De nombreuses protéines ou domaines de protéines sont intrinsèquement non structurés/désordonnés (IUPs), mais possèdent néanmoins des fonctions diverses et importantes in vivo. La technique de choix pour étudier les IUPs est la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Cependant, pour obtenir de l'information à partir des différentes expériences de RMN possibles, les spectres doivent d'abord être attribués. Pour faciliter cette attribution, un outil graphique, semi-automatique qui utilise le concept des plans produit et somme a été développé. Cet outil a permis l'étude de deux IUPs individuelles, Tau et NS5A VHC. Les résonances RMN du squelette et des Cb ont été attribuées entièrement pour deux fragments de Tau (F3 et F5) et partiellement pour Tau entier P301L. Ces attributions RMN de Tau pourraient mener à davantage de compréhension sur le comportement structural de cette protéine quand elle se lie à, ou polymérise des microtubules. Aussi la formation des agrégés de Tau, qui est une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, pourrait être étudiée plus en détail. Dans un deuxième temps, la protéine non structurale 5A (NS5A) du virus de l'Hépatite C (VHC) a été étudiée. Les propriétés structurales du deuxième et troisième domaine (sur trois) de cette protéine ont été évaluées. De la structure hélice alpha résiduelle a été observée, ce qui pourrait indiquer des régions prédisposées à interagir avec d'autres partenaires cellulaires. On a également examiné l'interaction entre CypA et CypB et les domaines D2 et D3 de NS5A, car ces PPIases pourraient jouer un rôle dans la réplication de VHC / Many proteins and protein regions have been shown be intrinsically unstructured/disordered (IUPs) and still carry out diverse and important functions in vivo. The technique of choice for studying IUPs is Nuclear Magnetic Resonance (NMR). However, to be able to obtain information of many possible NMR spectra, these must first be assigned. This process is complicated in the case of IUPs by the increased amount of signal overlap. To facilitate the assignment, a graphical semi-automatic assignment tool using the concept of product and sum planes was developed. Using this tool, the study of individual IUPs by NMR became conceivable. A first considered IUP is human Tau. The backbone and Cb resonances have been fully assigned for two Tau fragments (F3 and F5) and partially assigned for full-length Tau P301L. These NMR assignments of Tau could eventually lead to more insight in the structural behaviour of the protein upon its binding to or polymerisation of microtubules, and in its aggregated form which is observed to be one of the hallmarks of Alzheimer's disease. Secondly, the Hepatitis C virus (HCV) non-structural protein 5A (NS5A) was considered. The structural properties of both the second and third domain (out of three) of this protein have been assessed and some residual a-helical structure was observed, which could be indicative of regions prone to interaction with other cellular partners. We have also examined the interaction between both CypA and CypB and the domains D2 and D3 of NS5A, as these PPIases might be involved in HCV replication

Leishmania est un parasite intracellulaire reconnu pour sa capacité à inhiber sa cellule hôte, le macrophage, et ainsi favoriser sa survie. Il parvient principalement à altérer des fonctions impliquées dans l’action microbicide du phagocyte (dont le monoxyde d’azote (NO)) ou dans la réponse immunitaire. On a associé ce phénomène à l’altération de plusieurs voies de signalisation de la cellule telles celles dépendantes du Ca2+, de la PKC, de JAK2/STAT1α et de ERK1/2. Il a précédemment été démontré que le parasite pouvait, en outre, induire l’activité des phosphotyrosines phosphatases (PTP) et plus spécialement celle de la PTP SHP-1. On reconnaît cette dernière comme un puissant inhibiteur de la signalisation cellulaire dépendante des tyrosines kinases. De plus, l’usage d’inhibiteurs de PTP a démontré l’importance de ces dernières dans la survie du parasite in vivo et in vitro. C’est pourquoi l’objectif de la présente thèse était de vérifier le rôle de la SHP-1 dans la survie du parasite in vivo et in vitro mais également dans l’inactivation du macrophage provoquée par l’infection. Pour ce faire, des souris déficientes en SHP-1, les viable motheaten, et des macrophages dérivés de celles-ci ont été infectés par Leishmania. In vivo, l’infection et l’inflammation chez les souris déficientes en SHP-1 étaient quasi inexistantes, grâce à l’action des cellules inflammatoires, surtout les neutrophiles, et à l’augmentation de la production de NO. Ce recrutement inflammatoire accru était causé par l’élévation des taux de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines. In vitro, l’absence de la SHP-1 empêchait la survie du parasite selon des mécanismes dépendants et indépendants de la production de NO. Le rôle de la SHP-1 dans l’inhibition de cette production se situait au niveau de l’inactivation des kinases JAK2 et ERK1/2 et des facteurs de transcription NF-κB et AP-1. Par contre, l’inactivation spécifique du facteur de transcription STAT1α ne dépendait pas de l’activité de la SHP-1 mais plutôt de celle des protéasomes cellulaires. En définitive, cette thèse démontre que l’activation de la SHP-1 est essentielle à la survie de Leishmania et à sa propagation, mais qu’il parvient également à inactiver le macrophage en favorisant la dégradation de STAT1α par les protéasomes. / The intracellular protozoan parasite Leishmania has been known for its ability to evade its host immune response principally by inhibiting phagocyte functions. Indeed, infected macrophages show a loss of microbicidal (NO, oxygen intermediates) and immunological activities (IL-1, IL-12, MHC). This allows for its replication and invasion of the host. These dysfunctions are correlated by alterations in signalling cascades depending on Ca2+, PKC, JAK2/STAT1α and MAPK ERK1/2. It has also been reported that Leishmania infection could induce the macrophage phosphotyrosine phosphatase (PTP) activity and more specifically that of PTP SHP-1, a strong negative regulator of tyrosine kinase-dependent pathways. Moreover, the use of PTP inhibitors showed their essential role in parasite survival both in vivo and in vitro. These results suggested a potential role for SHP-1 in parasite survival and in the inhibition of macrophages. To address this issue, SHP-1-deficient mice, the viable motheaten mice, and their bone marrow-derived macrophages were infected with Leishmania. Results show that footpad inflammation was virtually absent in SHP-1-deficient mice and depended on inducible nitric oxide synthase increased activity as well as inflammatory cells recruitment, especially neutrophils. This recruitment seemed to be due to increases in pro-inflammatory cytokines expression and secretion and in chemokine gene expression. SHP-1-deficient mice had both more inflammatory cells numbers and a higher ratio of neutrophils, recognized for their microbicidal action against Leishmania. In vitro, SHP-1 activity seemed essential for parasite survival by allowing the attenuation of NO-dependent and -independent mechanisms. Furthermore, its alteration of NO generation in infected cells was due to the dephosphorylation of JAK2 and ERK1/2 as well as inhibition of transcription factors NF-κB and AP-1. However, SHP-1 was not responsible for the inhibition of transcription factor STAT1α seen in infected macrophages. This phenomenon seemed due to specific proteasomal degradation of the protein. Overall, the present thesis demonstrates that Leishmania is a versatile parasite able to use several strategies to alter its host responsiveness, two of them being the essential activation of SHP-1 and the targeting of STAT1α to the proteasomal degradation pathway.

La cavéoline-1, une petite protéine membranaire de 21 kDa, est la protéinemembranaire majoritaire d'invaginations de la membrane cytoplasmique appeléescavéoles. Enrichis en cholestérol et sphingolipides, ces domaines ont un rôleimportant dans de nombreux aspects de la vie cellulaire et constituent une véritableplateforme d'interactions protéiques et lipidiques. Ces dernières années, malgré lenombre important de travaux concluant à l'implication de la cavéoline-1, ou descavéoles, dans de nombreux processus cellulaires ou pathologiques, les donnéesquant à l'organisation de cette protéine au sein de la membrane plasmique restent trèséparses. Aussi, l'objectif principal de ce travail est de contribuer à l'acquisition dedonnées structurales sur cette protéine. Ce travail se base sur les expressionshétérologues d'une isoforme de la cavéoline-1 canineou de l'un de ses fragments, dans un hôte bactérien, sous la forme de protéines defusion associées à la Maltose Binding Protein. Ces expressions induisent laformation de vésicules intracytosoliques composées majoritairement de la protéineexprimée. Aussi, la première partie du travail est consacré à la mise en place d'unprotocole de purification de ces vésicules dans des conditions natives, répondant aucritère de réaliser une étude structurale de cette protéine n'impliquant pas l'usage dedétergent. La deuxième partie porte sur une application potentielle de ces vésicules, eten particulier pour des essais de caractérisation d'une enzyme membranaire,la glutathion-S-transférase microsomale de rat. Enfin une troisième partie est dédiée àl'analyse de simulations de dynamique moléculaire dans le cadre d'étudesd'interactions au sein de systèmes membranaires. / Caveolin-1, a 21 kDa membrane protein, is the principal membrane protein ofcytoplasmic membrane domains named caveolae. Specifically enriched incholesterol and sphingolipids those domains are important in many aspect of the cell's life and make up a proteins and lipids interaction platform. In the past years, despite a large number of publications stating the implication of caveolin-1 or caveolae in many cell processes and pathologies, very few is known about theway this protein is organized at the cell membrane. Hence, the main purpose of thiswork is to contribute to the acquisition of structural data on this protein. At the base of this work is the heterologous expression within a bacterial host, and as a fusion protein, of the canin beta isoform of cavéolin-1 or one of its fragment. These expressions lead to the formation of cytoplasmic vesicles composed mainly ofthe expressed protein. Thence, the first part of this work focus on developping a method to purify those vesicles that does not rely on using any kind of detergent which could enable structural studies in a native environnment. The second part present a potentiel application of those vesicles and inparticular the use of those vesicles to characterize a membrane enzyme, namelythe murin microsomal glutathion-Stransferase. The last part will be a contribution to data analysis within the context of molecular dynamics simulationof membraneous systems.

La réponse immunitaire des plantes dépend entièrement du système immunitaire inné. La perception extracellulaire de motifs moléculaires conservés associés aux pathogènes/microbes (P/MAMP) par des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) induit un type de réponse immunitaire dénommé PTI (pattern-triggered immunity). Certains pathogènes interceptent cette réponse en injectant, dans les cellules hôtes, des protéines appelées effecteurs, qui peuvent être détectés par des récepteurs immunitaires intracellulaires de la famille des NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing). En cas de détection, les NLRs induisent une réponse immunitaire rapide, appelée ETI (effector-triggered immunity), souvent associée à la mort des cellules hôtes. Un des NLRs présents chez l’orge, MLA, confère une ETI protectrice contre Blumeria graminis f. sp. hordei. Bien que MLA n’ait d’homologues qu’au sein de la famille monocotylédone des Triticeae, MLA est fonctionnel dans une lignée transgénique chez l’espèce dicotylédone A. thaliana. Ceci indique que le mécanisme de résistance a été conservé chez les plantes dicotylédones et monocotylédones. Chez la plante dicotylédone Nicotiana benthamiana, l’expression transitoire du domaine coiled-coil (MLACC) qui correspond aux 160 premiers acides aminés en N-terminus de MLA, suffit à induire la mort cellulaire. MLA pourrait ainsi initier un mécanisme de signalisation conservé, via son domaine MLACC. Le but de cette thèse a été de décrire le(s) mécanisme(s) de signalisation en aval de MLACC dans des lignées transgéniques d’A. thaliana. L’expression conditionnelle de MLACC induit une réponse similaire à la réponse immunitaire, et caractérisée par l’initiation d’une reprogrammation transcriptionnelle massive à ~2 h post-induction (hpi) suivie par la mort des cellules à ~4 hpi. Cette réponse est aussi induite par MLACC chez une lignée transgénique d’A. thaliana qui est simultanément dépourvue de trois composants (PEN2, PAD4 et SAG101) et des trois principales phytohormones (éthylène, acide jasmonique et acide salicylique) impliqués dans la régulation immunitaire. La comparaison des profils d’expression au cours du temps chez des plantes exprimant MLACC, avec ceux induits au cours de l’ETI et de la PTI chez A. thaliana, a révélé de larges similitudes lors de la réponse précoce. Ainsi, la signalisation initiée par MLACC, l’ETI et la PTI pourrait converger rapidement vers une machinerie de transcription commune qui active les gènes de la réponse immunitaire. De plus, ces données indiquent que le domaine MLACC de l’orge suffit à induire la réponse immunitaire normalement associée à l’ETI chez A. thaliana, et que l’activation des gènes de la réponse immunitaire peut se produire indépendamment de la PTI. La plupart (> 74.7%) des 562 gènes significativement induits à 2 hpi sont caractéristiques des gènes de type « immediate early response » puisqu’ils sont induits rapidement sans nécessiter la synthèse de novo de protéine, vraisemblablement par élimination d’un répresseur à courte durée de vie. Les régions 5’-UTR de ces gènes contiennent des motifs fortement enrichis associés à des facteurs de transcription sensibles au Ca2+, tels que le calmodulin-binding transcription activator 3 (CAMTA3) qui est rapidement dégradé au cours de l’ETI. Ceci pourrait expliquer l’inhibition totale de la réponse médiée par MLACC en présence de LaCl3, un inhibiteur des canaux calciques, inhibition qui a aussi été décrite par le passé concernant durant l’ETI et la PTI. J’ai effectué un crible génétique de mutants obtenus par mutagénèse chimique et ainsi identifié trois candidats suppresseurs de la réponse médiée par MLACC. La purification des complexes protéiques associés à MLACC, ainsi qu’un crible en double-hybride chez la levure ont permis d’identifier plusieurs candidats interagissant avec MLACC. Ces approches ont révélé de nouveaux candidats impliqués dans la signalisation médiée par MLACC. / Plants rely entirely on innate immunity to fight pathogens. Extracellular perception of evolutionarily conserved pathogen/microbe-associated molecular patterns (P/MAMP) by membrane-resident pattern recognition receptors (PRRs) leads to pattern-triggered immunity (PTI). Host-adapted pathogens intercept PRR-mediated immunity by delivering effectors into host cells. These polymorphic effectors can be recognized by intracellular immune receptors of the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat (NLR) family. Upon effector recognition, NLRs trigger a rapid immune response, termed effector-triggered immunity (ETI), which is typically associated with a host cell death response. In barley, the NLR MLA confers ETI against the pathogenic powdery mildew fungus, Blumeria graminis f sp hordei. Although MLA orthologues are found only in the Triticeae family of monocotyledonous plants, barley MLA is functional in transgenic dicotyledonous A. thaliana, indicating that the underlying disease resistance mechanism has been evolutionarily conserved for at least 150 Mya in monocot and dicot plants. In dicotyledonous Nicotiana benthamiana, transient gene expression of the coiled-coil (MLACC) domain, consisting of the N-terminal 160 amino acids of the receptor, was sufficient to activate a cell death response, raising the possibility that MLA initiates a conserved signalling mechanism through the MLACC domain. This thesis aimed at identifying signalling mechanism(s) acting downstream of the MLACC module in transgenic A. thaliana. Conditional MLACC expression triggered immune-related responses, characterized by a rapid onset of massive changes in gene expression at ~2 h post induction (hpi), followed by cell death at ~4 hpi. These MLACC–triggered responses are retained in A. thaliana plants simultaneously lacking the immune components PAD4, SAG101, PEN2, and all major defence phytohormones, i.e. ethylene, jasmonic acid, and salicylic acid. A comparison of time-resolved and genome-wide transcript profiles in MLACC-expressing plants with expression profiles induced during ETI and PTI by endogenous A. thaliana NLRs or PRRs revealed at early time points highly similar patterns. This suggests that early signalling mediated by MLACC, ETI, and PTI converges on a common transcriptional machinery that activates immune response genes, indicating that the barley MLACC domain is sufficient to stimulate an ETI response in A. thaliana. This also shows that activation of these immune response genes can occur independently of PTI. Most (> 74.7%) of the 562 genes that were significantly upregulated at 2 hpi in MLACC-expressing plants are immediate early response genes since their induction does not depend on de novo protein synthesis, suggesting that these genes are activated by the removal of short-lived repressors. In the 5’ regulatory regions of the early induced genes, I found a striking enrichment of cis-acting motifs that serve as binding sites for Ca2+-responsive transcription factors, including the calmodulin-binding transcription activator 3 (CAMTA3), which is known to be rapidly degraded during ETI. This might explain complete inhibition of MLACC–mediated responses by the Ca2+ channel inhibitor LaCl3, which was previously also reported for several NLR-mediated and P/MAMP-triggered responses. Using chemical mutagenesis, I identified three candidate suppressor mutants of MLACC-mediated responses. Affinity purification of MLACC complexes and a yeast two-hybrid screen identified several MLACC candidate interacting proteins. Together this has revealed novel candidate components engaged in MLACC signalling.

Les virus influenza de type A (IAV) appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae. Ces virus enveloppés présentent un génome composé de 8 segments d’ARN simple brin, de polarité négative. Chaque segment est encapsidé par les nucléoprotéines (NP) et associé au complexe polymérase viral, hétérotrimère composé des sous-unités PB1, PB2 et PA, pour former la ribonucléoprotéine virale (RNPv). La protéine PB1 est la sous-unité catalytique responsable de l’activité ARN polymérase ARN-dépendante du complexe viral. La RNPv représente ainsi l’unité minimale de transcription et réplication du génome viral. En raison de la faible fidélité de la polymérase virale et l’absence d’activité de relecture, les IAV présentent un taux de mutation élevé, responsable du développement rapide de populations virales d’une grande diversité génétique, appelées quasi-espèces. Des études récentes ont permis d’identifier des mutants présentant une fidélité de réplication augmentée, due à des mutations uniques dans la sous-unité PB1. Comme décrit pour d’autres virus à ARN, différentes mutations peuvent avoir un effet similaire sur l’activité de la polymérase virale. Afin d’approfondir la caractérisation de la protéine PB1 nous avons recherché d’autres positions pouvant avoir un rôle dans la fidélité de la polymérase, la sélectivité des nucléotides ou la processivité du complexe. Pour cela, des banques de séquences PB1 mutées ont été générées par mutagénèse aléatoire pour deux sous-types de virus influenza A, H3N2 et H1N1pdm09, circulant actuellement chez l’homme. A partir de ces banques, des expériences de reconstitution transitoire de RNPv fonctionnelles (minigénome) en présence de ribavirine, un analogue nucléosidique mutagène, ont permis d’évaluer l’activité de la polymérase et de sélectionner, après subdivisions successives des banques, des mutations conférant une résistance au composé mutagène supérieure à celle de la polymérase sauvage. Les mutations ainsi identifiées dans différentes régions du segment PB1 ont ensuite été réintroduites de manière spécifique, par mutagénèse dirigée, dans la séquence du gène PB1. L’impact de ces mutations sur l’activité de la polymérase a été évalué par des expériences de minigénome en présence et absence de ribavirine. Les mutations pour lesquelles la résistance à la ribavirine a été confirmée ont alors été introduites par génétique inverse dans le contexte du génome viral complet. La majorité des mutations s’est avérée viable et a permis l’obtention de virus mutants infectieux. La capacité de multiplication des virus mutants a été évaluée en cellules MDCK et comparée à celle des virus sauvages correspondants, en absence et en présence de ribavirine. Ainsi, deux mutants porteurs de deux mutations différentes, localisées dans des régions distinctes de la protéine PB1, présentent une capacité à résister à la ribavirine supérieure à celle du virus sauvage. L’analyse de la diversité des populations virales, évaluée par séquençage à haut-débit, en utilisant la technologie Illumina, permettra de confirmer si cette résistance à la ribavirine est bien liée à une augmentation de la fidélité de la polymérase virale. Cette étude a ainsi permis de préciser les éléments de la protéine PB1 impliqués dans l’activité et potentiellement la fidélité de la réplication virale pour deux sous-types de virus influenza A / Influenza type A viruses (IAVs) belong to the Orthomyxoviridae family. The genome of these enveloped viruses consists of 8 single-stranded RNA segments of negative polarity. Each segment is encapsidated by oligomers of the nucleoprotein (NP) and associated with the viral polymerase complex, a heterotrimer composed of the PB1, PB2 and PA subunits to form the viral ribonucleoproteins (vRNPs). The PB1 protein is the catalytic subunit of the polymerase complex, harboring the RNA-dependent RNA polymerase activity. The vRNP represents the minimal functional unit for transcription and replication of the viral genome. Given the low fidelity and lack of proofreading activity of their polymerase, IAVs have a high mutation rate leading to the rapid development of viral populations with high genetic diversity, called quasispecies. Recent studies identified mutants with increased replication fidelity, due to single mutations in the PB1 subunit. As described with other RNA viruses, different mutations could have similar effects on the activity of the viral polymerase. To improve the characterization of the PB1 protein, we searched for other positions that may have a role on polymerase fidelity, nucleotide selectivity or complex processivity. For this purpose, random mutagenesis was used to generate libraries of mutated PB1 from influenza A virus subtypes H3N2 and H1N1pdm09, currently circulating in humans. From these libraries, transient reconstitution of functional vRNPs (minigenome) experiments were performed with ribavirin, a mutagenic nucleoside analog, to evaluate the polymerase activity. Upon selection based on the polymerase activity of successively subdivided libraries, PB1 mutations with increased polymerase activity in the presence of ribavirin relative to wild-type were identified in several regions of PB1. These mutations were specifically re-introduced in PB1 by directed mutagenesis. Their impact on polymerase activity was evaluated by minigenome experiments with and without ribavirin. Mutations with confirmed resistance against ribavirin were then introduced in the context of infectious virus by reverse genetics. Most corresponding mutant viruses could be rescued. Their growth characteristics were analysed in MDCK cells and compared to the corresponding wild-type viruses, in the presence or absence of ribavirin. Two mutants carrying two different mutations, located in distinct regions of the PB1 protein, displayed an improved capacity to resist ribavirin relative to the wild-type virus. Viral populations genetic diversity analysis by next-generation sequencing, using Illumina technology, will confirm whether the observed resistance against ribavirin is linked to an increase of the viral polymerase fidelity. This study provides insights into the PB1 domains involved in the activity and potentially the viral replication fidelity of two influenza A virus subtypes

Des fluctuations physiologiques lors de la production et du repliement des protéines, ainsi que des processus pathologiques comme l’infection virale, le vieillissement et les cancers peuvent conduire à un stress du Réticulum Endoplasmique (RE). Il s’agit d’un état caractérisé par l’accumulation de protéines non/mal repliées dans la lumière du RE, qui déclenche la réponse aux protéines dépliées, dite UPR (Unfolded Protein Response). Pour rétablir l’équilibre protéique, la réponse UPR va inhiber la synthèse protéique globale cap-dépendante et favoriser la production de protéases et de chaperonnes associées au RE, notamment la protéine BiP qui joue également le rôle de senseur principal de l’UPR. Notre groupe a précédemment montré que lors d’un stress du RE, une isoforme particulière du suppresseur de tumeur p53, l’isoforme p53ΔN40 (également connue sous le nom de p53/47, Δ40p53, ΔNp53 ou p47) est induite sélectivement par PERK pour conduire à l’arrêt de la division cellulaire en G2 et que ceci dépend de la suppression de l’expression de p21CDKN1A par l’isoforme longue de p53 (p53FL) avec p53ΔN40 agissant notamment au niveau transcriptionnel et traductionnel.Le sujet principal de mon travail a été de comprendre comment p53 induit l’apoptose en cas de stress prolongé du RE. J’ai pu montrer que ceci dépend de la diminution de l'expression de BiP, via une interaction directe de la protéine p53 avec une petite région de la séquence codante de l'ARNm de BIP. Cette trans-suppression de BiP est médiée par un domaine de 7 acides aminés présent dans p53FL et aussi dans p53ΔN40. Cette inhibition de l'expression de BiP pendant les tress du RE conduit à une augmentation de l'apoptose par l'activation de la protéine BIK ainsi libérée d’une interaction répressive avec BiP. De plus, BIK est également activée pendant le stress du RE par p53FL et/ou p53ΔN40 au niveau transcriptionnel. Mes résultats établissent pour la première fois un lien entre la capacité de liaison à l'ARNm de p53 et le contrôle de la traduction de cet ARNm avec une réponse cellulaire particulière.Ce travail montre également que p53 contrôle la traduction de deux ARNm supplémentaires par ce qui semble être deux mécanismes d’action différents. Ces deux mécanismes reposent sur des séquences présentes dans l'ARNm, mais diffèrent sur la nécessité d'une interaction directe avec la protéine p53. Comme montré pour BiP, la capacité de liaison à l'ARNm de p53 bloque la traduction des ARNm de FGF-2 et de p53. Dans cette catégorie, nous pouvons maintenant également inclure l'ARNm de MDMX. D’un autre côté, la suppression de la traduction de p21CDKN1An'a pas été associée à une interaction avec p53, ce qui est aussi le cas pour la suppression de l’expression de MDM2. Les implications physiologiques des suppressions d’expression de MDM2et de MDMX sont discutées.Ces résultats montrent que la suppression de la traduction de l'ARNm médiée par p53 joueun rôle physiologique majeur lors de l'UPR et soutient le rôle spécifique de la p53ΔN40 en réponse à du stress du RE. / Physiological fluctuations of protein production/folding and pathological processes like viralinfection, aging and cancers can lead to Endoplasmic Reticulum (ER) stress. It is a statecharacterized by the accumulation of unfolded or misfolded proteins in the ER lumen that triggers the Unfolded Protein Response. In restoring ER proteostasis, the UPR inhibits global capdependent protein synthesis and promotes proteases and ER chaperons, notably BiP, which also functions as the main UPR sensor. Our group has previously shown that during ER stress, a selective induction of the p53 tumour suppressor protein isoform p53ΔN40 (also known as p53/47, Δ40p53, ΔNp53, p47) by PERK leads to G2 arrest, and that this depends on a suppression of p21CDKN1A expression by p53 full-length (p53FL) and p53ΔN40 acting at transcription and translation. The main topic of my work has been to understand how p53 promotes apoptosis during prolonged ER stress. I could show that this depends on the down regulation of BiP expression via a direct interaction between a restricted region of the bip mRNA's coding sequence and p53 protein. The trans-suppression is mediated by a 7-aa domain of the p53 protein present in both p53FL and p53ΔN40. The inhibition of BiP expression during ER stress leads to an increase in apoptosis via activation of the BH3-only BIK protein by liberating it from a repressive interaction with BiP. Moreover, BIK is further activated during ER stress by transcription induction mediated by p53FL and/or p53ΔN40. These results links for the first time the RNA-binding capacity of p53 and the control of mRNA translation with a particular cellular response. The work also shows that p53 controls the translation of two additional mRNAs in what appears to be two different mechanisms. Both mechanisms rely on sequences present in the mRNAs but differ in the requirement of a direct interaction with the p53 protein. Like with BiP, the RNA-binding capacity of p53 shuts down the translation of fgf-2 and p53 mRNAs. To this category we can now also include the mdmx mRNA. On the other hand, suppression of p21CDKN1A translation was not shown to require an interaction with p53 and this is also the case for suppression of MDM2. The physiological implications of MDMX and MDM2 suppression are discussed. These data illustrate that p53-mediated mRNA translation suppression plays a physiological role during the UPR and further supports the specific role of the p53ΔN40 during ER stress.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 août 2023) / Les cellules tumorales malignes accumulent des altérations génétiques qui favorisent une plasticité nucléaire accrue et l'invasion tumorale. La réorganisation des réseaux d'actomyosine cause une augmentation des forces mécaniques qui sont transmises à l'enveloppe nucléaire par des connexions physiques. Ces connexions physiques permettent aux cellules d'ajuster la réponse nucléaire aux stress du microenvironnement tumoral, incluant les carences d'espace et de nutriments, et d'induire une réponse cellulaire adaptative pour échapper à ces contraintes. En outre, ces forces mécaniques causent souvent des ruptures de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorales. Ces ruptures nucléaires pourraient favoriser les déformations nucléaires requises durant la migration cellulaire à travers les espaces serrés de la matrice extracellulaire. Remarquablement, les cellules tumorales survivent à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire grâce à des mécanismes de réparation efficaces. Cependant, les ruptures nucléaires répétées causent une accumulation de dommages à l'ADN et pourraient contribuer à l'acquisition d'un phénotype tumoral invasif. Ainsi, élucider les mécanismes moléculaires régulant les processus de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire pourrait identifier des cibles thérapeutiques pertinentes pour contrecarrer l'invasion tumorale. La protéine adénovirale E4orf4 induit une activité toxique sélective chez les cellules tumorales. Cependant, les bases moléculaires de l'action sélective d'E4orf4 demeurent méconnues. Il a été démontré qu'E4orf4 réorganise le réseau d'actomyosine à proximité du noyau et provoque des déformations nucléaires dramatiques. Nous avons émis l'hypothèse que la protéine adénovirale E4orf4 exerce une activité toxique sélective dans les cellules tumorigéniques en perturbant la forme et la dynamique nucléaire, notamment via sa capacité à déréguler l'organisation du cytosquelette d'actine. L'objectif général de ces travaux de thèse est d'étudier la contribution des changements de forme et de dynamique nucléaire dans l'activité toxique d'E4orf4 et les mécanismes impliqués. La prémisse est que les cibles cellulaires d'E4orf4 réguleraient le remodelage de l'enveloppe nucléaire par les forces mécaniques et la plasticité nucléaire. Afin d'adresser cette hypothèse, les effets d'E4orf4 sur le réseau périnucléaire d'actine et sur l'organisation de l'enveloppe nucléaire, de même que les effecteurs cellulaires impliqués, ont été étudiés dans une variété de lignées cellulaires tumorigéniques et non-tumorigéniques. Les travaux présentés au Chapitre 1 indiquent qu'E4orf4 perturbe l'organisation de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorigéniques seulement, d'une manière qui dépend du recrutement de fibres contractiles à l'enveloppe nucléaire. Ce processus requiert son association avec la protéine de polarité Par3 et la transmission des forces mécaniques à l'enveloppe nucléaire par le complexe LINC. Remarquablement, cette activité toxique sélective d'E4orf4 est associée à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire provoquant une perte de l'intégrité nucléaire chez une proportion significative de cellules. De plus, les travaux présentés au Chapitre 2 identifient le régulateur épigénétique Ash2L comme substrat de la tyrosine kinase oncogénique Src dont la signalisation est perturbée par E4orf4 qui modifie la réponse nucléaire au stress mécanique. Des analyses moléculaires, biochimiques et fonctionnelles ont révélé que la phosphorylation d'Ash2L par Src est dérégulée par E4orf4 et qu'elle augmente la résistance du noyau aux ruptures de l'enveloppe nucléaire induites soit par E4orf4 ou par un affaiblissement de la lamina nucléaire. De plus, Ash2L régule également les ruptures nucléaires causées par les contraintes physiques appliquées lors de la migration cellulaire sous confinement. Ensemble, ces travaux ont permis d'identifier deux nouvelles cibles cellulaires d'E4orf4, Par3 et Ash2L, qui régulent son action toxique sélective, laquelle est caractérisée par l'induction de ruptures nucléaires répétées. En outre, nos travaux suggèrent que les cibles d'E4orf4 sont des régulateurs authentiques des ruptures nucléaires par le stress mécanique. Ces travaux établissent E4orf4 comme un nouveau paradigme pour étudier les mécanismes qui contrôlent les évènements de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire et la plasticité nucléaire qui ont un effet sur les propriétés métastatiques des cellules tumorales. / Malignant tumor cells accumulate genetic alterations that increase nuclear plasticity and tumor invasion. Reorganization of actomyosin networks increases cellular contractility and mechanical forces that are transmit to the nuclear envelope through physical connections. These physical connections enable the cells to adjust their nuclear response to microenvironmental stress, including space and nutrient deficiencies, and to induce an adaptive cellular response to escape these stresses. In addition, these mechanical forces often cause ruptures of the nuclear envelope in tumor cells. Notably, nuclear ruptures are thought to facilitate the nuclear deformations required during cell migration through the tight spaces of the extracellular matrix. Remarkably, tumor cells can survive repeated nuclear ruptures using efficient nuclear envelope repair mechanisms. However, repeated nuclear ruptures cause DNA damage accumulation and could contribute to a more invasive tumor cell phenotype. Thus, understanding the biology of nuclear envelope rupture and repair processes is therapeutically relevant. The adenoviral protein E4orf4 exerts tumor cell selective killing. However, the molecular basis for the selective action of E4orf4 remains poorly understood. E4orf4 has been shown to reorganize the actomyosin network near the nucleus and to cause dramatic nuclear deformations. We hypothesized that E4orf4 exerts a selective toxicity by disrupting the nucleus' shape and dynamics, notably through its capacity to deregulate the actin cytoskeleton organization. The general objective of this thesis work is to study the contribution of the modifications of the nucleus' shape and dynamics in the cytotoxic activity of E4orf4, and identify the mechanisms involved. The premise is that the cellular targets of E4orf4 would regulate the remodeling of the nuclear envelope by mechanical forces and nuclear plasticity. In order to address this hypothesis, we analyzed the effects of E4orf4 on the perinuclear actin network and on the organization of the nuclear envelope in a variety of tumorigenic and non-tumorigenic cell lines and identified the cellular effectors involved. The work presented in Chapter 1 indicates that E4orf4 disrupts the organization of the nuclear envelope in tumorigenic cells only, in a manner that depends on the recruitment of contractile actin fibers at the nuclear envelope surface. This process requires its association with the polarity protein Par3 and the transmission of mechanical forces to the nuclear envelope by the LINC complex. Remarkably, this selective toxic activity of E4orf4 is associated with repetitive ruptures of the nuclear envelope causing a loss of nuclear integrity in a significant proportion of the cells. In addition, the work presented in Chapter 2 identifies the epigenetic regulator Ash2L as a novel substrate of the oncogenic tyrosine kinase Src, that is targeted by E4orf4 and that modifies the nuclear response to mechanical stress. Molecular, biochemical and functional analyzes revealed that Src-mediated Ash2L Tyr phosphorylation is deregulated by E4orf4 and increases the nuclear mechanical resistance to the mechanical stress induced by E4orf4 or lamin A/C deficiency. In addition, Ash2L also regulates nuclear ruptures caused by physical constraints during confined cell migration. Together, this work has identified two novel cellular targets of E4orf4, Par3 and Ash2L, regulating its tumor cell-selective action that is characterized by the induction of repetitive nuclear ruptures. Importantly, these studies suggest that E4orf4's targets are bona fide regulators of nuclear ruptures induced by mechanical stress in tumorigenic cells. This thesis work establishes E4orf4 as a new paradigm for studying the mechanisms controlling nuclear envelope rupture and repair events and nuclear plasticity, which are relevant for the metastatic properties of tumor cells.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Pendant l'évolution des métazoaires, les mécanismes moléculaires qui contrôlent le remodelage de la morphologie des mitochondries sont changés. Ceci a permis le recrutement de cette organelle dans le développement, la signalisation du calcium, et l'apoptose. Une protéine centrale au remodelage des mitochondries est la protéase rhomboïde PARL (presenilin-associated rhomboid-like), mais ces mécanismes de régulation sont toujours inconnus. Dans cette étude, nous démontrons que la phosphorylation et le clivage d'un domaine N-terminal de PARL règlent la morphologie des mitochondries. Dans ce clivage, le domaine C-terminal de PARL joue un rôle structural essentiel. Nos résultats démontrent que la phosphorylation et le clivage de PARL ont un impact sur la dynamique des mitochondries, ce qui nous fournit un modèle pour étudier l'évolution moléculaire de la morphologie des mitochondries. / Remodeling of mitochondria is a dynamic process coordinated by fusion and fission of the inner and outer membranes of the organelle, mediated by a set of conserved proteins. In metazoans, the molecular mechanism behind mitochondrial morphology has been recruited to govern novel functions, such as development, calcium signalling, and apoptosis, which suggests that novel mechanisms should exist to regulate the conserved membrane fusion/fission machinery. Here we show that phosphorylation and cleavage of the vertebrate-specific Pbeta domain of the mammalian presenilin-associated rhomboidlike (PARL) protease can influence mitochondrial morphology. Phosphorylation of three residues embedded in this domain, Ser-65, Thr-69, and Ser-70, impairs a cleavage at position Ser(77)-Ala(78) that is required to initiate PARL-induced mitochondrial fragmentation. Our findings reveal that PARL phosphorylation and cleavage impact mitochondrial dynamics, providing a blueprint to study the molecular evolution of mitochondrial morphology.

La protéine E4orf4 de l’adénovirus humain est membre d’une famille de facteurs tumoricides, qui induisent la mort cellulaire des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules normales. Il a été montré que dans les cellules transformées, E4orf4 induit un programme de mort cellulaire non apoptotique dépendante des kinases Src et d’une dérégulation de la dynamique d’actomyosine. Cette activité toxique d’E4orf4 est déterminée notamment par sa localisation intracellulaire : E4orf4 est initialement nucléaire, puis elle s’accumule graduellement dans le cytoplasme où elle initie un remodelage atypique du cytosquelette d’actine associé à la mort cellulaire. L’inhibition de l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4 empêche également le remodelage de l’actine, et vice versa. Il existe donc un lien fonctionnel entre la dynamique subcellulaire d’E4orf4, le remodelage du réseau d’actine, et l’activité toxique d’E4orf4 ; toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués demeurent peu compris. Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour but d’identifier les effecteurs cellulaires contrôlant la localisation d’E4orf4 et d’étudier leur implication dans son activité tumoricide. Des analyses protéomiques ont identifié la protéine de polarité Par3 (PARD3) comme un partenaire d’E4orf4 requis pour l’induction de son activité toxique dépendante de l’actine. Les résultats suggèrent que Par3 et ses partenaires formant le complexe de polarité Par sont impliqués dans le remodelage d’un réseau périnucléaire d’actomyosine dans les cellules tumorales. Ce phénomène stimule la formation et la rupture de blebs de noyau, menant à des bris transitoires de l’enveloppe nucléaire et permettant l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4. D’autre part, nous avons mis en évidence qu’E4orf4 stimule le recrutement du cochaperon BAG3 et de la machinerie autophagique aux sites de formation des blebs nucléaires. Les résultats suggèrent qu’une voie autophagique dépendante de BAG3 est induite en réponse à E4orf4 afin de faire face au stress mécanique, laquelle pourrait contribuer à maintenir l’intégrité et/ou à réparer l’enveloppe nucléaire après sa rupture. En outre, Par3 et BAG3 contribuent également au remodelage de l’enveloppe nucléaire induit par une diminution de sa rigidité par déplétion des lamines en absence d’E4orf4. Ces résultats suggèrent qu’ils participent à la régulation normale de la mécanique nucléaire dans les cellules cancéreuses. iv Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse appuient un rôle inconnu jusqu’alors pour Par3 et BAG3 dans la plasticité de l’enveloppe nucléaire, qui émerge comme un processus important de la biologie des cellules cancéreuses, contribuant notamment à la migration et à l’invasion tumorale. Cette voie de remodelage du noyau impliquant Par3 et BAG3 pourrait offrir de nouvelles opportunités pour le développement de thérapies moléculaires ciblées. / The human adenovirus E4orf4 protein is considered as a tumoricidal factor, as it induces cell death in tumor cells while exhibiting low toxicity in non-transformed cells. It was demonstrated that E4orf4 engages a non-apoptotic cell death program, which depends on Src-family kinases and perturbations of actomyosin dynamics. This toxic activity relies on E4orf4 localization dynamics: while E4orf4 is initially nuclear, it gradually accumulates in the cytoplasm where it initiates an atypical remodeling of the actin cytoskeleton associated with cell death. Inhibition of E4orf4’s cytoplasmic accumulation also inhibits actin remodeling, and vice versa. Thus, current data support a functional connection between E4orf4’s subcellular dynamics, actin remodeling, and E4orf4-induced cell death in tumor cells; however, the molecular mechanisms involved are misunderstood. The work presented in this thesis was aimed at identifying key cellular effectors that control E4orf4’s localization dynamics and interrogating their role in the regulation of E4orf4’s tumoricidal action. We identified the polarity protein Par3 (PARD3) as a binding partner of E4orf4 that is required for the induction of its actin-dependent toxic activity, using proteomic, biochemical and cellular approaches. The results suggest that Par3 and the other Par complex proteins are involved in E4orf4-induced remodeling of the perinuclear actin network in tumor cells. The resulting increase in perinuclear contractility stimulates the formation and rupture of nuclear blebs, leading to transient breaks in the nuclear envelope, cytoplasmic accumulation of E4orf4, and loss of nuclear compartmentalization. Moreover, we found that E4orf4 triggers the recruitment of the co-chaperone BAG3 and the autophagic machinery at nuclear blebs formation sites. The results suggest that a BAG3-dependent autophagy pathway is induced in response to E4orf4 to cope with mechanical stress, which could participate in maintaining the integrity and/or repairing the nuclear envelope after its rupture. Furthermore, Par3 and BAG3 also regulate nuclear envelope remodeling and integrity in cells depleted of lamins, suggesting that these E4orf4 targets may be bona fide regulators of nuclear mechanics in cancer cells. Thus, the results presented in this thesis support a so-far unappreciated role for Par3 and BAG3 in nuclear envelope plasticity, which emerges as a crucial process regulating cancer vi cell biology, notably during tumor cell migration and invasion. This nuclear remodeling pathway involving Par3 and BAG3 could offer new opportunities for the development of targeted molecular therapies.