L’asthme est une maladie des bronches qui affecte environ 300 millions de personnes mondialement. L’asthme sévère représente 10% de cette population et certains de ces asthmatiques ont des symptômes incontrôlés et une éosinophilie pulmonaire persistante malgré la prise quotidienne de fortes doses de corticostéroïdes. Un nombre élevé d’éosinophiles dans les voies aériennes est associé avec des symptômes incontrôlés, des exacerbations fréquentes et la sévérité de l’asthme. L’identification des facteurs responsables de cette éosinophilie est donc primordiale. Par conséquent, le but général de ma thèse était de comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité. Le recrutement des éosinophiles du sang vers la lumière bronchique nécessite, entre autres, la participation de chimioattractants, de l’interleukine-5 et de molécules d’adhésion. Les éotaxines, CCL11, CCL24 et CCL26, sont des chimioattractants puissants et sélectifs pour l’éosinophile puisqu’elles se lient principalement sur le récepteur CCR3 présent sur l’éosinophile. Notre premier objectif était de comparer l’effet des différentes éotaxines sur la migration des éosinophiles d’asthmatiques et de sujets sains. Par la suite, nous avons focalisé nos études sur l’importance de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Étant donné que la CCL26 n’est pas exprimée chez les rongeurs, les études portant sur la CCL26 sont limitées comparativement à celles sur la CCL11 et la CCL24. À cet égard, notre deuxième objectif était d’évaluer le rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité et de caractériser l’effet de l’IL-13 sur la production de la CCL26 par les cellules épithéliales bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Ensuite, le troisième objectif était d’investiguer les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les cellules épithéliales bronchiques. Le quatrième objectif a permis d’évaluer l’importance de l’IL-5 dans le recrutement des éosinophiles, en étudiant l’effet de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles induite par des médiateurs lipidiques, tels que l’acide 5-oxo-éicosatétraénoïque, la prostaglandine D2 et le 2- arachidonoyl-glycérol. Finalement, pour le cinquième objectif, nous avons évalué l’importance de la périostine, une protéine impliquée dans l’adhésion des éosinophiles, dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme. Pour conclure, les résultats obtenus dans cette thèse favoriseront l’identification de possibles cibles thérapeutiques pour diminuer l’éosinophilie pulmonaire persistante observée chez les asthmatiques sévères.

La dermite atopique, une maladie inflammatoire de la peau, est connue pour son implication dans la sensibilisation aux allergènes via la barrière cutanée endommagée. Cette sensibilisation est associée au développement de certaines maladies allergiques, dont la rhinite allergique et l'asthme allergique. La cascade inflammatoire caractéristique de ces maladies inclut le recrutement de cellules pro-inflammatoires dont les éosinophiles qui sont alors augmentés et activés dans le sang. Jusqu'ici, très peu d'études ont analysé le transcriptome de ce type cellulaire et encore moins d'études se sont concentrées sur le profil différentiel des microARN (miARN) qui pourrait réguler la transcription et donc avoir un impact sur le niveau de certaines protéines et subséquemment sur la pathogénèse et la symptomatologie des maladies allergiques. Le but de cette étude était de mesurer les niveaux différentiels de miARN primaires (pri-miARN) dans les éosinophiles isolés de prélèvements sanguins d'individus atteints de maladies allergiques (dermite atopique, d'atopie, de rhinite allergique et d'asthme) et d'individus témoins (sans maladies allergiques). Les comptes différentiels ont également été évalués pour une série d'autres phénotypes liés aux maladies allergiques incluant des données de la fonction respiratoire et des données immunologiques. Dix-huit pri-miARN ont été identifiés comme différemment exprimés dans les éosinophiles d'individus atteints comparativement aux témoins. Ces 18 pri-miARN ont ensuite été groupés à l'aide de l'algorithme de Ward afin de les associer à un phénotype. Les groupes constitués ont été expliqués par le diagnostic d'asthme, l'historique familial de maladies respiratoires, l'historique familial de rhinite allergique et le compte cellulaire des neutrophiles sanguins. Cette étude a donc permis d'identifier 18 pri-=miARN primaires associés aux maladies allergiques ce qui contribue à documenter une part des mécanismes épigénétiques qui sous-tendent ces maladies. / The atopic dermatitis, an inflammatory disease affecting skin, is known to play an important role in allergen sensitization via the damaged skin barrier. This sensitization can lead to allergic diseases such as allergic rhinitis and allergic asthma. The inflammatory reactions leading to these diseases recruit a number of pro-inflammatory cells, including eosinophils, a cell type known for contributing to the damaging of epithelial cells. Few studies have focused on the impacts of the transcriptome on this cell type, and even fewer on the differential microRNA (miRNA) profiles that could regulate clinical manifestations and pathogenesis of diseases of the atopic march. Actually, the effect of miRNAs on these diseases is not entirely understood, but they could influence inflammatory pattens in these diseases and the proliferation of epithelial cells, thereby regulating these diseases in a post-transcriptional matter. The aim of this study was to find differential counts for primary miRNAS (pri-miRNAs) in eosinophil cells sampled isolated from blood of individuals affected with allergic diseases in order to better understand epigenetic mechanisms of these diseases. In order to do so, RNAs from individuals affected with atopic dermatitis, allergic rhinitis and asthma, as well as from non-affected individuals, were sequenced to evaluate differential pri-miRNA counts. These counts were also evaluated for respiratory function measures and immunology. 18 miRNAs from eosinophils were identified as differentially expresses between afflicted individuals and controls. These 18 miRNAs were then clustered using Ward's algorithm in order to find a phenotypic explanation to these miRNAs. Clusters were found to be explained by asthma diagnostic, familial history of respiratory diseases, familial history of allergic rhinitis and neutrophil cell count. These 18 miRNAs therefore allow to better understand epigenetic mechanisms underlying allergic diseases.

L'asthme est une maladie chronique des bronches caractérisée par une inflammation de la paroi bronchique, une hyperréactivité bronchique ainsi qu'une obstruction variable. L'éosinophile contribue à la physiopathologie de l'asthme en sécrétant divers médiateurs pro-inflammatoires, notamment les cysteinyl-leucotriènes (CysLT), qui initient et perpétuent la cascade inflammatoire. Des antagonistes des récepteurs des CysLT comme le Montelukast (MTK) ont été développés afin de diminuer les symptômes associés à l'action des leucotriènes. De récentes études ont démontré que le MTK agit sur des fonctions cellulaires par des mécanismes encore inconnus. Ainsi, nous avons postulé que le MTK agissait sur certaines fonctions de l'éosinophile. Nous avons démontré que le MTK inhibe la biosynthèse de LTC4 chez l'éosinophile sanguin. Toutefois, les mécanismes d'inhibition du MTK restent à élucider. Cette étude a permis de comprendre davantage la régulation de la biosynthèse de LTC4 chez l'éosinophile sanguin.

La migration des éosinophiles dans la muqueuse bronchique est une caractéristique importante de l'asthme. Différentes protéases contribuent à la migration: la MMP-9, l'uPA et la plasmine. Notre groupe a déjà démontré que d'autres protéases sont possiblement impliquées dans le processus. Cette étude vise à documenter l'expression de l'«eosinophil serine protease» (esp)-l par l'éosinophile et à étudier le rôle de l'esp-l dans la migration de l'éosinophile. Les éosinophiles expriment l'esp-l, tant en ARNm qu'en protéine. Les expériences de migration des éosinophiles et les essais enzymatiques n'ont pas permis d'établir que l'esp-l est importante dans la migration. Les sujets normaux et asthmatiques expriment de façon similaire l'esp-l et l'expression de la protéase n'est pas modulée par les médiateurs inflammatoires utilisés. Le rôle de l'esp-l dans la biologie de l'éosinophile demeure encore inconnu. / Migration of eosinophils to bronchial mucosa is a main feature of asthma. Different proteases contribute to migration: MMP-9, uPA and plasmin. Our group has demonstrated that other proteases are possibly involved in this process. This study aims to document the expression of eosinophil serine protease (esp)-l by eosinophils and study the role of esp-1 in eosinophil migration. Eosinophils express esp-1 at mRNA and protein levels. Eosinophil migration experiments and enzymatic assays failed to establish that esp-1 is involved in migration. Eosinophils from normal and asthmatic subjects similarly express esp-1, and the expression of the protease is not modulated by the inflammatory mediators we used. Consequently, the role of esp-1 in eosinophil biology is still unknown.

Le réarrangement FIP1L1-PDGFRA (F/P), identifié de manière récurrente dans les leucémies chroniques à éosinophiles, est à l’origine d’une activation constitutive de l’activité tyrosine kinase de la chaîne α du récepteur au PDGFR. Les mécanismes concourant à la prolifération éosinophile exclusive et au profil de cytotoxicité spécifique à cette leucémie sont encore mal élucidés. Ce récepteur PDGFRα;, principalement exprimé dans les cellules mésenchymateuses, y exerce des effets prolifératifs et chimiotactiques, en partie induits par la production intracellulaire de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS). Ces constatations nous ont amené à étudier les perturbations du métabolisme oxydatif dans la leucémie F/P+, en utilisant une approche d’étude globale du protéome d’éosinophiles de sujets F/P+, comparé à des éosinophiles de sujets contrôles. Dans ce travail, nous avons démontré qu’il existe, dans les éosinophiles F/P+, une dérégulation de nombreuses protéines impliquées dans la signalisation redox intracellulaire. De plus, les modifications d’expression de certaines d’entre elles (peroxiredoxine-2, src-homology-2 domain containing tyrosine phosphatase-1 ou SHP-1), non retrouvées dans les éosinophiles de patients ayant un syndrome hyperéosinophilique idiopathique, et identifiées dans une lignée cellulaire exprimant F/P, semblent spécifiquement induites par F/P. L’activation du PDGFRα; dans les éosinophiles F/P+ est donc à l’origine d’un déséquilibre du métabolisme oxydatif dont les conséquences sur la différenciation vers le lignage éosinophile ou sur la cytotoxicité seront discutées. / The FIP1L1-PDGFRA (F/P) fusion gene, identified as a recurrent molecular finding in chronic eosinophilic leukemia, induces a constitutive activation of the kinase domain of PDGFRα. However, the molecular events contributing to the predominant eosinophil lineage expansion and to the singular cytotoxicity profile of eosinophils in this leukemia remain unclear. PDGFRα;, mainly expressed in mesenchymal cells, possesses proliferative and chemotactic properties, which are, in part, mediated by the intracellular production of reactive oxygen species (ROS). These observations prompted us to investigate the disturbances of the redox signaling in the F/P-associated leukemia, using a comparative study of the proteome of F/P+-eosinophils and eosinophils of healthy controls. Here, we report, in F/P+-eosinophils, the abnormal expression of numerous proteins implicated in oxidative metabolism. Furthermore, changes in expression of particular proteins (peroxiredoxine-2 and src-homology-2 domain containing tyrosine phosphatase-1) appears specific to F/P-Eos compared to patients with idiopathic hypereosinophilic syndrome, and could be demonstrated in F/P-expressing cell line EOL-1. Thus, the activation of PDGFRα; in F/P+-eosinophils leads to a global disturbance of the redox signaling, whose consequences on the differentiation toward eosinophil lineage and cytotoxicity will be discussed.

L'infiltration d'éosinophiles dans la muqueuse bronchique est caractéristique dans l'asthme. Pour passer du sang vers la muqueuse bronchique, l'éosinophile doit sécréter des proteases qui digéreront les protéines de la matrice extracellulaire ainsi que la membrane basale des vaisseaux sanguins. L'acide 5-oxo-6,8,11,14-éicosatétraénoïque, un lipide bioactif, provoque une transmigration des éosinophiles en activant la sécrétion de plusieurs proteases dont la matrix metalloproteinase (MMP)-9 ainsi que l'urokinase et la plasmine, deux proteases du système plasminogène/plasmine. Il active la sécrétion de la MMP-9 via la voie signalétique extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/2. De plus, il est décrit que l'effet de ERK-1/2 sur la migration diminue en absence du système plasminogène/plasmine. Cette étude porte sur les interactions entre les différentes protéases impliquées lors de la migration du 5-oxo-ETE, plus précisément, la capacité de l'urokinase plasminogen activator (uPA) et de la plasmine à augmenter la sécrétion de MMP-9. Elle traite également de l'implication de la voie signalétique des ERK-1/2 dans la sécrétion de la MMP-9. Elle confirme que l'uPA et de la plasmine peuvent induire la sécrétion de la MMP-9. Elle valide également l'implication de la voie signalétique des ERK-1/2 lors de ce phénomène.

L’environnement pulmonaire est en contact constant avec des agressions extérieures qui peuvent causer une inflammation pulmonaire. Cette inflammation peut être aigüe ou chronique et elle est caractérisée par plusieurs types de cellules immunitaires. Ces cellules expriment à leur surface plusieurs molécules qui sont essentielles à leur fonctionnement. Les rôles de certaines molécules dont le CD103 et le CD34 demeurent très peu étudiés. Les cellules dendritiques (DCs) CD103+ résident au poumon et y exercent plusieurs fonctions régulatrices et inflammatoires. Notre équipe a démontré que la présence de lipopolysaccharide ou de facteur de nécrose tumorale (TNF) empêche l’augmentation du CD103 par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages. Toutefois, l’impact de la modulation de l’expression du CD103 sur les fonctions des DCs demeure inconnu. L’asthme est caractérisé par une hyperréactivité bronchique (HRB) qui consiste en une réactivité exagérée du système respiratoire en réponse à divers broncho-constricteurs. Les mastocytes et éosinophiles sont centraux dans le développement de l’asthme. Le CD34 est exprimée par ces cellules et il est impliqué dans la pathologie de l’asthme puisque les souris Cd34-/- démontrent une perte d’HRB en contexte d’asthme. Cependant, l’impact du CD34 sur la fonction de dégranulation des mastocytes et des éosinophiles dans l’asthme reste inconnu. Les objectifs principaux de ce projet étaient de déterminer l’impact de la modulation de l’expression du CD103 sur certaines fonctions des DCs dans l’immunité innée et de déterminer l’influence de l’expression du CD34 sur certaines fonctions des mastocytes et des éosinophiles dans l’immunité de l’asthme. Des marqueurs de fonctions ont été analysés par cytométrie en flux à la suite de la modulation du CD103. Les fonctions qui ont été analysées sont la capacité d’activer les lymphocytes T, la migration et l’adhésion à l’épithélium. La modulation du CD103 altère l’expression de l’E-Cadhérine ce qui favorise une population activée et non adhérente. L’impact du CD34 sur la dégranulation des mastocytes et des éosinophiles a été étudié à l’aide de souris Cd34-/- et de cultures dérivées de la moelle osseuse. Le CD34 influence la dégranulation des mastocytes et semble affecter la production de certains lipides. En conclusion, l’impact de la modulation du CD103 sur l’adhésion des DCs pourra être utilisé dans différents contextes comme les infections et le cancer et le CD34 semble une cible intéressante dans le traitement de l’asthme puisqu’il est impliqué dans plusieurs composantes de l’asthme, dont l’hyperréactivité et l’inflammation chronique.

Les éosinophiles sont des cellules à fonctionnalités multiples, impliquées dans de nombreux processus effecteurs et inflammatoires. Ils expriment à leur surface de nombreux récepteurs participant à l'immunité adaptative, mais aussi à l'immunité innée et libèrent, après activation, différents médiateurs, dont des protéines hautement cytotoxiques et des cytokines. Leur fonction exacte dans la réponse immunitaire innée reste encore inconnue. Outre leur présence au cours de certains processus granulomateux retrouvés lors de la schistosomiase ou dans la maladie de Crohn, une accumulation d'éosinophiles a été observée au sein de granulomes pulmonaires dans différents modèles d'infections mycobactériennes.<br />L'objectif de notre travail a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans les interactions entre les éosinophiles humains et Mycobacterium bovis BCG, choisi comme modèle de mycobactéries.<br />Après avoir démontré l'activité chimiotactique du BCG vis-à-vis des éosinophiles nous avons ensuite montré que les éosinophiles pouvaient, après activation en présence de BCG, produire des espèces réactives de l'oxygène et libérer la peroxydase de l'éosinophile par dégranulation. La mise en évidence de l'expression membranaire des récepteurs Toll-like (TLR) 2 et 4 sur les éosinophiles nous a permis de démontrer l'implication majoritaire de TLR2 dans l'interaction éosinophiles/BCG ainsi que l'activation des voies MAP kinases et de la voie NF-κB. Enfin, nous démontrons que les éosinophiles sont capables d'exercer une fonction cytotoxique vis-à-vis du BCG, mécanisme faisant intervenir à la fois des défensines et la protéine cationique de l'éosinophile (ECP).<br />Dans la continuité de la démonstration de l'expression par les éosinophiles de molécules partagées avec les lymphocytes T, nous nous sommes intéressés à d'autres molécules pouvant être impliquées dans les interactions éosinophiles/BCG, et plus particulièrement celles participant à l'immunité innée. C'est ainsi que, grâce à différentes approches de cytométrie en flux, de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons mis en évidence l'expression du complexe CD3/TCRγδ à la surface d'une sous-population d'éosinophiles, puis nous avons montré la fonctionnalité de ce récepteur, après activation par des anticorps monoclonaux spécifiques ou des ligands physiologiques. Enfin, nous avons démontré, en utilisant des anticorps neutralisants ou un inhibiteur spécifique que CD3/TCRγδ participe à l'activation des éosinophiles induite par le BCG.<br />Ce travail représente la première étude extensive des mécanismes intervenant dans les interactions entre éosinophiles humains et M. bovis BCG. Il ouvre des perspectives nouvelles quant à la fonction des éosinophiles dans l'immunité innée, impliquant de manière originale deux récepteurs différents : TLR2 et CD3/TCRγδ. Nos résultats suggèrent également que les éosinophiles expriment des molécules de la famille des défensines, qui vient s'ajouter à leur arsenal cytotoxique et qui agirait en synergie avec l'ECP. En conclusion, ces résultats suggèrent que les éosinophiles puissent reconnaître directement des signaux de danger, incluant les mycobactéries, et, comme les lymphocytes Tγδ, représenter un nouveau lien entre immunité innée et immunité adaptative.

L'asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies aériennes dont l'incidence a augmenté dramatiquement au cours de ces deux dernières décennies. Chez les individus sensibles, cette inflammation induit des épisodes de sifflements récurrents, une oppression thoracique, une sécrétion de mucus ainsi qu'une obstruction des voies respiratoires, un recrutement éosinophilique et une hyperréactivité broncho-pulmonaire (HRB). Les avancées dans la compréhension de la physiopathologie de l'asthme ont été réalisées grâce aux modèles expérimentaux murins. Ces travaux ont mis en évidence le rôle de différentes cellules dans l'immunorégulation de l'inflammation bronchique, notamment les lymphocytes T de type Th2. Toutefois, les mécanismes immunologiques impliqués dans la protection ou l'exacerbation de la maladie sont encore peu connus. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence l'influence de cellules Natural Killer T invariantes (iNKT) dans le développement de l'asthme allergique expérimental. Les cellules iNKT représentent une population immunorégulatrice de lymphocytes T, caractérisée par l'expression d'une chaîne alpha invariante du TCR (Va14Ja18 et Va24Ja18, respectivement chez la souris et chez l'homme) qui est positivement sélectionnée par la molécule CD1d. Ces cellules synthétisent rapidement et massivement de nombreuses cytokines, comme l'IL-4 et l'IFN-g, lorsqu'elles sont simulées par l'a-galactosylcéramide (a-GalCer), glycolipide reconnu spécifiquement par les lymphocytes iNKT. Le spectre d'action attribué aux cellules iNKT est particulièrement large. Elles sont impliquées dans le contrôle des réponses immunes contre des infections, des maladies autoimmunes, des modèles de contact de sensibilité et des tumeurs.<br /><br />En utilisant un modèle où les souris sont immunisées de façon systémique par l'ovalbumine (OVA) et ensuite stimulées au niveau des voies aériennes par ce même antigène (étape désignée comme « challenge »), nous avons démontré que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental. En effet, divers symptômes de l'asthme sont diminués chez les souris déficientes en cellules iNKT (Ja18-/-), notamment, l'inflammation éosinophilique, la production de cytokines de type Th2, comme l'IL-4 et l'IL-5, la sécrétion d'IgE et l'HRB. L'implication des cellules iNKT dans la sévérité de l'asthme a été confirmée puisque le transfert adoptif des cellules iNKT à des souris Ja18-/- rétablit les symptômes décrits ci-dessus. <br /><br />En nous basant sur ces résultats, nous nous sommes demandés si nous pourrions modifier la sévérité de l'asthme allergique en agissant sur les lymphocytes iNKT. Pour cela, nous avons traité des souris par l'a-GalCer. Nous avons ainsi démontré qu'une seule injection d'a-GalCer 1 h avant le premier challenge intranasal à des souris précédemment immunisées inhibait la totalité des symptômes de l'asthme. L'administration intranasal de l'a-GalCer inhibe les symptômes de l'asthme chez les souris immunisées et provoquées par l'OVA. Cette protection peut être transférée chez des souris immunisées grâce à des cellules en provenance de souris traitées par l'a-GalCer. L'implication de l'IFN-g dans cette protection a été mise en évidence par des anticorps neutralisants, ainsi que par le transfert de cellules iNKT en provenance de souris IFN-g-/-. <br /><br />En conclusion, nos résultats démontrent que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental en activant la sécrétion de cytokines de type Th2 et que le traitement par l'a-GalCer, qui agit spécifiquement sur les lymphocytes iNKT, inhibe le développement de la maladie en induisant la sécrétion d'IFN-g. Ainsi, nos résultats suggèrent que l'a-GalCer pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique dans le traitement de l'asthme allergique.

L'asthme est une maladie chronique des voies respiratoires caractérisée par une infiltration de cellules inflammatoires activées comprenant des éosinophiles mais également des cellules T, des mastocytes et des neutrophiles au niveau de la muqueuse bronchique. Cette inflammation est associée à des changements structuraux des bronches appelés remodelage qui contribue à l'obstruction bronchique ainsi qu'à l'apparition des symptômes d'asthme. En effet, l'inflammation dans les voies aériennes implique des interactions cellulaire et moléculaire complexes entre les cellules résidentes de la muqueuse bronchique et les cellules inflammatoires infiltrées. Ces interactions peuvent se faire soit par contact direct et/ou par des médiateurs sécrétés. De plus, l'identité des molécules impliquées dans ces interactions ainsi que leurs effets sur le devenir de la réponse inflammatoire et sur le remodelage ne sont pas très bien connus. Ainsi, mieux définir et comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans cette interaction est crucial afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques. La présente thèse a pour but d'étudier l'impact de l'interaction entre les fibroblastes bronchiques et les lymphocytes T sur le devenir de la réponse inflammatoire et sur le remodelage, de même que de comparer l'impact de différentes stratégies d'ajustement des doses des corticostéroïdes, basée sur le compte d'éosinophiles dans le sputum à une autre basée sur les critères cliniques sur l'inflammation et le remodelage bronchique. Tout d'abord, nous avons montré que l'interaction entre les fibroblastes et les lymphocytes T induit l'augmentation de la production d'IL-6 et que ce processus est médié par l'interaction moléculaire α5β1/CD40L chez les asthmatiques. De plus, cette interaction induit également l'augmentation de l'expression de TGF-β, d'LL-β et d'IL̀-17 favorisant ainsi une réponse immunitaire de type Thl7 en plus d'induire la survie des cellules T CD4+. En outre, nous avons montré que l'utilisation du compte d'éosinophiles comme stratégie d'ajustement du traitement des patients a le même impact sur l'éosinophilie qu'une stratégie basée sur des critères cliniques. Ces résultats soulignent l'importance de l'interaction entre les cellules inflammatoires et les cellules résidentes dans la régulation de l'inflammation et dans la pathogenèse de l'asthme.