La protéine UCP2 (UnCoupling Protein 2) appartient à la famille des transporteurs de la membrane interne de la mitochondrie. Son expression est restreinte à certains tissus comme la rate, l'estomac ou l'intestin. Au niveau cellulaire, UCP2 est particulièrement présente dans les macrophages où elle régule la production de radicaux libres (ROS). L'analyse des souris Ucp2-KO a montré qu'elles survivent mieux à une infection par le parasite Toxoplasma gondii que les animaux sauvages grâce à des macrophages superactifs en terme de production de ROS. Par ailleurs, dans le modèle murin de l'athérosclérose humaine, les souris Ucp2-KO développent des plaques athéromateuses plus instables et plus larges, présentant une forte accumulation de macrophages et des dégats importants liés au monoxyde d'azote (NO). <br />Au cours de ma thèse, nous avons cherché à approfondir les connaissances sur le rôle physiologique d'UCP2 ainsi que sur son activité biochimique.<br />Nous avons démontré que la diminution rapide d'UCP2 en réponse au LPS potentialise l'activation des MAPK dans les macrophages. La mitochondrie via UCP2 est ainsi au coeur d'une boucle d'amplification du signal impliquant la modulation des ROS mitochondriaux. Par conséquent, la signalisation et la vitesse d'activation des macrophages Ucp2-KO est accélérée, conduisant à une production accrue de NO et de cytokines.<br />La pertinance de ces résultats a ensuite été testée in vivo avec un volet infection et un volet auto-immunité. L'infection des souris par la bactérie Listeria monocytogenes a révélé une meilleure résistance des souris Ucp2-KO. Une production accrue de cytokines pro-inflammatoires chez les souris Ucp2-KO ainsi qu'un recrutement plus important de phagocytes au niveau de leur rate soulignent le rôle régulateur d'UCP2 sur l'immunité innée. En ce qui concerne, l'auto-immunité, l'induction expérimentale d'un diabète de type 1 est nettement accélérée chez les souris Ucp2-KO. L'analyse de ces souris montrent un rôle capital des macrophages dans le développement de la maladie grâce à leur forte capacité de production de cytokines et de NO.<br />L'activité biochimique d'UCP2, c'est-à-dire son activité de transport, a également été abordée. La glutamine est un inducteur spécifique de l'expression d'UCP2. Par conséquent, la comparaison du métabolisme de la glutamine dans les macrophages Ucp2-KO et Ucp2-WT a démontré que l'expression d'UCP2 est requise pour une oxydation correcte de la glutamine.<br />Enfin, grâce à la disponibilité de génomes complets de nombreuses espèces, l'étude phylogénomique des UCP a permis de tracer une histoire de l'évolution des UCP de mammifères et aviaire.<br />Nos études ont mis en évidence la participation d'UCP2 au métabolisme des macrophages. L'altération de celui-ci influe sur la signalisation et l'activité des cellules. Une meilleure compréhension de la fonction d'UCP2 et du métabolisme des cellules immunitaires pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Les cellules tumorales, comme les leucocytes, franchissent l'endothélium vasculaire au niveau des jonctions intercellulaires à l'endroit même où s'exprime la VE-cadhérine, la protéine majeure des jonctions adhérentes. Cette transmigration déstabilise transitoirement les jonctions, ce qui affecte l'intégrité de ce tissu.<br />Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents à l'ouverture des jonctions, nous avons établi la composition protéique du complexe à base de VE-cadhérine des jonctions adhérentes matures de cellules endothéliales primaires confluentes de type HUVEC. Pour cela, nous avons couplé immunoprécipitation et analyse protéomique par spectrométrie de masse (LC-nanoESI-MS/MS). Nous avons ainsi identifié de nouveaux partenaires du complexe à base de VE-cadhérine jamais identifiés auparavant au niveau de la jonction adhérente endothéliale. Parmi ceux-ci se trouvent des protéines liant l'actine telles l'annexine 2 et la moésine.<br />Nos résultats indiquent que l'annexine 2, qui s'accumule à la membrane plasmique au niveau des radeaux de cholestérol, entre en interaction directe avec le complexe à base de VE-cadhérine. Ainsi, l'annexine 2 connecte le complexe jonctionnel à base de VE-cadhérine au cytosquelette d'actine dans les HUVEC confluentes. L'utilisation de siRNA nous a permis d'établir que l'expression de l'annexine 2 est absolument nécessaire au maintien de la VE-cadhérine à la membrane plasmique. Nos résultats suggèrent que l'annexine 2, connectée à l'actine, arrime le complexe à base de VE-cadhérine au niveau des radeaux de cholestérol. En limitant la diffusion membranaire du complexe jonctionnel, ces interactions aboutissent à une consolidation des jonctions adhérentes ce qui contribue à maintenir l'intégrité de l'endothélium vasculaire. Lorsque les HUVEC sont soumises à des molecules destabilisant les jonctions adhérentes, une délocalisation de l'annexine 2 de la membrane vers le cytosol et une perturbation de la localisation de la VE-cadhérine sont observés. Ceci suggère que le prérequis à l'ouverture des jonctions adhérentes nécessite une rupture de l'interaction existant entre le complexe à base de VE-cadhérine et l'annexine 2.<br />La moésine, quant à elle, semble interagir avec le complexe à base de VE-cadhérine dans les jonctions immatures formées entre cellules sub-confluentes. La moésine serait donc impliquée dans l'établissement des contacts intercellulaires précoces plutôt que dans la maturation des jonctions endothéliales.

Les protéoglycannes exercent de nombreuses fonctions par le biais de leur partie protéique ou de leurs glycosaminoglycannes. La caractérisation des interactions entre les glycosaminoglycannes et des protéines a ouvert de larges champs d'applications. Dans ce cadre, deux thèmes de recherche ont été développés. <br />Premièrement, nous nous sommes intéressés à un nouveau protéoglycanne appelé endocan. La développement des capacités de production et de purification de cette macromolécule, nous a permis par différentes approches de déterminer le profil structural de sa chaîne glycannique et de sa partie protéique, mais aussi d'étudier les interactions avec plusieurs de ses partenaires protéiques dont l'interféron Γ et l'hépatocyte growth factor, impliqués respectivement dans l'inflammation et le développement tumoral. Parallèlement, une étude structurale et fonctionnelle de l'interaction entre l'interféron gamma et des glycosaminoglycannes de type héparanes sulfates a conduit au développement de mimes oligosaccharidiques obtenus par synthèse chimique. Parmi ces molécules, certaines permettent de moduler in vitro l'activité de la cytokine, et constituent une base possible pour le développement de nouveaux médicaments.

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) constituent de graves maladies neurodégéneratives atypiques, affectant aussi bien l'homme que l'animal. Ces maladies ont une origine infectieuse, génétique ou sporadique. On distingue chez l'homme la maladie de Creutzfeldt-Jakob, le syndrome de Gerstmann-Sträussler-Sheinker, le nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob dû à l'ingestion d'aliments contaminés, et les formes iatrogènes, qui surviennent le plus souvent à la suite d'une contamination contractée lors d'interventions chirurgicales. Les maladies à prions animales les plus courantes sont l'encéphalopathie spongiforme bovine et la tremblante du mouton. Le facteur commun à toutes ces maladies est la protéine prion ou PrP, présente de façon ubiquitaire dans l'organisme et de manière prépondérante dans le cerveau. La PrP existe sous deux états conformationnels qui ont la même séquence en acides aminés, mais qui possèdent des propriétés physicochimiques différentes. La forme anormale du prion appelée "scrapie" ou "PrPsc " est partiellement résistante aux protéases et plus riche en feuillets b que la PrPc, ce qui lui confère une susceptibilité exacerbée à l'agrégation. L'hypothèse de "la protéine seule" proposée par Prusiner prédit que le titre infectieux serait composé uniquement de la PrPsc, capable de se répliquer de manière autocatalytique en se servant de la PrPc endogène comme matrice de conversion. Les mécanismes moléculaires régissant ce processus sont encore mal connus. Cependant ce phénomène de conversion apparaît comme l'évènement central contrôlant l'infection et sa propagation vers le système nerveux central. Ces processus nécessitent la présence de la PrPc endogène, puisqu'il a été montré que des souris invalidées pour la protéine prion résistent à l'infection et sont viables. Ces observations ouvrent de nouvelles perspectives en terme d'approches thérapeutiques théoriquement envisageables dans le domaine des EST. La PrPc, après une étape de maturation, subit un clivage physiologique à la membrane plasmique en position 111/112 qui conduit à la formation d'un fragment sécrété appelé N1. Des travaux effectués dans notre laboratoire ont montré que ce clivage est constitutif et régulé par la PKC et nécessite l'activité des disintégrines ADAM10 et ADAM17, respectivement. Mon travail de thèse à consisté à étudier ce clivage en identifiant les isoformes de la PKC impliquées, et à démontrer sa régulation par les récepteurs muscariniques.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont les cibles de 50% des médicaments actuellement sur le marché pharmaceutique. La compréhension de leur mode de fonctionnement est donc essentielle au développement de nouvelles molécules capables de cibler spécifiquement ces récepteurs. Ces dix dernières années, les technologies de transfert d'énergie ont permis de révéler la capacité des RCPG, longtemps considérés comme monomériques, à s'organiser en dimères voire en structures oligomériques plus grandes. Toutefois, la caractérisation précise de cette stœchiométrie d'assemblage implique la mise au point de méthodes adaptées. <br />Au cours de ce travail de thèse nous avons développé une approche de FRET en temps résolu permettant de mettre en évidence, à l'aide d'anticorps marqués, des interactions de sous-unités de RCPG à la surface de cellules vivantes. En choisissant le récepteur GABAB comme modèle d'étude, cette approche a permis de révéler l'homo- et l'hétérodimérisation de ce récepteur à la surface cellulaire. De plus, en condition de perméabilisation des cellules, l'oligomérisation de la sous-unité GABAB1 retenue dans les compartiments intracellulaires a pu être caractérisée par cette même approche.<br />Afin d'analyser plus précisément l'organisation du récepteur GABAB, nous avons mis au point une deuxième méthode permettant de marquer irréversiblement à l'aide de fluorophores les sous-unités GABAB1 et GABAB2 présentes à la surface cellulaire. La combinaison de cette méthode de marquage (SNAP-tag) avec une analyse de FRET en temps résolu a permis de caractériser l'organisation oligomérique de ce récepteur. Ainsi, le récepteur GABAB, connu pour être un hétérodimère obligatoire, semble capable de former des oligomères via la sous-unité GABAB1 qui représente un point de contact entre deux hétérodimères. Le rôle d'une telle organisation sur la fonction de ce récepteur reste toutefois indéterminé.

Résumé synthétique des activités de recherche<br />Mon expérience de recherche débuta avec mon DEA puis ma thèse et se continua pendant un séjour post-doctoral à Heidelberg. Depuis Décembre 2000, j'ai rejoint le Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens à Orsay en qualité de chargé de recherche au CNRS.<br />Au Kremlin-Bicêtre, à l'unité 347 de l'INSERM “ Génétique et mécanismes des maladies du foie de l'enfant ” dirigée par Michelle Hadchouel, et sous la direction de Michèle Meunier Rotival, mon travail de thèse se centrait sur l'identification par clonage positionnel du gène dont les dysfonctions sont responsables du syndrome d'Alagille.<br />A Heidelberg, au centre allemand de recherche sur le cancer (le DKFZ) au sein du département "Molecular Embryology" dirigée par Christof Niehrs, la recherche porte sur l'embryogenèse précoce chez les vertébrés en utilisant l'amphibien anoure Xenopus laevis comme modèle expérimental. J'ai travaillé plus particulièrement sur l'analyse systématique des profils d'expression génique, l'étude de l'anatomie moléculaire de l'embryon de vertébré et l'isolement de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle du développement embryonnaire. <br />A Orsay, au sein du Laboratoire de Transgenèse et Génétique des Amphibiens de l'UPRESA808 dirigée par le Pr Maurice Wegnez, je mène une approche de génomique fonctionnelle pour appréhender les mécanismes de régulation transcriptionnelle au cours de la métamorphose chez Xenopus tropicalis.<br /><br />Travail de thèse<br />Le syndrome d'Alagille (AGS, MIM 118450) est défini par l'association d'anomalies cardiaque, hépatique, oculaire, squelettique et un faciès particulier. La région p12 du chromosome 20 humain a été associée à l'AGS par l'observation de patients porteurs de délétions. Mon travail de thèse a consisté à rechercher le gène responsable de ce syndrome par clonage positionnel. Dans un premier temps, une carte physique contenant le locus AGS et couvrant 3,7 Mb a été construite (Pollet et coll., 1995). Dans un deuxième temps, un contig de 67 YACs couvrant 10 Mb a été caractérisé et a permis d'ordonner 72 marqueurs, et de localiser 20 gènes. Le gène Jagged1 a été identifié comme étant le seul localisé dans la région critique, et a été proposé comme gène candidat responsable de l'AGS (Pollet et coll., 1997). Une recherche de mutations a été effectuée sur 109 patients AGS après une première mise en évidence de mutations de ce gène chez des patients AGS par deux équipes américaines. Il en ressort que sur les 59 mutations différentes recensées se situent dans le domaine extracellulaire, la plupart sont de nature à donner naissance à une protéine JAGGED1 tronquée. L'analyse de la transmission des mutations a révélé que 70% des cas de patients AGS sont sporadiques (Crosnier et coll., 1999).<br /><br />Mes travaux de stage post-doctoral ont consisté à caractériser systématiquement l'expression de gènes exprimés au cours de l'embryogenèse par hybridation in situ sur embryons de xénope, à séquencer partiellement les ADNc correspondants et à maintenir une base de données accessible via l'Internet. 10000 clones d'ADNc ont été caractérisés, 1300 ont été séquencés partiellement. Une base de données d'accès public (Axeldb, Pollet et coll., 2000) de type Acedb compile les premiers résultats publiés concernant l'identification de 273 gènes exprimés différentiellement, dont 204 sont nouveaux chez le xénope (Pollet et coll., 1998). 26 % des ADNc caractérisés correspondent à des gènes d'expression régionalisée au cours du développement, 51 % à des gènes d'expression ubiquitaire et 23 % ne donnent aucun résultat. L'analyse globale des profils d'expression révèle l'existence de groupes de gènes différents qui ont une expression régionalisée comparable. De tels groupes de « synexpression » permettent de prédire la fonction de certains gènes pour lesquels l'analyse de séquence reste non-informative (Niehrs et Pollet, 1999).<br /><br />Recherches en cours<br /> Aujourd'hui, le génome complet de plusieurs organismes procaryotes et eucaryotes, unicellulaires et pluricellulaires a été séquencé. Ces avancées ont mis en évidence un important nombre de gènes de fonction inconnue (gènes orphelins). Pour tirer pleinement profit de la connaissance intime des génomes, humain en particulier, une analyse fonctionnelle détaillée et systématique par l'expérimentation et l'étude des génomes d'organismes modèles est nécessaire. L'étude des patrons d'expression des transcrits est une approche qui se prête bien à une analyse systématique et à grande échelle visant à proposer un rôle biologique à chaque gène et peut fournir des informations inédites sur ceux qui sont déjà connus.<br />La grande majorité du programme génétique s'exprime pendant le développement embryonnaire. Le modèle murin reste coûteux et lourd à établir pour étudier les mécanismes moléculaires du développement précoce. En ce sens, le xénope, et en particulier Xenopus tropicalis qui présente tous les avantages de Xenopus laevis plus celui d'être un vrai diploïde, s'annonce comme un modèle vertébré prometteur. Ces caractéristiques vont permettre d'appliquer des systèmes perfectionnés d'études génétiques.<br />Je réalise une étude systématique et à grande échelle d'identification et de caractérisation de l'expression des gènes pendant le développement et la métamorphose chez Xenopus tropicalis. <br />Les différents aspects traités dans ce projet font appel à la réalisation d'un catalogue de gènes (séquençage d'aDNc), à la caractérisation par analyse systématique de profils d'expression génique (puces à ADN) et l'analyse in silico des résultats obtenus (approche bioinformatique). <br />Les connaissances issues de ce projet permettront de constituer un atlas de l'expression des gènes au cours de l'embryogenèse des vertébrés. Cette ressource sera une aide précieuse dans l'étude des réseaux de régulation génétique et des mécanismes par lesquels l'expression différentielle des gènes se met en place au cours du développement embryonnaire. Enfin, les méthodes que je propose d'utiliser vont certainement permettre de définir de nouveaux groupes de synexpression caractéristiques de certaines voies du métabolisme ou de certaines cascades de signalisation.

Notre travail a consisté à étudier 2 gènes impliqués dans la réversion tumorale et régulés par P53.<br />Nous avons identifié dans le promoteur du gène siah-1b une séquence sur laquelle P53 se lie in vitro et in vivo. De plus, nous avons montré la fonctionnalité de cet élément de réponse suite à l'induction de P53.<br />La particularité de ce site, dont la structure diffère fortement du consensus de liaison de P53 à l'ADN, ouvre de nouvelles perspectives dans l'analyse des mécanismes régulés par P53.<br />L'étude de la protéine TSAP6 murine a permis de caractériser son expression au niveau tissulaire et intracellulaire. La fonction de TSAP6 n'étant pas bien connue, nous avons entrepris de l'analyser dans des modèles animaux portant un gène tsap6 muté ou invalidé.<br />La mutation du gène tsap6 Gln-395-Lys induit l'apparition d'une microcytose et d'un emphysème pulmonaire chez la souris. La caractérisation des mécanismes conduisant à ces phénotypes est en cours et nous permettra de mieux comprendre la fonction de TSAP6.

Les cellules phagocytaires constituent la première ligne de défense contre les pathogènes. Leur migration dirigée vers le site infectieux et leurs fonctions microbicides sont l'aboutissement de voies de signalisation intracellulaires sollicitées par la stimulation de récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs de chimioattractants. Après fixation du ligand et transmission du signal par la protéine G, les récepteurs sont phosphorylés et interagissent avec les b-arrestines, protéines d'échafaudage concourrant à l'internalisation des récepteurs. Plusieurs exemples récents suggèrent que les b-arrestines pourraient également participer à la signalisation. <br />Le travail présenté dans ce mémoire concerne les récepteurs de la famille FPR (Formyl Peptide Receptor) et plus spécialement le récepteur FPRL1 (FPR-like 1), pour lesquels de nouveaux agonistes dérivant de protéines bactériennes ou mitochondriales humaines ont été identifiés. La phosphorylation du récepteur FPRL1 a été caractérisée. Il a été montré que les Β-arrestines interagissent avec celui-ci et qu'elles sont indispensables à son internalisation. Diverses approches ont conclu que l'activation rapide des MAP kinases ERK1/2, enclenchée par la stimulation du récepteur FPRL1, est majoritairement dépendante de la protéine G héterotrimérique et qu'il n'y pas de signalisation transmise par les b-arrestines. Enfin, une analyse protéomique des complexes multi-protéiques bâtis autour du couple FPRL1/b-arrestine a été menée par la méthode TAP (Tandem Affinity Purification). Le complexe adaptateur AP3, homologue d'AP2 a été identifié comme partenaire des b-arrestines après stimulation du récepteur FPRL1.

La forme native des hétérodimères de tubulines, indispensable à leur incorporation aux microtubules, est obtenue après prise en charge des tubulines par différentes protéines chaperonnes. Arl2 (ADP Ribosylation Factor-like Protein 2) est une protéine qui régule l'action de certaines protéines chaperonnes des tubulines. En utilisant des modèles de cancer du sein, nous avons montré dans ce travail que des modifications de l'expression d'Arl2 induisaient (1) des perturbations importantes de la dynamique microtubulaire et de la mitose ; (2) une chimiorésistance à différents agents anticancéreux par un mécanisme dépendant de la phosphatase PP2A et associé au facteur de transcription p53 ; (3) des modifications de la croissance tumorale. Les résultats obtenus ont permis d'établir, pour la première fois, un lien entre des événements régulant la production de tubulines fonctionnelles et des perturbations au niveau des phénotypes microtubulaires et cellulaires de cellules cancéreuses humaines. Ce travail ouvre des perspectives nouvelles dans l'identification de facteurs influençant à la fois la chimiorésistance et le développement tumoral de cellules cancéreuses mammaires.

Nous avons exploré dans la présente étude la diversité de la flore fermentaire indigène libanaise de Saccharomyces cerevisiae en collectant des échantillons de moûts de raisins en cours de fermentations naturelles de diverses localités dispersées sur le territoire libanais. Une grande diversité moléculaire de la flore libanaise a été mise en évidence, que ce soit entre différentes localités géographiques, au sein des caves ou au sein des fermentations naturelles. En dépit de cette diversité, plusieurs cas de dominance et de pérennité de souches ont été observés dans les caves vinicoles où les fermentations semblent être conduites par des lignées de souches apparentées. Une telle parenté a aussi été observée dans des zones géographiques restreintes, mais plus la zone s'élargissait moins apparente était la parenté entre souches. La flore libanaise, en dépit de sa diversité, pourrait être dotée d'une certaine spécificité en comparaison aux autres flores vinicoles. L'influence du milieu de fermentation sur la parenté des isolats semble en outre plus importante que l'effet géographique. Nous avons aussi évalué les méthodes moléculaires utilisées pour l'exploration de la diversité ; deux méthodes déjà mises au point auparavant (amplifications de séquences entre deux éléments delta et de loci microsatellites) et une nouvelle méthode que nous avons testé, le MLST. Les deux premières méthodes se sont avérées très utiles pour le typage vu la grande variabilité de leurs marqueurs et par conséquent leur grande capacité de discrimination. Par contre le schéma MLST a montré une capacité de discrimination inférieure à celle des deux autres méthodes. Il pourrait néanmoins être amélioré par l'utilisation de loci plus variables. Mais contrairement aux deux autres méthodes, le MLST est apparu plus utile pour l'inférence des relations phylogéniques, particulièrement pour les souches peu apparentées. La diversité phénotypique accompagnant la diversité moléculaire a été examinée elle aussi en vue d'une potentielle sélection de souches et pour envisager son éventuelle congruence avec la diversité moléculaire. Les souches étudiées de S. cerevisiae ont présenté des capacités fermentaires différentes ce qui pourrait être exploité pour pousser la sélection entamée dans cette étude en vue de futures utilisations oenologiques, notamment dans l'industrie vinicole libanaise. La diversité phénotypique qui a accompagné la diversité moléculaire a montré une certaine congruence avec elle. Cette congruence a été particulièrement reliée à la production élevée d'acétaldéhyde de certains profils moléculaires et elle pourrait éventuellement aider à prédire la production d'acétaldéhyde pour certaines souches.