Cette thèse de doctorat porte sur le transport du silicium (Si) par les aquaporines animales. Le Si est un élément abondant dans la nature où il joue des rôles im-portants, chez les plantes notamment. Il jouerait également des rôles importants en physiologie animale en contribuant à l’intégrité osseuse, à la santé tégumen-taire et au maintien du collagène. Bien que des transporteurs de Si soient déjà connus chez les diatomées et les plantes, aucun n’a encore été décrit chez l’animal. Toutefois, la compartimentalisation du Si au sein de l’organisme et son assimilation nutritionnelle suppose l’existence de tels transporteurs. En raison de l’homologie qu’elles partagent avec les transporteurs de Si chez les plantes, les aquaporines (AQPs) animales correspondent à des candidats pertinents. Dans ce contexte, les objectifs de la thèse étaient de déterminer si les AQPs sont per-méables au Si et, le cas échéant, de caractériser le rôle physiologique du trans-port en Si par les AQPs et d’identifier des résidus qui permettent à ces canaux d’agir ainsi. Nos travaux ont permis de constater que les AQP3, AQP7, AQP9 et AQP10 humaines, connues sous le nom d’aquaglycéroporines (AQGPs), peuvent toutes agir comme des transporteurs de Si ou plus spécifiquement de l’acide or-thosilicique qui permet à l’atome d’exister sous forme soluble. Le transport obser-vé est de nature michaelienne, sensible à la phlorétine (AQP7 et AQP9) mais in-sensible aux changements de pH et d’osmolalité extracellulaire. Aussi, la distribu-tion tissulaire de ces transporteurs concorde avec celle du Si, et l’expression des AQP3, AQP7 AQP9 dans le petit intestin de la souris est augmentée avec une diète faible en Si. Par ailleurs, nous avons démontré que la région des AQPs connue sous le nom de filtre aromatique/Arginine joue un rôle important dans la sélectivité à l’OSA, et que les résidus L84 chez AQP1 et N208 chez AQP10 jouent un rôle dans la sélectivité à l’eau et au Si respectivement. Ces travaux ont mené à la première description de transporteurs de Si chez l’animal, et à une meilleure compréhension de la physiologie de l’atome chez les mammifères. / The subject of this Ph.D. thesis is the transport of silicon (Si) by animal aqua-porins. Si is an abundant element in nature where it plays important roles, namely in plants. It also appears to play important physiological roles in animal physiolo-gy, by contributing to bone integrity, tegumentary health and collagen mainte-nance. Even though Si transporters have already been identified in diatoms and plants, none have been described in animals thus far. However, compartmentali-zation of Si throughout the mammalian body and nutritional assimilation suggest the existence of such transporters. Given the homology that they share with the Si transporters of plants, the mammalian aquaporins (AQPs) correspond to relevant candidates. In this context, the thesis’ objectives were, to determine whether AQPs are permeable to Si, and if so, to characterize the physiological role of Si transport by the AQP and to identify residues that allow these channels to act as such. Our work has allowed us to observe that human AQP3, AQP7, AQP9 and AQP10, also known as aquaglyceroporins (AQGPs), can all act as transporters for Si or more specifically for orthosilicic acid (OSA) that allow Si to be soluble in this form. The observed transport is michaelian in behavior, sensitive to phloretin (AQP7 and AQP9), but insensitive to changes in pH and extracellular osmolality. Also, tissular distribution of these carriers concords with that of Si, and expression of AQP3, AQP7 and AQP9 in the small intestine of mice is upregulated through a Si-poor diet. Otherwise, we have demonstrated that the region within the AQP that is knows as that aromatic/arginine filter (ar/R) plays an important role in OSA selec-tivity, and that residues L84 in AQP1 and N208 in AQP10 plays an important role in water permeability and Si permeability respectively. These results have led to the first description of Si transporters in animals, and a better understanding of the role played by this atom in mammalian physiology.

Tout comme le placenta, les membranes amniotiques humaines sont des organes transitoires mais indispensables au développement fœtal. Parmi les nombreuses fonctions de ces membranes, le contrôle du volume de liquide amniotique est une des plus importantes. Les aquaporines (AQP), canaux aqueux transmembranaires permettant les transferts d’eau, ont déjà été décrites comme fortement impliquées dans ce phénomène. Afin d’éclaircir et d’approfondir leurs implications et leur importance au cours de la grossesse, nous nous sommes intéressé, dans un premier temps, à déterminer l’expression spatio‐temporelle des aquaporines dans les membranes fœtales tout au long de la grossesse, et, dans un second temps, à étudier les aquaporines comme gènes cibles des rétinoïdes. En effet, ces derniers sont des morphogènes impliqués dans le développement embryonnaire et dans la physiologie des annexes embryo‐fœtales et paraissaient être des candidats intéressants pour réguler l’expression des gènes des aquaporines. Nous avons ainsi mis en évidence que, parmi les treize AQPs décrites chez les mammifères, cinq sont exprimées, aussi bien à terme que tout au long de la grossesse, dans les deux feuillets membranaires (le chorion et l’amnion) et à des niveaux d’expression variables en fonction du stade gestationnel et du feuillet membranaire étudié. De plus, nous avons pu proposer un modèle de régulation de l’aquaporine 3 (AQP3) par les rétinoïdes dans les cellules épithéliales amniotiques humaines. Les modulations de l’expression des AQPs 1, 3, 8, 9, 11 tout au long de la grossesse ainsi que la mise en évidence de la régulation de l’AQP3 par les rétinoïdes confirme la nécessité d’une régulation fine de ces gènes au cours de la gestation ; et ce afin de permettre la régulation de l’homéostasie du liquide amniotique, phénomène physiologique essentiel au déroulement harmonieux de la grossesse. Toute altération de cette expression et/ou de cette régulation peut être à l’origine de pathologies du volume amniotique lors de la grossesse, comme l’oligoamnios ou le polyhydramnios. / As the placenta, human amniotic membranes are transitory but essential for the fetal development. Among their numerous functions, the regulation of the amniotic fluid volume is one of the most important. As previously described, this mechanism largely involves transmembrane water channels , the aquaporins (AQPs). In order to clarify and understand their implications and importance during pregnancy, we firstly investigated the spatio‐temporal expression of aquaporins in the fetal membranes throughout pregnancy. In a second time, we studied the aquaporin genes as targets of retinoids. These morphogenetic molecules involved in the fetal annexes and embryonic/fetal development appeared as interesting candidates to regulate aquaporins genes expression in fetal membranes. We have demonstrated that, among the thirteen AQPs described in mammals, five are expressed both at term and throughout pregnancy in both fetal membranes layers (chorion and amnion). Their expression levels vary with the gestational stage and the type of layer. In addition, we were able to propose a model of regulation of aquaporin 3 (AQP3) by retinoids in human amniotic epithelial cells. The modulation of the expression of AQPs 1, 3, 8, 9, 11 throughout pregnancy as well as the demonstration of the AQP3 regulation by retinoids suggests a fine regulation of these genes is necessary during gestation in order to allow the maintenance of amniotic fluid homeostasis, a physiological phenomenon essential to a harmonious pregnancy. Alterations of this expression and/or this regulation could cause diseases of amniotic volume during pregnancy, such as oligohydramnios or polyhydramnios.

Résumé : La régulation de la balance hydrosodée est l’une des principales fonctions du rein. L’équilibre hydro-sodique de l’organisme est contrôlé de façon complémentaire par le système rénine-angiotensine-aldostérone et la vasopressine, une hormone antidiurétique appelée arginine-vasopressine (AVP). L’action rénale de cette hormone dépend essentiellement de la présence des aquaporines. Au niveau des cellules principales du néphron distal, trois isoformes des aquaporines (AQP2, AQP3 et AQP4) sont impliquées dans la réabsorption de l'eau sous le contrôle de l'AVP. Ainsi, la vasopressine joue un rôle primordial dans la régulation fine et la détermination de la concentration finale des urines. En plus de son effet antidiurétique au niveau rénal, la vasopressine contrôle l’équilibre hydrique au niveau central via son récepteur V1 exprimé au niveau de l’anté-hypophyse. Des études récentes ont montré que l’apeline et son récepteur APJ sont fortement exprimés au niveau de ces mêmes neurones et suggèrent que le système apelinergique exerce un effet anti-vasopressinergique au niveau central. Par ce travail je m’intéresse à vérifier si l’apeline, en plus de son effet central, aurait une action opposée à celle exercée par la vasopressine au niveau rénal. J’ai tout d'abord montré que le récepteur APJ est bien exprimé dans les cellules mpkCCD[indice inférieur c14] (cellules issues du tubule collecteur, un modèle de choix pour étudier l'équilibre hydrique au niveau rénal). Par la suite, j’ai montré que l'apeline a un effet opposé à celui de l’AVP sur l'expression, à court et à long terme, de l’AQP2 en réduisant ses niveaux d'ARNm et de protéine dans ces cellules. Finalement, mes résultats indiquent que cette réduction est associée à une diminution importante de la densité de la forme phosphorylée de l’AQP2 (AQP2-S269) au niveau de la membrane apicale des cellules mpkCCD[indice inférieur c14]. L’ensemble de mes résultats suggèrent donc que l’apeline, par son action sur l’AQP2, entraine une baisse de la réabsorption de l’eau par les cellules du tube collecteur rénal. Ainsi, notre constatation donne une nouvelle compréhension de l'implication de l'apeline dans la régulation de l'homéostasie de l'eau. / Abstract : Apelin was recently discovered as the endogenous ligand of the APJ receptor, a receptor with 7 seven-transmembrane domains belonging to the family of GPCRs (G-protein-coupled receptors). Apelin and its receptor are strongly expressed in the vasopressinergic magnocellular neurons suggesting that the apelin/APJ system play a key role in regulating salt and water balance at central level. APJ was reported to be expressed in the glomerular arterioles and along the collecting duct of the nephron. Related to this finding, it was reported that apelin induces vasodilatation of glomerular arterioles by antagonizing angiotensin II. A recent study showed that the apelin counteracts vasopressin-induced water reabsorption via a direct action in rat collecting duct but the mechanisms of this peripheral effect are not clearly understood. In this study, we investigate the effects of apelin on the aquaporin-2 expression in mpkCCD[subscript c14] cells. Our results indicate that the apelin antagonize the AVP effect by reducing mRNA and protein expression of AQP2 in mpkCCD[subscript c14] cells. Furthermore, we found that this effect is associated with a large decrease of AQP2-pS269 density at apical membrane. Our finding corroborates that the apelin, in addition to its central effect, antagonizes the action of AVP on the renal collecting duct cells.

En aquesta tesi s'han estudiat l'excreció de transportadors de sodi i canals d'aigua o aquaporines renal en diverses patologies del balanç hidrosalí, així com l'expressió d'aquestes proteïnes en ronyó de rates en un model experimental d'hipertensió induïda per ciclosporina.En el primer treball, en un model experimental de rata d'hipertensió induïda per ciclosporina vam detectar que les rates que desenvolupaven hipertensió tenien augmentada l'expressió renal del transportador de sodi NKCC2. Aquest increment d'NKCC2 podria afavorir la reabsorció de sodi a nivell de la nansa de Henle amb la conseqüent expansió del volum plasmàtic, i per tant, un augment de la pressió arterial. L'augment detectat de l'aquaporina-1 detectat a les rates tractades podria estar afavorint una reabsorció més efectiva d'aigua al túbul proximal, mentre que la reducció de l'expressió d'aquaporina-2 a les rates tractades conduiria a una disminució de la permeabilitat del túbul col·lector i podria representar un mecanisme compensatori a l'increment de la reabsorció de sodi i aigua.Més endavant vam estudiar l'excreció de les aquaporines-1 i -2 a l'orina de pacients amb cirrosi en les diferents fases de la retenció de sodi i aigua (cirrosi sense ascites, cirrosi amb ascites i síndrome hepatorenal). En aquesta malaltia a mesura que evoluciona la hepatopatia apareix una retenció hidrosalina. Aquesta es manifesta inicialment per edemes i ascites, passant posteriorment al desenvolupament d'hiponatrèmia com a conseqüència del predomini de la retenció d'aigua respecte a la sal. Vam observar que l'excreció urinària d'aquaporina-2 disminuïa de forma progressiva a mesura que progressava la retenció hidrosalina. Aquestes dades apunten a que hi hauria menor quantitat d'aquaporina-2 al túbul col·lector i una menor permeabilitat osmòtica d'aquest epiteli que podria representar una resposta adaptativa del ronyó a la retenció hidrosalina i a l'expansió del volum del fluid extracel·lular. D'altra banda, no es van trobar diferències en l'excreció urinària d'aquaporina-1 entre individus controls i pacients cirròtics amb o sense ascites, tot i que aquest canal d'aigua s'ha trobat disminuït en pacients amb síndrome hepatorenal.Per a estudiar amb major profunditat l'excreció de les proteïnes renals de la membrana apical en exosomes a l'orina vam estudiar en primer lloc la localització de les proteïnes NKCC2 i les aquaporines-1 i -2, així com les formes fosforilades pNKCC2 i pS256-Aquaporina-2, a nivell ultraestructural en ronyó humà. Així per primera vegada vam detectar les proteïnes NKCC2 i les aquaporines-1 i -2, així com les formes fosforilades, associades a unes estructures vesiculars que podrien correspondre's als cossos multivesiculars. D'altra banda vam confirmar totes les proteïnes anteriorment esmentades associades a exosomes urinaris en orina humana ultracentrifugada. Finalment en l'últim treball amb pacients amb hipertensió essencial vam estudiar com la ingesta de sal modificava la pressió arterial i l'excreció de diferents transportadors de sodi (NKCC2 i NCC) en exosomes urinaris. Tot i que en aquest estudi es van detectar per primera vegada els transportadors NKCC2 i NCC en exosomes urinaris pacients hipertensos, l'excreció en exosomes urinaris d'aquests transportadors no permetia preveure quina regió tubular podria estar implicada en la patogènia de la sal sensibilitat.En definitiva, els resultats d'aquess estudis ens han permès aprofundir en els mecanismes fisiopatològics que intervenen en la susceptibilitat d'aquestes patologies i més important encara, ens han donat les bases per posa a punt nous projectes en patologies humanes amb una orientació fisiopatològica i sobretot terapèutica. / In this thesis we have studied the urinary excretion of renal sodium transporters and water channels in several pathologies of the water and salt balance, likewise the expression of these proteins in the kidney of rats in an experimental model of hypertension induced by cyclosporine.At the first work, in an experimental model of rat with hypertension induced by cyclosporine we detect that the rats with hypertension had an increased expression of the renal sodium cotransporter NKCC2. This increase could facilitate the sodium reabsorption in the thick ascending limb, so there would be an increase of the plasmatic volume and the consequent rise of the blood pressure. The observed augment of aquaporin-1 in the rats treated with cyclosporine could be increasing a more effective water reabsorption in the proximal tubule, while the reduction of the expression of the aquaporin-2 in the treated rats would lead to a diminished permeability of the collecting duct and it could represent a compensatory mechanism to the increased reabsorption of sodium and water.Furthermore we studied the urinary excretion of aquaporin-1 and -2 of cirrhotic patients in the different phases of the sodium and water retention (cirrhosis without ascites, cirrhosis with ascites and hepatorenal syndrome). This disease progresses to sodium retention which is often associated with an impaired ability to eliminate solute-free water, which may lead to dilutional hyponatremia from a disproportionate increase in total body water relative to total sodium content. We detected a progressive decrease in urinary aquaporin-2 excretion as the severity of cirrhosis increased, from compensated cirrhosis to cirrhosis with ascites and hepatorenal syndrome. The reduction of aquaporin-2 would mean a decreased abundance of renal aquaporin-2 and therefore lower water permeability in the collecting tubules. This may represent an adaptive renal response to sodium retention, with expansion of extracellular fluid volume and dilutional hyponatremia observed in those who have cirrhosis with ascites. On the other hand, there were no differences between healthy subjects and patients with cirrhosis with or without ascites in urinary excretion of aquaporin-1, but urinary aquaporin-1 excretion of those with hepatorenal syndrome was extremely low. To study in depth the excretion of apical renal proteins via exosomes to the urine, first of all, we investigated the localization of the proteins NKCC2 and aquaporins-1 and -2, as well as the phosphorylated proteins pNKCC2 and pS256-aquaporin-2 at ultrastructural level in human kidney. So, for first time we could detect all these proteins, but aquaporin-1, associated to vesicles that could be the multivesiculars bodies. On the other side, we also confirmed the presence of all those proteins, including aquaporin-1, associated to urinary exosomes from ultracentrifuged human urine. Eventually, at the last work with patients with essential hypertension we studied how the salt intake could modify the arterial blood pressure and the excretion of two renal sodium transporters (NKCC2 and NCC) in urinary exosomes. Even though it was the first time NKCC2 and NCC were detected in urinary exosomes from hypertensive patients, the excretion of these transporters through exosomes in the urine could not predict which part of the renal tubule might be implicated in the pathogenesis of salt sensitive hypertension.

Les aquaporines (AQPs) sont de petites protéines membranaires permettant le passage facilité de l’eau, du glycérol et de certains solutés à travers les membranes biologiques. Elles jouent d’importants rôles de transport transmembranaires ou transcellulaires dans diverses cellules telles que les cellules rénales, mais aussi dans les kératinocytes de l'épiderme. L’épiderme est un épithélium pluristratifié en constant renouvellement. Le calcium extracellulaire joue un rôle important dans le mécanisme de différenciation des kératinocytes.Dans ce travail, nous avons montré que la différenciation induite par le calcium de kératinocytes humains s'accompagne de l’adressage de l’aquaporine-3 (AQP3) du réticulum endoplasmique, vers les membranes plasmiques. Pour étudier la cinétique et les bases moléculaires de cette régulation, notre objectif était de produire des clones stables d'une lignée de kératinocytes humains en culture (HaCat) exprimant une AQP3 fluorescente. Malgré plusieurs tentatives, je n'ai pas pu obtenir ces clones stables. J'ai alors choisi un autre modèle de cellules épithéliales en culture; les cellules MDCK. Nous avons produit deux lignées stables de MDCK exprimant des aquaporines fluorescentes: l'AQP3-GFP et l'AQP2-mCherry. De manière intéressante, dans les cellules MDCK, l'AQP3 -GFP reproduit la régulation de son adressage par le calcium observée dans les kératinocytes humains; dans des cellules MDCK cultivées en présence de 0,15mM de Ca2+, l’AQP3-GFP est localisée dans le réticulum endoplasmique, tandis qu’à 1,5mM de Ca2+ extracellulaire, celle-ci est localisée aux membranes plasmiques. Dans les mêmes conditions, l'AQP2-mCherry conserve une localisation intracellulaire. Par des expériences de « calcium switch », nous avons étudié la cinétique du trafic cellulaire de l'AQP3 et montré que l'adressage de l’AQP3 à la membrane plasmique en réponse au calcium est lent (6h minimum) et semble dépendant non seulement de la différenciation cellulaire, mais aussi de l'établissement de la polarité cellulaire. A l’aide d’inhibiteurs de la PLC et de la PKC, nous avons montré l’implication de cette voie de signalisation, qui dépend du calcium, dans le trafic de l’AQP3. De plus, l'adressage membranaire de l'AQP3 est dépendant du cytosquelette d’actine.En conclusion, nous montrons pour la première fois une régulation du trafic intracellulaire d'une aquaporine par le calcium au cours de la différenciation et de l'établissement de la polarité cellulaire de cellules épithéliales. Cette régulation permet probablement l'hydratation de l'épiderme humain, sans remettre en cause la barrière de perméabilité que constitue la peau. / The aquaporins (AQPs) are small membrane proteins forming water channels and transporters for smal solutes like glycerol. The AQPs play important roles in transmembrane or transcellular transports in various cells, like kidney cells, but also in skin epidermis keratinocytes. The skin epidermis is a pluristratified epithelium, undergoing continuous renewal. Extracellular calcium plays an important role in the differentiation of keratinocytes.In this work, we demonstrate that during calcium-induced differentiation of human keratinocytes, aquaporin-3 (AQP3) is translocated from the endoplasmic reticulum to plasma membranes. In order to study the kinetics and the molecular bases of this regulation, our goal was to produce stable clones of a human keratinocyte cell line (HaCat) expressing a fluorescent AQP3. Despite several trials, i was not able to obtain such clones. Thus i pursued with another epithelial cell line: MDCK cells. We have produced two lines of MDCK cells stably expressing fluorescent AQPs: AQP3-GFP and AQP2mCherry. Interestingly in MDCK cells, AQP3-GFP reproduced the regulated intracellular trafficking observed in human keratinocytes; in MDCK cells grown in a medium containing 0.15 mM Ca2+,, AQP3-GFP was localized in the endoplasmic reticulum. After extracellular Ca2+ was raised to 1.5 mM, AQP3-GFP was seen in plasma membranes. In the same conditions, AQP2-mCherry remained intracellular throughtout the experiment. With calcium-switch experiments, when have then studied the kinetics of AQP3 trafficking. We have shown that targeting of AQP3 to plasma membranes is a slow process (at least 6h) and seems dependent not only of cell differentiation, but also on the establishment of cell polarity. Using inhibitors of PLC and PKC, we have shown the implication of this signalling pathway, which is dependent on calcium, in AQP3 trafficking. In addition we found that plasma membrane expression of AQP3 is dependent on actin cytoskeleton.In conclusion, we show for the first time a regulation of intracelluar trafficking of an aquaporin in calcium-induced differentiation and after establishment of epithelial cell polarity. This regulation likely allows human skin epidermis hydration whithout compromising the permeability barrier of skin.

Les modèles actuels de changements climatiques prédisent une réduction globale des précipitations, limitant ainsi la disponibilité en eau des plantes et induisant une augmentation de la fréquence des stress hydriques. Un stress hydrique modéré peut conduire à la fermeture des stomates ce qui diminue l'activité photosynthétique des plantes, et dans les cas les plus extrêmes, induit l’embolie du xylème causée par la rupture de la colonne d'eau. Afin de limiter ces effets délétères, les plantes ajustent en permanence leurs résistances hydrauliques. Les feuilles sont considérées comme la principale résistance aux flux d'eau. La compréhension des mécanismes de régulation de la résistance hydraulique foliaire est donc un enjeu fondamental. Parmi les facteurs influençant potentiellement la résistance hydraulique foliaire, les aquaporines (AQPs) pourraient jouer un rôle prépondérant. Les membres de la famille des PIP (Plasma membrane Intrinsic Protein) sont des AQPs agissant comme des pores permettant un passage sélectif de l'eau au travers du plasmalemme. Ce travail visait à caractériser la conductance hydraulique foliaire (Kleaf l'inverse de la résistance) et à étudier la contribution potentielle des PIP dans cinq espèces tempérées ainsi que chez l’arbre modèle: le peuplier. Les espèces pionnières ont des valeurs de Kleaf élevées, mais l'augmentation de Kleaf en réponse à la lumière est beaucoup plus faible que chez les espèces non-pionnières. Chez le Noyer (Juglans regia), la lumière bleue est responsable de la plupart de l'augmentation de Kleaf et de la modulation transcriptionnelle des PIP. En situation de disponibilité en eau et de lumière non limitante, la Kleaf du peuplier augmente au cours de la journée pour atteindre son maximum à midi. Cette augmentation de Kleaf se produit simultanément avec la transcription et l'accumulation de protéines PIP en réponse à l’éclairement. Cependant, l'expression des gènes PIP est en partie sous influence d’une régulation endogène circadienne. L’influence des AQPs dans la valeur élevée de Kleaf est démontrée par son inhibition en présence d’HgCl2. / Climate changes models predict a global reduction of rainfalls hence limiting plants water availability and increase water stress occurrence. A moderate water stress can lead to stomata closure thereby decreasing the plants photosynthetic activity and in extreme cases, xylem embolism due to the water column breakage. In order to limit such detrimental effects, plants permanently adjust their hydraulic resistances. Leaves are considered as the main bottleneck in plants water fluxes, thus understanding leaf resistance to water flux regulation is fundamental. Within known factors that can potentially influence leaf hydraulic resistance, the aquaporins (AQPs) might have a central role. Plasma membrane Intrinsic Protein (PIP) family members are AQPs acting as pores that selectively allow water to flow through cell membranes. This work aimed at characterizing leaf hydraulic conductance (Kleaf the inverse of resistance) and investigate the potential contribution of PIPs in five temperate tree species and in tree model: Poplar. Pioneer species have high Kleaf values, but the Kleaf increase in response to light is much lower than for non-pioneer ones. In walnut (Juglans regia) blue light is responsible of most of the Kleaf increase and PIP transcript modulation. Under non-limiting light and water availability, poplar leaf hydraulic conductance increases diurnally with a maximum reached at midday. This increase of Kleaf occurs in parallel with PIP transcript and protein accumulation in response to high irradiance. PIP gene expression is also under endogenous circadian regulation to some extent. The involvement of AQPs is demonstrated by the reduction of Kleaf using HgCl2.

Pendant la grossesse, les aquaporines (AQPs) exprimées au sein des membranes fœtales sont essentielles pour assurer l’homéostasie du volume de liquide amniotique (LA), mais leur régulation par l’insuline n’a jamais été explorée chez les femmes diabétiques.Le but de notre étude était de préciser le rôle des AQPs 1, 3, 8 et 9 au sein des membranes fœtales chez des parturientes diabétiques et d’étudier la régulation de leur expression par l’insuline.A partir des 129 membranes fœtales, réparties selon 4 populations (36 témoins, 35 diabètes de type 1 (DT1), 17 diabètes de type 2 (DT2) et 41 diabètes gestationnels (DG)), nous avons établi un profil d’expression qualitatif et quantitatif des gènes des AQPs. Dans un second temps, nous avons étudié la régulation par l’insuline de l’expression des AQPs 3 et 9 au sein d’explants d’amnion et de chorion. L’expression ARN et protéique des AQPs au sein de nos différents fragments de membranes fœtales a été étudiée par RT-PCR quantitative et ELISA. Des membranes fœtales issues de grossesses non pathologiques, séparées en ses 2 feuillets (amnion et chorion), ont été utilisées pour étudier la régulation de l’expression des gènes des AQPs 3 et 9 par l’insuline ainsi que la voie de signalisation de l’insuline au sein de l’amnion. Un test au glycérol tritié a permis l’étude fonctionnelle de l’insuline sur les AQPs. Un inhibiteur de la phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K) est utilisé pour analyser le signal intracellulaire de l’insuline.L’expression du gène de l’AQP 3 est significativement plus faible dans les groupes DT2 et DG. Au sein d’explants de membranes fœtales non diabétiques, il a été observé au sein de l’amnion (mais pas du chorion), une répression significative par l’insuline de l’expression ARN et protéique des gènes AQPs 3 et 9 qui est bloquée par l’inhibiteur de PI3K. Au sein des membranes fœtales, la répression de l’AQP 3 observée in vivo, est permise par l’hyperinsulinisme connu des patientes atteintes de DT2 ou de DG. / During pregnancy, aquaporins (AQPs) expressed in fetal membranes are essential for controlling the homeostasis of the amniotic volume, but their regulation by insulin was never explored in diabetic women.The aim of our study was to investigate the involvement of AQP 1, 3, 8, and 9 expressed in fetal membranes in diabetic parturient women, and the control of their expression by insulin.From 129 fetal membranes in 4 populations, (controls, type 1 (T1D), type 2 (T2D) and gestational diabetes (GD)), we established an expression AQPs profile. In a 2nd step, the amnion was used to study control of the expression and functions of AQPs 3 and 9 by insulin.The expression of transcripts and proteins of AQPs was studied by qRT-PCR and ELISA. We analysed the regulation by insulin of the expression of AQPs 3 and 9 in the amnion. A tritiated glycerol test enabled us to measure the impact of insulin on the functional characteristics. Using an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) we analysed the insulin intracellular signaling pathway.Expression of AQP3 protein was significantly weaker in groups T2D and GD. In non-diabetic fetal membranes, we showed for the amnion (not for the chorion) a significant repression by insulin of the ARN expression of AQPs 3 and 9, which was blocked by PI3K inhibitor.In fetal membranes, the repression of AQP3 protein expression and functions observed in vivo is allowed by the hyper-insulinism described in pregnant women with T2D or GD.

Les aquaporines (AQPs) sont de petites protéines membranaires permettant le passage facilité de l'eau, du glycérol et de certains solutés à travers les membranes biologiques. Elles jouent d'importants rôles de transport transmembranaires ou transcellulaires dans diverses cellules telles que les cellules rénales, mais aussi dans les kératinocytes de l'épiderme. L'épiderme est un épithélium pluristratifié en constant renouvellement. Le calcium extracellulaire joue un rôle important dans le mécanisme de différenciation des kératinocytes.Dans ce travail, nous avons montré que la différenciation induite par le calcium de kératinocytes humains s'accompagne de l'adressage de l'aquaporine-3 (AQP3) du réticulum endoplasmique, vers les membranes plasmiques. Pour étudier la cinétique et les bases moléculaires de cette régulation, notre objectif était de produire des clones stables d'une lignée de kératinocytes humains en culture (HaCat) exprimant une AQP3 fluorescente. Malgré plusieurs tentatives, je n'ai pas pu obtenir ces clones stables. J'ai alors choisi un autre modèle de cellules épithéliales en culture; les cellules MDCK. Nous avons produit deux lignées stables de MDCK exprimant des aquaporines fluorescentes: l'AQP3-GFP et l'AQP2-mCherry. De manière intéressante, dans les cellules MDCK, l'AQP3 -GFP reproduit la régulation de son adressage par le calcium observée dans les kératinocytes humains; dans des cellules MDCK cultivées en présence de 0,15mM de Ca2+, l'AQP3-GFP est localisée dans le réticulum endoplasmique, tandis qu'à 1,5mM de Ca2+ extracellulaire, celle-ci est localisée aux membranes plasmiques. Dans les mêmes conditions, l'AQP2-mCherry conserve une localisation intracellulaire. Par des expériences de " calcium switch ", nous avons étudié la cinétique du trafic cellulaire de l'AQP3 et montré que l'adressage de l'AQP3 à la membrane plasmique en réponse au calcium est lent (6h minimum) et semble dépendant non seulement de la différenciation cellulaire, mais aussi de l'établissement de la polarité cellulaire. A l'aide d'inhibiteurs de la PLC et de la PKC, nous avons montré l'implication de cette voie de signalisation, qui dépend du calcium, dans le trafic de l'AQP3. De plus, l'adressage membranaire de l'AQP3 est dépendant du cytosquelette d'actine.En conclusion, nous montrons pour la première fois une régulation du trafic intracellulaire d'une aquaporine par le calcium au cours de la différenciation et de l'établissement de la polarité cellulaire de cellules épithéliales. Cette régulation permet probablement l'hydratation de l'épiderme humain, sans remettre en cause la barrière de perméabilité que constitue la peau.

La conductivité hydraulique racinaire (Lpr) traduit la facilité du passage de l'eau au travers des racines. Ce paramètre, majoritairement contrôlé par l'activité de canaux hydriques membranaires (aquaporines), est modulable par diverses contraintes environnementales. Ce travail a permis de caractériser, sur un même organisme (Arabidopsis), les effets d'un ensemble de contraintes abiotiques et biotiques, représentatives de situations environnementales, sur la Lpr. Alors que la flagelline n'affecte pas la Lpr, les contraintes osmotiques (NaCl, mannitol), oxydantes (H2O2, NO) et nutritionnelles (carence en phosphate, en nitrate, culture des plantes en nuit prolongée) inhibent la Lpr. Par contre, la réalimentation en phosphate ainsi que l'addition de saccharose à des plantes cultivées en nuit prolongée stimulent la Lpr. Une approche phosphoprotéomique quantitative, basée sur l'analyse par MS de protéines microsomales racinaires purifiées à partir de plantes cultivées dans trois de ces contextes (NaCl, NO, phosphate) a permis de quantifier les variations d'abondance de l'ensemble des aquaporines racinaires ainsi que de leur état de MPT. D'un point de vue qualitatif, 22 aquaporines ont été identifiées dans la racine ainsi que plusieurs types de MPTs, incluant des nouveaux sites de phosphorylation (7), de méthylation (13 à 15), de formylation (4) et de déamidation (25 à 26). D'un point de vue quantitatif, cette étude a permis de conclure que les observations réalisées au niveau de la Lpr sont la résultante de mécanismes multifactoriels incluant l'état de phosphorylation des trois sites de l'extrémité C terminale de PIP2;1/2;2/2;3, l'état de phosphorylation de l'extrémité N terminale de PIP1;1/1;2, ainsi que les aquaporines TIPs. Ce travail permet donc de proposer de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la Lpr en réponse à des contraintes de l'environnement / The water uptake capacity of plant roots (root hydraulic conductivity, Lpr) is mainly determined by water channels (aquaporins) and is modulated by environmental constraints. The present work characterised, in a unique organism (Arabidopsis), effects on Lpr of abiotic and biotic constraints representative of environmental situations. Whereas flagelline does not affect Lpr, osmotic (NaCl or mannitol), oxidative (H2O2 or NO) and nutritional (phosphate or nitrate starvation, prolonged night) stimuli inhibit Lpr. However, phosphate and sucrose resupply stimulate Lpr. A phosphoproteomics approach based on MS analysis of microsomal proteins extracted from roots of plants cultivated in different environmental constraints (NaCl, NO,phosphate starvation and resupply) allowed to quantify variations of abundance of roots aquaporins and of their PTMs. As a qualitative point of view, 22 aquaporins were identified in roots as well as several post-translational modifications including new sites of phosphorylation (7), methylation (13 to 15), formylation (4) and deamidation (25 to 26). From a quantitative point of view, the present work drove to the conclusion that the modulations of Lpr result from multifactorial mechanisms including the phosphorylation status of the C terminal part of PIP2;1/2;2/2;3 and of the N-terminal part of PIP1;1/1;2 and TIP aquaporins. This study proposes new molecular mechanisms implicated in Lpr regulation in response to various environmental situations.

Le sujet de l’adaptation aux changements climatiques est devenu l’un des sujets contemporains les plus importants dans la vigne. Une grande focalisation a été mise sur la compréhension des effets du porte-greffe sur la croissance du scion, l’absorption des nutriments, et la tolérance au stress, dans l’objectif final de développer de nouveaux porte-greffes qui facilitent l’adaptation au changement climatique. L’objectif de cette thèse est d’examiner comment les différences dans la résistance à la sécheresse entre les génotypes peut résulter en de grandes différences dans leur capacité à maintenir leur croissance racinaire en situation de stress. Une meilleure compréhension sur la manière dont la structure, la croissance racinaire et l’absorption d’eau répondent au stress nous permettra de mieux comprendre quels sont les aspects de la physiologie racinaire qui contribuent à la tolérance face à la sécheresse. Des recherches précédentes qui s’étaient focalisées sur l’absorption d’eau racinaire chez la vigne ont suggéré que l’absorption d’eau racinaire pouvait être fortement liée à la vitesse de croissance racinaire instantanée (voir Gambetta et al. 2013). Cette observation implique que des différences entre les génotypes dans la résistance face à la sécheresse pourrait largement résulter de leur capacité à maintenir la croissance racinaire en conditions de stress. Deux porte-greffes de vigne avec des capacités contrastées en matière de résistance à la sécheresse, le Riparia Gloire de Montpellier (RGM) et le 110 Richter (110R) ont été sélectionnés pour étudier dans cette thèse. RGM est considéré comme sensible à la sécheresse, tandis que 110R est fortement résistant à la sécheresse (Carbonneau 1985). La thèse a examiné la relation entre la croissance racinaire et la capacité de résistance à la sécheresse en évaluant la vitesse de croissance racinaire, la conductivité hydraulique à travers deux variétés de porte-greffe en conditions de déficit en eau. Le niveau de l’expression des gènes d’aquaporines (via la qPCR et l’ARNseq) et leur contribution à la conductivité hydraulique racinaire ont été analysés dans les radicelles afin d’obtenir une meilleure compréhension sur les mécanismes impliqués dans la régulation de l’absorption de l’eau racinaire et la conductivité hydraulique au cours du développement et en réponse à un manque d’eau.Le traitement de stress d’eau prolongé a diminué le potentiel hydraulique de la plante. La croissance racinaire individuelle est très hétérogène : bien que le traitement de sécheresse réduise l’élongation racinaire en moyenne, la vitesse de croissance racinaire varie tout de même énormément. Un haut niveau de stress hydrique a réduit significativement la vitesse de croissance racinaire moyenne à la fois pour RGM et 110R. Globalement, la vitesse de croissance racinaire moyenne a montré une tendance réduite au cours du développement de la plante. La température du sol est aussi un facteur qui affecte la croissance racinaire. Pour RGM et 110R, en conditionsIIde bon arrosage et de stress hydrique, la vitesse de croissance quotidienne moyenne a été positivement corrélée avec la température du sol quotidienne moyenne. En conditions de bon arrosage, des vitesses de croissance racinaires plus importantes ont été constamment observées chez 110R par rapport à RGM, ce qui pourrait être une explication possible de sa meilleure résistance à la sécheresse par rapport à 110R. [...] / The subject of adaptation to climate change has become one of the most important contemporary topics in grapevine. Much focus has been placed on the understanding of rootstocks effects on scion growth, nutrient uptake, and tolerance to stress, with the ultimate goal of developing novel rootstocks that facilitate adaptation to a changing climate. The purpose of this thesis is to examine how differences in drought resistance between genotypes could result largely from differences in their ability to maintain root growth under stress. A better understanding of how root structure, growth, and water uptake respond to stress will allow us to better understand what aspects of root physiology contribute to drought tolerance. Previous research focused on root water uptake in grapevine suggested that root water uptake could be tightly coupled to a root’s instantaneous rate of growth (see Gambetta et al. 2013). This observation implies that differences in drought resistance between genotypes could result largely from their ability to maintain root growth under stress. Two grapevine rootstocks with contrasting drought resistance capacity, Riparia Gloire de Montpellier (RGM) and 110 Richter (110R), were selected to study in this thesis. RGM is considered as sensitive to drought, while 110R is highly resistant to drought (Carbonneau 1985). The thesis examined the relationship between root growth and drought resistant capacity by assessing root growth rate, hydraulic conductivity across two rootstock varieties subjected to water deficit. The role of aquaporin gene expression (via qPCR and RNAseq) and their contribution to root hydraulic conductivity were analyzed in fine roots in order to obtain a better understanding on the mechanisms involved in the regulation of root water uptake and hydraulic conductivity across development and in response to water deficit.Prolonged water stress treatment decreased plant water potential. Individual root growth is very heterogeneous, although drought treatment reduces root elongation on average, individual root growth rate still varies enormously. High level of water stress significantly reduced average root growth rate for both RGM and 110R. Globally, average root growth rate showed a decreased trend over plant development. Soil temperature is also a factor that affects root growth. For both RGM and 110R, under both well-watered and water-stressed conditions, average daily root growth rate was positively correlated with average daily soil temperature. Under well-watered conditions, higher root growth rates were constantly observed in 110R compared to RGM, which could be one possible explanation for the higher capacity in drought resistance of 110R.Root hydraulic conductivity (Lpr) was influenced by both water stress treatment and plant developmental stage. Generally, for both RGM and 110R, Lpr was significantly reduced under water stress in early stage. In mid and late stages, no significant differences in Lpr were observedIVbetween well-watered and water-stressed plants. Changes in individual root Lpr in response to pre-dawn leaf water potential (ᴪpredawn) were investigated as well. Lpr showed a fast drop in the beginning of water stress treatment when ᴪpredawn was higher than -0.5 MPa. However, with ᴪpredawn getting more negative, e.g. from -0.4 MPa to -2.0 MPa, the range of Lpr values measured in our study maintained constant. Lpr of well-watered plants decreased as well even though their ᴪpredawn was maintained at a high level (< 0.1 MPa) during the period of the experiment. [...]