Le VHB est un problème majeur puisque les 350 millions de porteurs chroniques existant ont un risque accru de développer une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire. Compte tenu du manque de système d'étude du VHB in vitro qui soit facile d'accès et pleinement satisfaisant, l'objectif était d'améliorer l'un de ceux qui utilisent des baculovirus VHB recombinants pour délivrer le génome VHB dans des cellules hépatocytaires. La pertinence de ce système pour réaliser des tests phénotypiques et étudier le « fitness » des mutants résistants aux antiviraux a ensuite été démontrée. Enfin, l'utilisation de ces baculovirus VHB recombinants dans des cellules HepaRG a permis de mettre en évidence une réponse IFN efficace de l'hépatocyte suite à la synthèse des protéines du VHB. Ceci constitue une donnée nouvelle dans l'étude des interactions virus/cellules puisque le VHB était considéré jusqu'à présent comme un virus silencieux vis-à-vis de la réponse innée cellulaire. L'ensemble de ces résultats a des implications importantes dans la compréhension des mécanismes de persistance du VHB et le développement de nouveaux modèles cellulaires d'infection.

La maladie d'Alzheimer se caractérise par des dégénérescences neurofibrillaires, des plaques séniles et une mort cellulaire neuronale massive. Les plaques séniles sont constituées par l'agrégation du peptide amyloïde, formé suite au clivage de la betaAPP, par deux activités enzymatiques, nommées beta- et gamma-secrétases. L'activité gamma-secrétase est portée par un complexe protéique composé au minimum par une préséniline (PS), la nicastrine (NCT), Aph-1 et Pen-2. L'absence d'une seule de ces quatre protéines induit l'inhibition de l'activité gamma-secrétase. Nous avons examiné les processus de dégradation des protéines Aph-1 et Pen-2, ainsi que leur rôle dans la régulation de la mort neuronale. Nous montrons que ces deux protéines, ainsi que la NCT, réduisent la sensibilité des neurones à l'apoptose, en inhibant l'activité de la caspase-3. Ces phénomènes sont contrôlés par l'oncogène p53, dont l'expression est régulée par la NCT, Aph-1 et Pen-2. Cependant, les membres du complexe gamma-secrétase n'engagent pas la même voie de signalisation. La fonction protectrice d'Aph-1 et de Pen-2 requiert l'intégrité du complexe, mais pas l'activité gamma-secrétase, tandis que celle de la NCT est totalement indépendante du complexe. Nous avons examiné la régulation transcriptionnelle de Pen-2 et des présénilines. Nous montrons que le lien existant entre p53 et Pen-2 n'est pas unidirectionnel. La transcription de p53 est régulée par le fragment AICD issu du clivage de la betaAPP. Nos résultats montrent qu'AICD et p53 potentialisent la transcription de Pen-2. De plus, Pen-2 intervient également dans le contrôle transcriptionnel des présénilines, soulignant qu'une modulation de l'expression d'un membre du complexe peut influencer l'expression des autres membres.

Le facteur de transcription Sp1 régule la transcription de nombreux gènes à partir des sites riches en GC. Mon projet a été d'étudier le rôle de Sp1 dans la régulation de l'apoptose et du cycle cellulaire, qui est encore mal défini à l'heure actuelle. Nous avons montré que la surexpression de Sp1 induit un ralentissement du cycle cellulaire en phase G1 et l'apoptose. L'étude du transcriptome a permis d'identifier les mécanismes qui pourraient être à l'origine du ralentissement du cycle cellulaire : la répression de la cycline D2 et l'induction de p18 et cycline G2. Concernant l'induction de l'apoptose, les mécanismes mis en jeu sont spécifiques du type cellulaire et sont différents de ceux décrits jusqu'à ce jour. De façon inattendue, nos résultats montrent que l'ensemble de ces perturbations cellulaires requièrent la liaison de Sp1 à l'ADN mais pourrait être indépendant de son activité transcriptionnelle.

Les productions fermières représentent un enjeu socio-économique important, néanmoins l'hygiène dans les ateliers fermiers est encore peu ou mal maîtrisée, ce qui peut conduire à une perte de produit pouvant atteindre 25% à certaines périodes de l'année.<br /><br />Notre étude réalisée dans le cadre de 2 programmes, régional et européen, avait pour objectif d'étudier l'écosystème microbien d'un atelier fermier de salaison n'utilisant pas de ferment et de proposer des solutions pour améliorer la qualité hygiénique et technologique du saucisson sec, sans affecter sa typicité.<br /><br />La description quantitative et qualitative de l'écosystème microbien de cet atelier fermier a montré une faible maîtrise de l'hygiène, une mise en œuvre de procédures de nettoyage et de désinfection non appropriées, ainsi qu'une faible acidité du produit (pH 6,2 – 6,5). A partir de la souchothèque constituée au cours de cette première étape, nous avons identifié et caractérisé la flore lactique, en vue de développer un ferment lactique et une « flore barrière » à partir de la flore endogène à l'atelier.<br /><br />Les identifications de 88 isolats de la flore lactique par approche phénotypique, génotypique et spectroscopique ont montré qu'Enterococcus faecium (25%) et Vagococcus carniphilus (12,5%) étaient les espèces dominantes au niveau des surfaces et des équipements de l'atelier, alors que Lactococcus garvieae (18,2%) et Lactobacillus sakei (40,9%) étaient, respectivement, les espèces dominantes au niveau de la mêlée et du saucisson.<br /><br />Les 36 souches de Lb. sakei identifiées ont été caractérisées par rapport à leur potentiel d'utilisation comme ferments. Une analyse multivariée des résultats obtenus a permis de sélectionner 2 souches pouvant être utilisées dans le développement d'un ferment spécifique à cet atelier. En outre, 5 Vc. carniphilus, 3 Ec. faecium, 1 Lb. sakei et 1 Enterococcus sp. ont été testées pour leur effet antibactérien à l'encontre de Listeria innocua, Staphylococcus aureus et/ou Hafnia alvei en conditions de biofilms bi-espèces. Deux souches d'Ec. faecium ont été caractérisées comme pouvant jouer le rôle de « flore barrière » au niveau des surfaces et des équipements de l'atelier.<br /><br />Par ailleurs, dans une perspective de mise en place de procédures de décontamination appropriées à cet atelier, différentes solutions de désinfection ont été testées pour leur effet bactéricide sélectif sur des bactéries d'intérêt technologique, d'altération et pathogène, isolées de cet atelier et cultivées en biofilms. Le désinfectant utilisé dans cet atelier s'est avéré non sélectif détruisant la flore d'intérêt technologique. Par contre, la solution d'acide acétique à pH 5,4 contenant 0,075% p/v de monolaurine s'est montrée sélective, inhibant la flore indésirable à des niveaux pouvant atteindre 4 log10 u.f.c/ml alors que la flore d'intérêt technologique n'a été que peu affectée.<br /><br />L'ensemble de ces résultats suggère la possibilité d'améliorer la qualité des saucissons secs fermiers en adoptant une approche de type écologie microbienne dirigée dans les ateliers fermiers.

L'interférence par l'ARN (ARNi) désigne la dégradation spécifique de séquence des ARN induite par des ARN double brin. Dans les cellules de mammifères, l'ARNi peut être induite par des petits ARN interférants (siARN). L'ARNi est effectuée par le complexe RISC (RNA induced silencing complex) contenant, entre autre, la séquence d'ARN guide, qui permet la reconnaissance de la cible et la nucléase Ago2, responsable de son clivage.<br />Ces travaux ont porté sur l'analyse cinétique de la dégradation des ARNm induite par les siARN dans des cellules de mammifères. Nous avons mesuré les vitesses de dégradation des ARNm de β-globine et de lymphotoxine-α sous interférence et montré, d'une part, que les différences d'efficacité des siARN sont liées à des différences de vitesses de dégradation et, d'autre part, que ces vitesses s'accélèrent entre 16h et 24h après la transfection pour deux siARN inhibant 80 à 90% des messagers. Nous avons aussi observé qu'un même siARN induit des inhibitions différentes pour les deux messagers de la lymphotoxine-α, ce qui nous a amené à proposer l'existence d'une interaction entre la traduction et l'interférence par l'ARN. <br />Nous avons analysé l'impact de l'interférence sur le métabolisme nucléaire des ARNm. Nous avons ainsi démontré que les siARN induisent la dégradation des ARN nucléaires avec une efficacité qui dépend d'une compétition cinétique entre l'interférence et les réactions de maturation et d'export qui affectent le transcrit ciblé. De plus, nous avons observé que la dégradation d'un ARN messager pouvait s'accompagner d'une accumulation de ses précurseurs, probablement par une augmentation de synthèse. Ainsi, l'interférence permet-elle de mettre en évidence de nouvelles régulations du métabolisme nucléaire des ARN.

Le myélome multiple (MM) est une néoplasie hématopoïétique chimiosensible. Si une chimiothérapie intensive associée à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques permet de doubler la médiane de survie, la rechute reste cependant inéluctable et ce cancer est incurable à l'heure actuelle.<br />Plusieurs exemples ont montré récemment qu'une connaissance précise de la physiopathologie d'un cancer pouvait conduire à l'élaboration de traitements spécifiques. Ces nouveaux traitements anti-cancéreux ciblant un sous-groupe de tumeurs caractérisées par une altération moléculaire commune sont une voie de développement thérapeutique prometteuse.<br />Mon travail de thèse a consisté à étudier la biologie du MM dans une perspective de ciblage pharmacologique de la cellule plasmocytaire maligne. L'utilisation d'anticorps anti-gp130 agonistes a permis de montrer que l'activation de la signalisation par la chaîne gp130 du récepteur de l'interleukine-6 (IL-6) est indispensable à la survie et la prolifération des cellules de MM. En corollaire, l'interruption de cette voie de signalisation par la tyrphostin AG490, inhibiteur de la kinase JAK2, bloque la croissance et induit une apoptose dans les plasmocytes tumoraux. Des membranes comportant les ADNc de 268 gènes nous ont permis de rechercher l'expression des gènes d'autres cytokines et récepteurs de cytokines pouvant jouer un rôle dans la physiopathologie du MM. Nous avons mis en évidence dans des lignées de MM une boucle autocrine, cruciale pour la survie du plasmocyte tumoral, qui implique la cytokine HB-EGF et son récepteur ErbB1. Le développement d'un modèle de génération in vitro de plasmocytes normaux purifiés a permis ensuite la comparaison du transcriptome de plasmocytes tumoraux avec leur contrepartie normale par des puces à ADN analysant l'expression de 6800 gènes différents. De nombreux gènes sont différentiellement exprimés entre ces deux populations cellulaires et certains gènes surexprimés dans les cellules myélomateuses codent pour des protéines qui sont des cibles thérapeutiques potentielles, telles que ABL, CBS, RAR? ou RhoC.<br />La possibilité de comparer pour chaque malade le transcriptome des cellules tumorales par rapport à leur équivalent normal va permettre de progresser rapidement dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'émergence du clone tumoral et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait aboutir sur la mise en place d'un traitement « à la carte » du MM basé sur l'examen du transcriptome du clone tumoral de chaque patient.

La maturation méiotique des vertébrés diffère de la mitose par plusieurs aspects. J'ai étudié deux de ces particularités. 1) En méiose I, les chromosomes homologues sont ségrégés, en mitose, les chromatides sœurs sont séparées. En mitose, un mécanisme de contrôle bloque la cellule en métaphase en inhibant l'APC/C tant que tous les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur le fuseau. En méiose I, des résultats contradictoires existent selon les espèces quant à l'existence d'un mécanisme de contrôle de ce type. J'ai montré que l'activité séparase (activité indirectement régulée par l'APC/C) est requise pour effectuer la transition métaphase/anaphase en méiose I, suggérant qu'un mécanisme de contrôle de ce type est requis chez la souris, organisme proche de l'homme. 2) A l'issue de la maturation méiotique, l'ovocyte reste bloqué en métaphase de méiose II en attendant la fécondation, alors que la mitose s'achève toujours. Ce blocage est dû à l'activité CSF et requiert la voie Mos/.../MAPK. J'ai montré que DOC1R, un nouveau substrat des MAPK, contrôle l'organisation des microtubules au cours de l'arrêt CSF. Ces résultats font évoluer la vision de l'arrêt CSF qui était considéré comme une voie linéaire aboutissant à la stabilisation du MPF. L'arrêt CSF est une voie non linéaire contrôlant aussi la morphologie de l'ovocyte.

Comme la plupart des Crustacés, Orchestia cavimana possède un exosquelette minéralisé qu'il renouvelle cycliquement. Du fait des mœurs terrestres de cet animal, ces cycles de mue sont associés à des processus de stockage et de résorption de calcium. Le stockage a lieu sous forme de concrétions calcaires au niveau de diverticules de l'intestin moyen appelés cæcums postérieurs. Les concrétions calcaires sont essentiellement constituées de carbonate de calcium amorphe précipité au sein d'une matrice organique comprenant une fraction protéique soluble et une autre insoluble dans un tampon contenant de l'EDTA. Des résultats précédents ont permis de mettre en évidence, parmi les constituants de la fraction soluble, une protéine acide de masse apparente en SDS-PAGE de 23 kDa qui a été appelée Orchestine. Cette protéine, dont le gène a été cloné et séquencé, n'est pas glycosylée et fixe le calcium. Le but de ce travail a été de poursuivre la caractérisation de ce marqueur protéique. Pour ce faire, nous avons montré qu'Orchestine est phosphorylée sur des résidus sérine et tyrosine. Afin d'étudier les relations entre ces phosphorylations et l'aptitude de la protéine à fixer le calcium, nous avons produit une protéine recombinante dépourvue de toute modification post-traductionnelle. La comparaison de l'aptitude à fixer le calcium des protéines native, native déphosphorylée par diverses phosphatases spécifiques, et recombinante nous a permis de conclure à l'importance fondamentale des sérines dans cette aptitude. De plus, Orchestine interfère dans la croissance in vitro de cristaux de carbonate de calcium. D'autre part, la protéine recombinante nous a permis de lever l'ambiguïté de la divergence de masse moléculaire de la protéine observée en SDS-PAGE (de 23 kDa) et de celle déduite de la séquence (de 12,4 kDa) et de conclure à la correspondance gène orchestine-protéine Orchestine. Enfin la protéine recombinante a été utilisée pour la production d'un anticorps polyclonal afin de localiser Orchestine dans les structures biominéralisées élaborées par O. cavimana lors de son cycle de mue. Orchestine semble non seulement localisée dans les couches non minéralisées des concrétions calcaires (structures de réserve du calcium) mais aussi dans celles des sphérules calciques (structures permettant la remobilisation du calcium). Les propriétés ainsi mises en évidence nous conduisent à envisager qu'Orchestine est une molécule-clé dans la formation des structures de stockage et déstockage élaborées de manière cyclique par O. cavimana.

La microsporidie Encephalitozoon cuniculi, parasite intracellulaire obligatoire, pathogène de l'homme, est responsable d'infections opportunistes chez des sujets immunodéprimés. Sa spore est protégée par une épaisse paroi protéo-chitineuse pour laquelle peu de données sur les constituants protéiques sont disponibles. Dans ces travaux, nous avons décrit le protéome exprimé dans les stades tardifs de développement d'E. cuniculi. Grâce à des extractions protéiques séquentielles et une double stratégie d'analyse protéomique, après électrophorèse et "Shotgun", 177 protéines différentes ont pû être identifiées, permettant d'obtenir une vision globale de la physiologie de la spore. L'exploitation de ces données et le développement d'un crible bioinformatique a permis l'identification de 4 protéines de paroi. Le premier modèle dynamique de morphogenèse de la paroi microsporidienne a été proposé grâce au suivi de la localisation de ces protéines durant le cycle de développement

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs accessibles à la lumière. Elle repose sur l'action combinée d'un photosensibilisateur qui, en présence d'oxygène et sous l'effet d'une irradiation lumineuse, induit la synthèse d'espèces réactives de l'oxygène cytotoxiques. L'effet tumoricide de la PDT se traduit par des dommages directs sur les cellules ainsi que des dommages indirects de la néovascularisation tumorale et une activation du système immunitaire. Dans cette étude, nous avons démontré dans une première partie l'intérêt de se baser sur la distribution intratumorale de la mTHPC et non pas sur les études de biodistribution pour l'optimisation des conditions de traitement par PDT et en particulier de l'intervalle drogue-lumière (IDL). Un co-ciblage des vaisseaux et du parenchyme tumoral via un fractionnement de l'administration de la mTHPC a permis d'obtenir un taux de guérisons de 100%. Cette efficacité a été corrélée à la potentialisation de la mort des cellules par apoptose et valorisée par son association à des dommages secondaires cutanés restreints. La stratégie de fractionnement de l'administration s'avère donc être très prometteuse dans un contexte clinique. Dans la seconde partie de cette étude, nous avons établi la redistribution de la mTHPC in vivo dans le modèle de la membrane chorioallantoïdienne de poulet (CAM) à partir de formulations liposomales (Foslip®, Fospeg®) et son impact sur les dommages vasculaires photoinduits par la PDT.