La polarité apico-basale des cellules épithéliales est essentielle aux fonctions des tissus épithéliaux. La protéine Yurt promeut l’identité de la membrane basolatérale et régule négativement l’activité de Crumbs par des mécanismes encore inconnus. Crumbs est un déterminant apical qui réprime la croissance tumorale et prévient la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Nous avons identifié la protéine CG5964 (ALBATROSS chez l’humain) comme un nouvel interacteur physique de Yurt. L’objectif de ma maîtrise est de réaliser l’analyse fonctionnelle de cette protéine (renommée Cérès chez la drosophile), par des méthodes biochimiques et génétiques (génération d’un allèle mutant et d’une lignée de surexpression). Nos résultats suggèrent que la protéine Cérès n’est pas impliquée dans la polarité épithéliale mais plutôt dans le maintien de l’équilibre énergétique. Mon projet apportera les données de base sur la protéine de drosophile Cérès qui n’avait jamais été caractérisée. La compréhension du rôle fonctionnel de l’interaction entre Cérès et Yurt pourrait révéler de nouvelles fonctions de Yurt. Dans l’optique d’utiliser Yurt comme cible thérapeutique pour lutter contre le cancer, il est important de connaître les différents processus biologiques dans lesquels Yurt est impliquée.

Les épithéliums recouvrent l’ensemble des surfaces et des cavités internes du corps humain. Le fonctionnement des cellules épithéliales repose sur la répartition des constituants cellulaires au sein de compartiments distincts : un compartiment apical, un compartiment latéral, et un compartiment basal : c’est ce que l’on appelle la polarité apico-basale. Plus de 80 % des cancers proviennent d’un dérèglement des cellules épithéliales. De plus, la polarité épithéliale est perdue lors des stades avancés du cancer, suggérant qu’elle contribue activement à la progression tumorale. C’est pourquoi il apparaît crucial de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la polarité épithéliale. La polarité est assurée par un ensemble de protéines réparties au sein des différents compartiments et agissant sous forme de modules très dynamiques. Un de ces modules est articulé autour de la protéine CRB3, qui agit comme un déterminant apical essentiel des cellules épithéliales. L’expression de CRB3 est perdue dans de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses en culture, suggérant que CRB3 pourrait détenir des fonctions inhibitrices de certains processus liés à l’avancement tumoral. Cependant, l’impact fonctionnel de la perte de CRB3 dans ces lignées cancéreuses reste encore peu connu, tout comme les mécanismes signalétiques agissant en aval de CRB3. Les travaux présentés dans cette thèse mettent en lumière de nouvelles évidences concernant le rôle fonctionnel de la perte de CRB3 dans différentes lignées cellulaires cancéreuses. Plus précisément, nous montrons que CRB3 détient un rôle signalétique important lui conférant une fonction à la fois dans la morphogenèse épithéliale, mais également dans le maintien de l’intégrité épithéliale. Dans un premier temps, nous montrons que la ré-expression de CRB3 dans des cellules cancéreuses d’origine épithéliale permet le rétablissement d’une morphologie de type épithéliale, en lien avec l’organisation d’un réseau circonférentiel d’acto-myosine. Nous identifions également le sentier signalétique activé en aval de CRB3 et menant à l’activation de la petite GTPase RhoA, nécessaire au remodelage de la morphologie et du réseau d’acto-myosine des cellules cancéreuses. Ce sentier semble notamment jouer un rôle important en aval de CRB3 pour limiter la migration cellulaire. Ensuite, nous montrons que CRB3 contrôle différents sentiers signalétiques, et notamment la voie ERK MAP Kinase, une voie de signalisation fortement dérégulée dans le cancer. Bien que le rôle fonctionnel de cette régulation soit encore inconnu, elle pourrait contribuer à limiter la progression tumorale en aval de CRB3. Enfin, nous montrons que la perte d’expression de Crb3 chez la souris induit une mortalité périnatale associée à des défauts de morphogenèse épithéliale, indiquant que Crb3 est requise pour la viabilité des souris et le développement des structures épithéliales. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes liant la perte de la polarité épithéliale à l’avancement du processus tumoral, et vise à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre le développement de cancers.

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.

La cavité buccale est la porte d'entrée de nombreux antigènes, mais elle est également le lieu d'établissement de niches microbiennes. C'est le cas de la levure dimorphique, Candida albicans, qui y réside de manière symbiotique et asymptomatique. Cependant, C. albicans est également l'agent étiologique des candidoses buccales, infections buccales communes qui se développent essentiellement chez les personnes jeunes, âgées ou immunosupprimées. Les candidoses muco-cutanées peuvent être traitées. Cependant, les antifongiques efficaces sont peu nombreux ; leur utilisation clinique est liée à des effets secondaires et à l'émergence de résistances. Ceci montre l'importance de développer de nouveaux composés antifongiques efficaces et sécuritaires. Une molécule senseur du quorum de C. albicans, le farnesol, a été découverte récemment. Cette molécule est sécrétée par C. albicans lui-même qui régule ainsi sa croissance et sa virulence. Le premier objectif de notre étude a été de montrer comment le farnesol agissait sur C. albicans et son dimorphisme (bourgeonnement), puis comment il pouvait moduler la virulence de C. albicans en agissant sur des proteinases aspartyles sécrétées (les SAPs). Nous avons montré que le farnesol contrôle la croissance de C. albicans en inhibant la formation de colonies par des modifications ultrastructurales. D'autre part, nous avons confirmé que le farnesol bloque le bourgeonnement. Enfin, nos résultats ont montré que le farnesol inhibe l'expression des SAPs, facteur de virulence de C. albicans. Par ailleurs, plusieurs études ont indiqué que l'épithélium de la muqueuse buccale, barrière anatomique importante contre les agents physiques, microbiens et chimiques, était impliqué dans le processus pro-inflammatoire via la production de cytokines. Ceci suggérerait que l'épithélium buccal joue un rôle actif dans le contrôle des infections buccales et le maintien de la relation symbiotique avec les agents microbiens, ce qui est le cas de Candida. Nous avons montré grâce à un modèle de muqueuse buccale que les cellules épithéliales buccales préviennent l'infection à C. albicans via les TLRs et que la présence de farnesol exogène favorise la défense des cellules épithéliales contre les infections à C. albicans. Ainsi, le farnesol pourrait être une nouvelle voie dans le traitement des candidoses buccales.

Les cellules de l’épithélium gingival expriment des récepteurs pour reconnaître des motifs moléculaires présents sur les microorganismes. Le but de cette étude est de comparer la réponse des cellules de l’épithélium gingival au contact d’un biofilm commensal ou pathogène. Des macrophages, des kératinocytes gingivaux et une coculture de macrophages/kératinocytes ont été stimulés avec des biofilms commensaux et pathogènes. L’expression de gènes et la production des récepteurs TLRs (Toll-like receptors) et NLRS (NOD-like receptors) ont été évaluées respectivement par amplification (qRT-PCR) et par immunofluorescence. Les sécrétions de cytokines et de défensines ont également été évaluées par ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Les résultats obtenus n’ont pas révélés de profils d’expression de récepteurs spécifiques aux pathogènes ou commensaux. La sécrétion de cytokines et de défensines est plus fortement induite par les pathogènes que par les commensaux. L’investigation d’autres récepteurs ou des membres de l’inflammasome pourrait aider à mieux comprendre les mécanismes de tolérance ou de défenses de l’hôte.

Les Hedgehogs (Hh) sont des morphogènes multifonctionnels qui ont des rôles importants dans l'embryogenèse et la morphogenèse de plusieurs organes. Leur rôle dans le développement de la glande gastrique humaine n'est pas connu. Peu est connu de la signalisation Hh, plus précisément de Sonic Hedgehog (Shh), dans la glande gastrique humaine adulte, autant dans sa localisation et son association aux différents types cellulaires gastriques que dans son rôle fonctionnel dans cet organe.Les modèles murins de délétion classique des molécules de la signalisation Hh subissent, dans la grande majorité, une mort néonatale ou au stade somites rendant ces modèles inutiles pour l'étude du maintien de l'homéostasie du tube digestif adulte, autant au niveau de l'intestin que de l'estomac. Dans un premier temps, les patrons d'expression des différents gènes clés impliqués dans la voie de signalisation Hh dans le développement foetal humain de la glande gastrique ont été déterminés à l'aide de tissus gastriques foetaux âgés entre 14 et 20 semaines de gestation. Dans un deuxième temps, les rôles fonctionnels et physiologiques de Shh, dans l'homéostasie de l'intestin adulte et dans la morphogenèse et homéostasie de l'estomac ont été élucidés par la génération de souris possédant une délétion conditionnelle de Shh à l'épithélium de l'intestin ou de l'estomac à l'aide du système Cre/loxP. L'analyse des patrons d'expression des ligands SHH et Indian Hedgehog (IHH), des récepteurs PATCHED et SMOOTENED, des effecteurs GLI et de gènes cibles de la voie de signalisation Hh dans la glande gastrique humaine en développement, a confirmé la présence de la majorité de ces protéines dès 14 semaines de gestation. Ces effecteurs n'ont été détectés qu'au niveau des cellules à mucus de surface, des cellules du foveolae et des cellules zymogéniques mais pas au niveau des cellules pariétales. L'expression strictement épithéliale de presque toutes ces protéines suggère fortement l'activation exclusivement autocrine de cette voie de signalisation dans la glande gastrique humaine foetale. Ces patrons d'expression diffèrent de ceux retrouvés dans la glande gastrique murine foetale ou adulte. L'étude du modèle murin Villine -Cre; ShhloxP/loxP , qui possède une délétion de Shh à l'épithélium intestinal, a permis d'élucider les rôles fonctionnels de Shh dans l'homéostasie de l'intestin. Nous avons constaté que Shh a un rôle spécifique dans l'homéostasie intestinale puisque les souris expérimentales présentent un allongement villositaire. Shh est également impliqué dans la maturation des cellules caliciformes et dans l'inhibition de la prolifération épithéliale intestinale.Les résultats montrent aussi que Ihh semble, quant à lui, avoir un rôle compensateur puisqu'il se relocalise dans les régions qui expriment normalement Shh. L'étude du modèle murin Foxa3 -Cre; ShhloxP/loxP , qui possède une délétion de Shh dans l'épithélium gastrique, a permis d'élucider les rôles de Shh dans le développement et le maintien de la glande gastrique. Nous avons déterminé que Shh a un rôle dans la morphogenèse de la glande gastrique et dans le maintien de ce dernier. En effet, l'architecture foveolae-glande est fortement affectée par la perte épithéliale de Shh.Les résultats démontrent également que Shh a un rôle déterminant dans la différenciation des cellules pariétales puisque ces dernières sont absentes chez les souris expérimentales.

La participation de HNF4[alpha] à la réponse inflammatoire se manifeste par différents rôles, notamment par la régulation transcriptionnelle du cytochrome P450, de l'oxyde nitrique synthase inductible, mais également par la protection face aux maladies inflammatoires de l'intestin (MII). En effet, la perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium intestinal de souris rend celles-ci plus sensibles face à l'induction d'une colite chimique. Également, l'expression de HNF4[alpha] est perdue au niveau des tissus coliques de patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin, dont la colite ulcéreuse. Les MII sont caractérisées par une activation chronique de la réponse immune et inflammatoire le long du tractus gastro-intestinal. L'agent causal est, dans la majorité des cas, la flore intestinale, laquelle peut activer plusieurs réponses inflammatoires, telle la sécrétion abondante de cytokines et d'interleukines pro-inflammatoires ainsi que le recrutement et l'infiltration de cellules immunitaires à l'épithélium, causant des dommages importants à la muqueuse intestinale et menant ainsi à une augmentation de la perméabilité de l'épithélium intestinal. La perte de HNF4[alpha] au niveau de l'épithélium colique de souris a mené à l'apparition spontanée d'inflammation, à l'infiltration massive de cellules leucocytaires et a révélé une augmentation de la production de plusieurs facteurs pro-inflammatoires, dont la chimiokine KC/CXCL1. Cette molécule est en fait un chimioattractant important pour les neutrophiles et autres cellules leucocytaires. Dans cette optique, nous avons évalué, par immunobuvardage et gel de rétention, l'impact d'un stress pro-inflammatoire sur l'expression et l'activité de HNF4[alpha]. Nous avons également déterminé l'effet de l'expression de HNF4[alpha] sur la production de KC/CXCL 1 ainsi que les mécanismes de régulation de HNF4[alpha] sur l'expression de la chimiokine. Nous avons quantifié, par qPCR et par ELISA, la production et la sécrétion de KC/CXCL1 par les différentes lignées de cellules épithéliales intestinales surexprimant le facteur de transcription HNF4[alpha]. Aussi, nous avons montré l'influence de HNF4[alpha] sur l'activation de NF[kappa]B, puisque ce facteur est responsable de la régulation transcriptionnelle de KC/CXCL1. Nous avons, en effet, montré que l'activation par phosphorylation, la translocation nucléaire et la capacité de liaison à l'ADN de NF[kappa]B sont diminuées dans les modèles cellulaires de surexpression de HNF4[alpha]. Nous avons finalement évalué l'effet de HNF4[alpha] sur la dégradation de l'inhibiteur de kappaB (I[kappa]B[alpha]). Dans cette étude, nous avons montré que le facteur de transcription HNF4[alpha] régule de façon négative la production de la chimiokine KC/CXCL1 en modulant l'activité transcriptionnelle de NF[kappa]B via la stabilisation de l'inhibiteur I[kappa]B.

Les aquaporines (AQPs) sont de petites protéines membranaires permettant le passage facilité de l'eau, du glycérol et de certains solutés à travers les membranes biologiques. Elles jouent d'importants rôles de transport transmembranaires ou transcellulaires dans diverses cellules telles que les cellules rénales, mais aussi dans les kératinocytes de l'épiderme. L'épiderme est un épithélium pluristratifié en constant renouvellement. Le calcium extracellulaire joue un rôle important dans le mécanisme de différenciation des kératinocytes.Dans ce travail, nous avons montré que la différenciation induite par le calcium de kératinocytes humains s'accompagne de l'adressage de l'aquaporine-3 (AQP3) du réticulum endoplasmique, vers les membranes plasmiques. Pour étudier la cinétique et les bases moléculaires de cette régulation, notre objectif était de produire des clones stables d'une lignée de kératinocytes humains en culture (HaCat) exprimant une AQP3 fluorescente. Malgré plusieurs tentatives, je n'ai pas pu obtenir ces clones stables. J'ai alors choisi un autre modèle de cellules épithéliales en culture; les cellules MDCK. Nous avons produit deux lignées stables de MDCK exprimant des aquaporines fluorescentes: l'AQP3-GFP et l'AQP2-mCherry. De manière intéressante, dans les cellules MDCK, l'AQP3 -GFP reproduit la régulation de son adressage par le calcium observée dans les kératinocytes humains; dans des cellules MDCK cultivées en présence de 0,15mM de Ca2+, l'AQP3-GFP est localisée dans le réticulum endoplasmique, tandis qu'à 1,5mM de Ca2+ extracellulaire, celle-ci est localisée aux membranes plasmiques. Dans les mêmes conditions, l'AQP2-mCherry conserve une localisation intracellulaire. Par des expériences de " calcium switch ", nous avons étudié la cinétique du trafic cellulaire de l'AQP3 et montré que l'adressage de l'AQP3 à la membrane plasmique en réponse au calcium est lent (6h minimum) et semble dépendant non seulement de la différenciation cellulaire, mais aussi de l'établissement de la polarité cellulaire. A l'aide d'inhibiteurs de la PLC et de la PKC, nous avons montré l'implication de cette voie de signalisation, qui dépend du calcium, dans le trafic de l'AQP3. De plus, l'adressage membranaire de l'AQP3 est dépendant du cytosquelette d'actine.En conclusion, nous montrons pour la première fois une régulation du trafic intracellulaire d'une aquaporine par le calcium au cours de la différenciation et de l'établissement de la polarité cellulaire de cellules épithéliales. Cette régulation permet probablement l'hydratation de l'épiderme humain, sans remettre en cause la barrière de perméabilité que constitue la peau.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.