sont exprimés dans des cellules épithéliales Caco-2 polarisées. L'analyse de la localisation subcellulaire de ces deux récepteurs dans les sphéroïdes de Caco-2 a révélé qu'EPHA1 et EPHB4 sont localisés au domaine basolatéral. Pour comprendre le rôle des récepteurs EPH dans la morphogenèse épithéliale, nous avons effectué des expériences de perte de fonction. Nos résultats montrent que la déplétion d'EPHA1 ou EPHB4 mène à la formation de sphéroïdes désorganisés. Nous avons identifié les domaines des récepteurs EPH responsables de la coordination de la morphogénèse épithéliale dans les sphéroïdes de Caco-2 par analyse structure-fonction. Nos résultats montrent que le domaine intracellulaire d'EPHA1 et plus particulièrement sa région incluant le domaine de liaison aux protéines SAM et le motif PDZ est responsable du rôle d'EPHA1 dans l'organisation des sphéroïdes épithéliaux. En ce qui concerne EPHB4, nos résultats suggèrent que les défauts de morphogénèse dans les sphéroïdes de Caco-2 dépendent plutôt de son domaine extracellulaire. Pour mieux comprendre le phénotype associé à la perte de fonction d'EPHA1 et EPHB4, nous avons exploré deux processus qui, lorsqu'ils sont dérégulés, peuvent entraîner des défauts dans l'organisation tissulaire : le maintien de la polarité apico-basale et l'orientation du fuseau mitotique. Plutôt que d'affecter l'intégrité de la polarité apico-basale, nos résultats suggèrent que le phénotype de perte de fonction provient de défauts dans l'orientation du fuseau mitotique de cellules en division, ce qui est crucial pour le maintien d'une monocouche cellulaire pendant la morphogenèse du tissu épithélial. En conclusion, nos résultats montrent qu'EPHA1 et EPHB4 joue un rôle important dans la morphogénèse épithéliale des sphéroïdes de Caco-2 via la régulation de l'orientation du fuseau mitotique. Toutefois, EPHA1 et EPHB4 régulent ce processus selon deux mécanismes moléculaires différents. Puisque l'organisation en monocouche est perdue dans les tissus cancéreux, nos travaux pourraient permettre de mieux comprendre comment ces récepteurs contribuent à la morphogenèse épithéliale et à l'homéostasie dans le contexte de la progression du cancer. / During development and adult tissue homeostasis, various processes are required to maintain tissue architecture. For instance, in epithelial tissues, coordination of apical and basal membrane morphogenesis and cell-cell adhesion are key molecular mechanisms that must be tightly regulated to maintain epithelial structure and function. Dysregulation of any of these processes can lead to defects in epithelial architecture and contribute to the progression of diseases such as cancer. In the past years, a growing number of studies have demonstrated a link between EPH-EFN signaling and the development and maintenance of epithelial tissue homeostasis. In particular, several partners of the EPH receptors have been implicated in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity and cell junctions. Dysregulation of EPH-EFN signaling has also been associated with defects in the orientation of cell divisions. We hypothesized that a subgroup of EPH receptors coordinates epithelial morphogenesis by interacting with proteins involved in apical-basal polarity. To test this hypothesis, we used three-dimensional culture of Caco-2 epithelial cells, a colon-cancer cell line. We first showed that at least two of the fourteen EPH receptors (EPHA1 and -B4) are expressed in polarized Caco-2 cells. Analysis of the subcellular localization of these two receptors in Caco-2 spheroids revealed that EPHA1 and EPHB4 were localized to the basolateral domain. To further study the role of EPH receptors in epithelial morphogenesis, we have performed loss-of-function experiments. These showed that either EPHA1 or EPHB4 depletion led to the formation of disorganized spheroids. We identified the structural domains of the EPH receptors responsible for coordinating epithelial morphogenesis in Caco-2 spheroids using a structure-function approach. Our results indicated that the intracellular domain of EPHA1 and more particularly the region including the SAM domain and the PDZ motif was required for the formation of normal epithelial spheroids. In contrast, our results suggested that the correct formation of Caco-2 spheroids required the extracellular domain of EPHB4. To better understand the phenotype associated with the loss of function of EPHA1 and EPHB4, we explored two processes that, when deregulated, can lead to defects in tissue organization: maintenance of apical-basal polarity and mitotic spindle orientation. Rather than affecting the integrity of the apical-basal polarity, our results suggested that the loss-of-function phenotype stems from defects in mitotic spindle orientation in dividing cells, which is known to be crucial for the maintenance of a cell monolayer during epithelial tissue morphogenesis. In conclusion, our results showed that EPHA1 and EPHB4 played an important role in Caco-2 spheroids epithelial morphogenesis via the regulation of mitotic spindle orientation. However, EPHA1 and EPHB4 regulate this process by different molecular mechanisms. Since monolayer organization is lost in cancerous tissues, our work could provide insight into how these receptors contribute to epithelial morphogenesis and homeostasis in the context of cancer progression.

Objectif: Crumbs3 (CRB3) est essentielle pour la polarité épithéliale et la formation des jonctions serrées. Deux isoformes de CRB3 ont été identifiés, soit CRB3A et CRB3B. Les fonctions et la localisation de ces protéines demeurent méconnues. Notre objectif était d'étudier la localisation de ces protéines dans différentes lignées épithéliales et leur fonction par identification de partenaires d'interaction. Méthodes: Nous avons produit un gène de fusion HIS-CRB3A qui a été exprimé dans des cellules d'insectes, puis le produit de ce gène a été purifié à l'aide de billes magnétiques. La protéine HIS-CRB3 isolée a servie d'appât pour isoler des partenaires d'interaction par spectrométrie de masse à partir d'un homogénat de cellules épithéliales humaines (Caco-2). Résultats : L'analyse en spectrométrie de masse a révélé que plusieurs importines et exportines interagissent avec CRB3, suggérant que CRB3 puisse se localiser au niveau du noyau. En accord avec cette hypothèse, l'analyse de la séquence de CRB3 montre un NLS et un NES potentiels. De plus, par immunofluorescence et fractionnement cellulaire, nous avons montré que CRB3B se situe au niveau du noyau. Par contre, la localisation de CRB3A est restreinte à la membrane plasmique. Conclusion : Nous avons identifié des partenaires d'interaction de CRB3 qui laisse présager des fonctions insoupçonnées pour cette protéine.

Les feuillets de cellules épidermiques cultivés en laboratoire sont des substituts cutanés pour le traitement des grands brûlés. Notre équipe a démontré que la couche nourricière de fibrobiastes (CNF) murine accroît la survie des kératinocytes (cellules épidermiques) humains en y maintenant l'expression du facteur de transcription Spl. Notre hypothèse est que l'utilisation d'une CNF irradiée accroit la survie des cellules souches épithéliales cutanées en culture, ce qui permet d'augmenter le potentiel de prolifération et de retarder la différenciation des kératinocytes en culture. Le but de ce projet est d'analyser l'effet des CNF d'origine humaine sur la prolifération et la différenciation des kératinocytes et de comprendre les mécanismes par lesquels Spl influence la survie de ces cellules, notamment en évaluant la régulation de la transcriptase inverse de la télomérase (hTERT). Des kératinocytes ont été cultivés sur une CNF humaine ou murine irradiées ainsi que sans CNF pendant une vingtaine de passages ou jusqu'à différenciation terminale. Des extraits de protéines, d'ARN et de cellules ont été prélevés à chaque passage. Le niveau d'expression de la protéine Spl ainsi que l'activité de la télomérase ont été analysés en fonction des passages. Les résultats obtenus montrent que la CNF humaine possède des caractéristiques similaires à la CNF murine tel que vérifié par le nombre de passages atteints avant différenciation ainsi que par l'expression du facteur de transcription Spl. De plus, il existe une forte corrélation entre l'expression de Spl et le taux de croissance des cellules, ce qui suggère un mécanisme par lequel Spl aiderait la prolifération des kératinocytes. Sans couche nourricière, l'activité de la télomérase et l'expression de Spl sont nettement diminuées. Par contre, les CNF humaines permettent une bonne prolifération des kératinocytes ainsi que le maintien de l'expression de Spl et de l'activité de la télomérase. En conclusion, nos résultats suggèrent que la survie des cellules épithéliales souches en culture passe par des mécanismes moléculaires impliquant Spl et le maintien de l'activité de la télomérase.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019. / Les fonctions des cellules épithéliales reposent sur la distribution asymétrique de différents constituants cellulaires, organisation structurale nommée polarité épithéliale. Plus de 80% des cancers sont d’origine épithéliale, et l’altération de la polarité cellulaire contribue à la progression du cancer. L’élucidation des mécanismes moléculaires contrôlant la polarité épithéliale est donc primordiale. La protéine Yurt permet de maintenir l’intégrité de la membrane latérale et de limiter la croissance de la membrane apicale dans les épithéliums polarisés. Les orthologues humains de Yurt, EHM2 et EPB41L5, sont surexprimés dans des cellules cancéreuses hautement métastatiques et sont associés à un mauvais pronostic. EPB41L5 est aussi impliquée dans la transition épithélio-mésenchymateuse et dans la formation des métastases. Le développement d’inhibiteurs de EHM2 et EPB41L5 pourrait donc contrer la progression tumorale. L’objectif général de mon doctorat était de mieux comprendre les modes de régulation de ces protéines, ce qui est un préalable essentiel pour la mise en place de stratégies thérapeutiques dans le contexte du cancer. Durant la polarisation des cellules épithéliales, Yurt est confinée à la membrane latérale et assure l’intégrité de ce domaine membranaire en réprimant la machinerie apicale. Aux stades tardifs de l’embryogenèse, le recrutement apical de Yurt permet de restreindre la taille de la membrane apicale. Néanmoins, les mécanismes moléculaires soutenant la dynamique spatiotemporelle de Yurt, et les mécanismes précis par lesquels Yurt inhibe la machinerie apicale étaient non définis. Au cours de mon doctorat, nous avons montré que la kinase apicale aPKC phosphoryle Yurt pour empêcher sa localisation apicale prématurée. Une version non phosphorylable de Yurt démantèle le domaine apical, indiquant que l’exclusion apicale de Yurt dépendante de aPKC est cruciale pour la polarité épithéliale. En retour, Yurt antagonise les fonctions de aPKC pour prévenir l’apicalisation de la membrane plasmique. La capacité de Yurt à lier et restreindre les fonctions de aPKC est centrale pour son rôle dans la polarité épithéliale. En effet, déléter le site de liaison à aPKC neutralise l’activité de Yurt. Ainsi, Yurt et aPKC sont impliquées dans une relation antagoniste bidirectionnelle qui contribue à la ségrégation des domaines membranaires, ce qui soutient l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. iv Ensuite, pour comprendre plus en profondeur comment est modulée l’activité de Yurt, nous avons investigué les propriétés biochimiques de Yurt et de ses orthologues. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines à domaine « Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin » (FERM). Elles possèdent également un domaine adjacent à FERM (FA pour « FERM-adjacent »), définissant un sous-groupe de la famille FERM. Certaines protéines de cette famille ont la capacité de former des homo-oligomères, ce qui module leurs fonctions. Nos résultats indiquent que Yurt et EPB41L5 sont également capables de s’homo-oligomériser. Nous avons démontré que l’unité FERM-FA définit une interface oligomérique. De plus, nous avons montré que la phénylalanine 281 (F281) et le tryptophane 283 (W283) sont particulièrement importants pour l’interaction homotypique de Yurt. En effet, la substitution de ces résidus en arginine (R) abolit l’interaction homotypique de Yurt in vitro. Nous avons alors généré une lignée de drosophile exprimant YurtF281R, W283R à partir du locus endogène yurt grâce à la technique CRISPR/Cas9. Les embryons exprimant YurtF281R, W283R sont phénotypiquement similaires aux embryons complètement dépourvus de Yurt, suggérant fortement que la multimérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Nous avons également démontré que la kinase aPKC déstabilise l’oligomère de Yurt conduisant à une répression de ses fonctions. Ceci révèle un mécanisme par lequel cette kinase supporte la formation du domaine apical. En résumé, mes travaux de doctorat ont permis de décrypter le mécanisme d’exclusion apicale de Yurt par la kinase aPKC dans les cellules épithéliales immatures. Nous avons également mis en évidence une relation antagoniste bidirectionnelle entre Yurt et aPKC. Ceci contribue à maintenir la bonne ségrégation des domaines membranaires, et ainsi soutenir l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. De plus, nous avons démontré que l’oligomérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Cette propriété biochimique est conservée chez son orthologue humain EPB41L5. Ceci offre donc une opportunité unique dans la lutte contre le cancer. En effet, des composés interférant avec cette oligomérisation pourraient limiter l’activité de EPB41L5, et ainsi combattre la progression tumorale. / The polarized architecture of epithelial cells along the apical-basal axis is crucial for epithelial tissue morphogenesis, physiology and homeostasis. Over 80% of cancers are of epithelial origin, and the alteration of cell polarity contributes to cancer progression. Elucidating the molecular mechanisms controlling epithelial polarity is therefore essential. The protein Yurt stabilizes the lateral membrane and limits apical membrane growth in polarized epithelia. The human Yurt orthologs EHM2 and EPB41L5 are overexpressed in many cancers. This correlates with poor outcome for patients. EPB41L5 also supports epithelial-mesenchymal transition and metastasis. Elaborating strategies limiting EHM2 and EPB41L5 activity is of special interest in oncology. The general objective of my PhD was to decipher the regulation of these proteins to pave the way for new therapeutic strategies for the treatment of cancer. During organogenesis, Yurt is confined to the lateral membrane and supports the stability of this membrane domain by repressing the apical machinery. At later stages of embryogenesis, the apical recruitment of Yurt establishes a local negative regulatory feedback loop that restricts the size of the apical membrane. However, the molecular basis sustaining the spatiotemporal dynamics of Yurt, and the precise mechanisms by which Yurt inhibits apical promoting factors were undefined. During the first part of my Ph.D., we demonstrated that aPKC phosphorylates Yurt to prevent its premature apical localization. A non-phosphorylatable version of Yurt dominantly dismantles the apical domain, showing that its aPKC-mediated exclusion is crucial for epithelial cell polarity. In return, Yurt counteracts aPKC functions to prevent apicalization of the plasma membrane. The ability of Yurt to bind and restrain aPKC signaling is central for its role in polarity, as removal of the aPKC binding site neutralizes Yurt activity. Thus, Yurt and aPKC are involved in a reciprocal antagonistic regulatory loop that contributes to the segregation of discrete and mutually exclusive membrane domains, thereby sustaining the functional architecture of epithelial tissues. To further define how Yurt activity is modulated, we investigated the biochemical properties of Yurt and its orthologs. Yurt and EPB41L5 belong to the Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin (FERM) domain protein family. These proteins also contain a FERM-adjacent (FA) domain which defines a subfamily of FERM proteins. Some proteins of this superfamily have the ability to multimerize. Our results indicate that both Yurt and EPB41L5 oligomerize. Our data also establish that the FERM-FA unit forms an oligomeric interface, and that multimerization of Yurt is crucial for its function in epithelial cell polarity regulation. Finally, we demonstrated that aPKC destabilizes the Yurt oligomer to repress its functions, thereby revealing a mechanism through which this kinase supports apical domain formation. In summary, my Ph.D. work has deciphered the mechanism sustaining the apical exclusion of Yurt by aPKC in immature epithelial cells. We have also demonstrated a reciprocal antagonistic regulatory loop between Yurt and aPKC. This contributes to maintaining the proper segregation of membrane domains, and thus supporting the functional architecture of epithelial tissues. In addition, we have demonstrated that Yurt oligomerization is crucial for its in vivo functions. This biochemical property is conserved in its human ortholog EPB41L5. This offers a unique opportunity in the fight against cancer. Indeed, compounds interfering with this oligomerization could limit the activity of EPB41L5, and thus counteract tumor progression.

Titre de l'écran-titre (visionné le 1er mai 2023) / Introduction. La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est associée à la perte de polarité épithéliale et à l'acquisition d'une invasion accrue. La polarité épithéliale divise les cellules épithéliales en domaines apical, latéral et basal, et elle est importante pour le bon fonctionnement des tissus. La protéine Drosophila Yurt (Yrt), localisée corticalement, oligomérise via ses domaines FERM et FERM-FA et est importante dans la régulation de la polarité épithéliale. Ses orthologues humains, EPB41L5 et EPB41L4B, sont surexprimés dans plusieurs cancers épithéliaux. De plus, leur surexpression favorise la formation de métastases et est associée à un mauvais pronostic. Ainsi, ces protéines seraient des cibles importantes pour limiter les métastases. Cependant, la régulation de Yrt n'est pas encore complètement élucidée. Nous avons émis l'hypothèse que la localisation subcellulaire est cruciale pour la fonction de Yrt et de ses orthologues humains. Le but de cette étude était d'élucider les domaines structuraux de Yrt lui permettant de s'associer au cortex cellulaire et les mécanismes régulant cette localisation. Méthodologie. Une analyse structure-fonction couplée à l'immunofluorescence a été réalisée pour identifier les domaines responsables de la localisation corticale de Yrt in vivo. De plus, la quantification du signal cortical et cytoplasmique des différentes constructions Yrt a été effectuée. L'impact fonctionnel a été analysé à partir de cuticules embryonnaires. Résultats. Nous avons découvert que le motif basique et hydrophobe (BH) dans les lobes F1 et F3 du domaine FERM de Yrt influence son ciblage cortical. Les motifs BH contiennent des résidus chargés positivement qui interagissent avec les phospholipides membranaires chargés négativement par le biais d'interactions électrostatiques. De plus, nous avons constaté que lorsque Yrt est mal localisé au cortex cellulaire, sa fonction est affectée. Conclusion. Nos résultats mettent en évidence le rôle important du ciblage de la membrane électrostatique du Yrt. Ces connaissances pourraient ainsi contribuer au développement de stratégies thérapeutiques innovantes contre les orthologues humains Yrt dans la tumorigenèse. / Introduction. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is associated with the loss of epithelial polarity and the acquisition of enhanced invasion. Epithelial polarity divides epithelial cells into apical, lateral, and basal domains, and it is important for proper tissue function. The cortically localized Drosophila Yurt (Yrt) protein oligomerizes via its FERM and FERM-FA domains in regulating epithelial polarity. Its human orthologs, EPB41L5 and EPB41L4B, are over expressed in several epithelial cancers. Furthermore, their overexpression promotes metastasis leading to overall poor survival and prognosis. Thus, these proteins would be significant targets in limiting metastasis. However, the exact mode of Yrt regulation is yet to be fully elucidated. We hypothesized that subcellular localization is crucial for Yrt regulation and its human orthologs. Thus, we elucidated the domains and subdomains of Yrt allowing it to target the cell cortex and the mechanisms regulating this localization. Methods. A structure-function analysis was performed coupled with immunofluorescence to identify the domains responsible for the cortical localization of Yrt in vivo. Also, we quantified the signal intensity at the cortical and cytoplasmic region for the various Yrt constructs tested. We further analyzed the functional impact using embryonic cuticle. Results. We discovered that the basic and hydrophobic motifs within the F1 and F3 lobes of the FERM domain influences Yrt cortical targeting. These motifs contain positively charged residues that interact with negatively charged membrane phospholipids through electrostatic interactions. Moreover, we found that when Yrt is mislocalized from the cell cortex, its function is impacted. Conclusion. Our findings highlight the important roles of electrostatics and oligomerization in the cortical targeting of the Yrt. This knowledge could thus contribute to the development of innovative therapeutic strategies against Yrt human orthologs in tumorigenesis.