La voie de l’ARN interférence (ARNi), en particulier celle des siRNA, constitue la défense antivirale majeure chez les plantes,les nématodes et les insectes. Le génome de l’organisme modèle Drosophila melanogaster code pour trois protéines, Dcr-­‐2, AGO2 et R2D2, indispensables à cette voie. Les mouches mutantes pour une de ces trois protéines sont plus susceptibles et succombent plus rapidement aux infections virales comparées aux mouches sauvages. Beaucoup d’études biochimiques ont permis d’obtenir une image assez précise de la fonction moléculaire de ces trois protéines in vitro. Cependant, plusieurs études in vivo ont révélé une réalité plus complexe, probablement liée à l’association de ces molécules avec des cofacteurs. Ce manuscrit décrit les approches adoptées afin d’identifier les partenaires protéiques de la voie des siRNA et d’étudier leurs rôles, notamment dans un contexte infectieux. Dcr-­‐2, AGO2 et R2D2 ont été étiquetés par génie génétique avec un tag de 16 acides aminés, reconnu par la biotin-­‐ligase BirA, qui permet leur biotinylation après leurs transfections dans les cellules S2. Les cellules transfectées ont été ensuite soumises à différentes infections virales,notamment avec le virus C de la Drosophile (DCV) (Dicistroviridae), le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) (Rhabdoviridae) ou le Flock House virus (FHV) (Nodaviridae). Les cellules ont été ensuite lysées au pic de l’infection et les complexes protéiques purifiés et analysés par spectrométrie de masse.[...] / Fighting viral infections is hampered by the scarcity of viral targets and their variability resulting in development of resistance. Viruses depend on cellular molecules for their life cycle, which are attractive alternative targets, provided that they are dispensable for normal cell fonctions. Using the mode! organism Drosophila melanogaster, we identify the ribosomal protein RACK1 as a cellular factor required for infection by the internai ribosome entry site (IRES) containing virus Drosophila C virus (DCV). We further demonstrate that inhibition of RACK1 in human liver cells impairs hepatitis C virus (HCV) IRES-mediated translation and infection. Inhibition of RACK1 in Drosophila and hurnan cells does not affect cell viability and proliferation, and RACK1-silenced adult flies are viable, indicating that this protein is not essential for general translation. Our findings demonstrate a specific function for ribosomal protein RACK 1 in selective mRNA translation and uncover a promising targe! for the development of broad antiviral intervention.

En nanomédecine, une nouvelle approche consiste à développer des vecteurs synthétiques pour co-délivrer au sein d’une cellule tumorale, un anticancéreux ainsi qu’un siARN, capable de supprimer l’expression d’une protéine impliquée dans les mécanismes de résistance. Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été consacrés à la synthèse de nano-vecteurs micellaires pour la délivrance simultanée de ces deux agents thérapeutiques. Une première partie décrit la synthèse et la formulation de micelles nanométriques diacétyléniques photopolymérisables conçues pour délivrer efficacement un siARN. Les propriétés d’encapsulation et de délivrance de ces micelles ont ensuite été étudiées in vitro et in vivo pour une application en thérapie combinatoire. Enfin, une dernière partie présente la fonctionnalisation par interaction électrostatique de ces vecteurs cationiques avec des anticorps préalablement modifiés par des oligonucléotides anioniques pour réaliser un ciblage actif des cellules tumorales. / In the nanomedecine field, a new approach consists in developing synthetic vectors able to co-deliver into a cancer cell, an antitumoral drug and siRNAs that target protein(s) involved in MDR. The work described in this manuscript was dedicated to the development of micellar nanovectors for the intracellular co-delivery of these two therapeutic agents. The first part details the synthesis and the formulation of nanometric photopolymerized diacetylenic micelles adapted for the delivery and intracellular release of the siRNA. Then, the encapsulation and delivery properties of these micelles, bearing histidine polar heads have been investigated in vitro and in vivo for the application of combination therapy. Finally, the last part presents the functionalization by electrostatic interaction of these cationic vectors with antibodies, priorly modified by anionic oligonucleotides. This original and versatile system allowed achieving an active targeting of tumoral cells.

Les ARN interférents sont de puissants outils thérapeutiques et biologiques pour la mise en silence de l'expression des gènes. Afin d'améliorer leur stabilité enzymatique, leur biodistribution et leur pénétration cellulaire, nous proposons de développer une approche prodrogue d'ARN interférent. Ce manuscrit rapporte la synthèse et l'évaluation de pro-ARN masqués temporairement par des groupements biolabiles susceptibles d'être hydrolysés dans les cellules afin de libérer l'ARN naturel actif. Deux types de modifications sont présentés : des groupes acétalesters enlevés par des carboxyestérases et des groupes alkyldithiométhyles sensibles à un environnement réducteur. Dans une première partie, une nouvelle méthode de synthèse de pro-ARN partiellement modifiés en position 2' par des groupements acétalesters est décrite. Plusieurs groupements variant par leur caractère lipophile ou cationique sont évalués. Des résultats prometteurs d'études physico-chimiques, de stabilité enzymatique, de pénétration cellulaire et d'inhibition de gènes mettent en valeur l'intérêt d'utiliser certains pro-ARN modifiés en tant qu'outils thérapeutiques. Une deuxième partie présente une voie de synthèse originale de pro-ARN modifiés en position 2' par des groupements alkyldithiométyles. Les propriétés physico-chimiques, la stabilité enzymatique et le démasquage de ces pro-ARN sont décrits. Parallèlement, l'étude d'une réaction d'échange thiol-disulfure permettant l'incorporation de liens disulfures intrabrin au sein de duplex d'ARN et de constructions tige-boucles est détaillée dans ce manuscrit. / SiRNA are powerful therapeutic and biological tools for gene silencing. In the aim of improving their stability, their biodistribution and their cellular delivery, we propose to develop a siRNA prodrug-like approach.This manuscript reports the synthesis and the study of pro-RNA temporarily masked by biolabile groups which could be hydrolyzed inside cells in order to release the active unmodified RNA. Two types of modifications are presented: acetalester groups removed by carboxyesterases and alkyldithiomethyl groups cleaved in a reducing environment within cells.In a first part, a new synthesis strategy of partially modified 2'-O-acetalester pro-RNA is described. Several acetalester groups varying in their lipophilicity and their charge are evaluated. Promising results obtained in physical-chemical studies, enzymatic stability and gene inhibition highlight the use of these modified pro-RNA as therapeutic drugs. A second part introduces an original approach for the synthesis of 2'-O-alkyldithiomethyl pro-RNA. The physical-chemical properties, the enzymatic stability and the unmasking of this pro-RNA are described.Moreover, the study of a thiol-disulfide exchange reaction allowing the incorporation of intrastrand disulfide bond into secondary structure duplex and hairpin is reported in this manuscript.

Caenorhabditis elegans fait partie des modèles animaux les plus étudiés en laboratoire. La découverte des premiers virus infectant naturellement des Caenorhabditis apporte de nouveaux modèles animal-virus très prometteurs.Le virus d'Orsay, infectant spécifiquement C. elegans, et le virus de Santeuil, infectant spécifiquement C. briggsae, sont des virus à ARN positif simple brins (Hépatites A, C et E, Chikungunya, Coronavirus etc¿) qui provoquent une désorganisation de la structure des cellules intestinales de leur hôte. Par ailleurs, une variation dans la sensibilité à ce virus au sein des espèces est observée. Grâce à une étude statistique d'association pangénomique portant sur la sensibilité au virus d'Orsay de 97 isolats naturels de C. elegans, nous avons pu mettre en évidence une région chromosomique qui contient un polymorphisme responsable de cette sensibilité. Il s'agit une délétion dans le gène drh-1 qui code une protéine similaire à la protéine RIG-I, connue pour initier une réponse antivirale chez les vertébrés. Cependant, C. elegans est incapable de produire la même réponse antivirale que ces derniers. Ainsi, DRH-1 est impliquée dans la reconnaissance des ARN viraux et dans la production d'une réponse spécifique à l'infection virale par les petits ARN. Les gènes impliqués dans l'immunité sont soumis à une forte pression de sélection. Pourtant, de manière surprenante, la délétion du gène drh-1 est présente dans 23% des isolats étudiés. Cette délétion est génétiquement liée à une région plus large de 3 Mb. Cependant, au laboratoire, cette région n’apporte pas d’avantage sélectif qui expliquerait comment cette délétion peut se propager dans les populations. / Caenorhabditis elegans is a commonly studied animal model in laboratories. The discovery ofthe first natural viral infections of Caenorhabditis brings new models to study animal-virusinteractions.The Orsay virus, specifically infecting C. elegans, and the Santeuil virus, specificallyinfecting C. briggsae, are positive single strand RNA viruses (Hepatites, Chikungunya,Coronavirus etc…) disrupting the structure of intestinal cells of their host. However, weobserved a strong variability in the sensitivity to those viruses at the intraspecific level.To identify the genetic basis of the sensitivity, we performed a genome wide association studyon 97 wild isolates of C. elegans. We were able to identify the center of chromosome IV as aregion containing the locus responsible for this sensitivity. A deletion in the drh-1 gene,coding for a RIG-I-Like protein, confers sensitivity to their carrier. RIG-I is known torecognize viral RNA and to trigger an antiviral response through the production of interferonsin vertebrates. However, C. elegans is not able to produce interferons but it appears thatDRH-1 initiates a viral specific siRNA pathway.Immunity genes are under strong selective pressure. Thus, it is surprising that such animportant protein for the antiviral pathway appears to be disrupted in 23% of the wild isolates.This deletion shows high linkage disequilibrium with a broader region of 3Mb, suggestingthat the deletion propagates with this region. However, this region does not seem to provideany advantage to their owner under laboratory conditions.

De nombreux mécanismes contrôlent et limitent la prolifération des éléments transposables (ET) dans les génomes dont ils menacent l'intégrité structurale et fonctionnelle. Chez les plantes l'interférence ARN (ARNi) joue un rôle important dans ces contrôles via des petits ARN d'environ 20nt qui guident la régulation de l'expression de séquences endogènes ou exogènes par deux types de mécanismes. Un premier mécanisme, partagé par de nombreux organismes eucaryotes, inhibe l'activité d'ARNm par un contrôle post-transcriptionnel. Un deuxième type de régulation, permet un contrôle transcriptionnel de l'activité des ET via un mécanisme appelé RNA directed DNA Methylation (RdDM) qui implique des siARN («  short-interfering RNA ») de 24nt qui guident la méthylation de l'ADN spécifiquement au niveau des séquences d'ET. Les siARN sont impliqués également dans la restauration progressive de la méthylation de l'ADN après une perte induite par la mutation du gène DDM1 (Decrease in DNA Methylation 1). L'objectif de cette thèse est de tirer avantage des technologies de séquençage à haut débit pour caractériser le contrôle des ET par les siARN chez la plante modèle Arabidopsis thaliana.Dans un premier temps, j'ai développé des méthodes et outils bioinformatiques afin de gérer efficacement les données de séquençage à haut débit de banques de petit ARN. Ces outils, regroupés en pipeline, visent à permettre l'étude de l'accumulation des siARN correspondant aux séquences d'ET ou de familles d'ET ainsi que leur visualisation de manière globale ou détaillée.Ces outils ont ensuite été appliqués pour caractériser, dans un contexte sauvage, l'association entre les siARN et les ET afin de déterminer des facteurs pouvant expliquer les différences d'abondance en siARN observées. Ces analyses, réalisées en tenant compte de l'état de méthylation de l'ADN et du contexte génomique des ET apportent une vue statique du contrôle des ET par les siARN et de leur impact sur les gènes situés à proximité.L'analyse de banques de petits ARN de mutants de la voie de l'ARNi a ensuite été réalisée afin mieux caractériser l'impact de la perte de méthylation de l'ADN sur les populations de siARN et notamment définir les mécanismes impliqués dans la production des siARN de 21nt induite dans le mutant ddm1. Ces analyses comparatives du contrôle des ET lors d'une perte de la méthylation de l'ADN ont permis de mettre en évidence une production de siARN de 24nt indépendante de la voie classique du RdDM et de proposer un modèle permettant d'expliquer la production de siARN de 21nt dans le mutant ddm1.Dans un dernier temps, j'ai cherché à mieux définir l'implication des siARN dans la restauration des états de méthylation de l'ADN. Les variations de méthylation de l'ADN induites par la mutation ddm1 ont été caractérisées ainsi que leur stabilité transgénérationnelle au sein d'une population d'epiRIL. La stabilité de l'hypométhylation de l'ADN a été étudiée, au regard de données de séquençage à haut débit de banques de petits ARN de lignées WT, ddm1 ainsi que pour 4 lignées epiRIL, afin d'apporter une notion temporelle à l'étude du contrôle des ET par les siARN.Les résultats soulignent le rôle majeur des petits ARN pour le contrôle des éléments transposables afin de préserver l'intégrité structurale et fonctionnelle du génome et ce, via des mécanismes variés en fonction des ET. Ce travail ouvre la voie vers une analyse du contrôle des ET par les siARN basée sur une approche regroupant les ET en réseaux en fonction des séquences de siARN qu'ils partagent. Cela permettrait d'étudier les « connections-siARN » entre ET afin de, par exemple, explorer l'action en trans des siARN pour la restauration de la méthylation de l'ADN. / Many mechanisms control and limit the proliferation of transposable elements (TEs) which could otherwise threaten the structural and functional integrity of the genome. In plants RNA interference (RNAi) plays an important role in this control through small RNAs that guide the expression regulation of endogenous or exogenous sequences by two types of mechanisms. The first such mechanism, shared by many eukaryotic organisms, acts at the post-transcriptionnal level to inhibit the activity of mRNA. A second type of regulation allows the transcriptional control of TEs activity through a mechanism called RNA directed DNA methylation (RdDM) which involves 24nt long siRNA ("short-interfering RNA") that guide DNA methylation specifically on TEs sequences. Furthermore, siRNAs are also involved in the progressive restoration of DNA methylation after a loss induced by mutation of the DDM1 gene (Decrease in DNA Methylation 1). The aim of this thesis is to take advantage of high-throughput sequencing technologies to characterize these TEs controls mechanisms by siRNA in the model plant Arabidopsis thaliana .At first, I developed methods and bioinformatics tools to effectively manage data produced by high-throughput sequencing of small RNA libraries. These tools, combined in a pipeline, are designed to allow the study the accumulation of siRNA corresponding to TE sequences or TE families as well as their global or detailed visualization.These tools were applied to characterize, in a wild type background, the association between siRNA and TEs in order to define factors that may explain the observed differences in siRNA abundance . These analyses were performed by taking into account both DNA methylation states and genomic context. It provides a static view of siRNA control of TEs and their impact on nearby genes. Then, analysis of small RNA libraries from mutants of the RNAi pathway was performed to better characterize the impact of DNA methylation loss on siRNA populations and to define the mechanisms involved in the production of 21nt siRNA induced in the ddm1 mutant. These comparative analyses of the TE control after loss of DNA methylation allow us to highlight the production of 24nt siRNA independently of the classical RdDM pathway and to propose a model explaining the production of 21nt siRNA in the ddm1 mutant. At last, I tried to clarify the involvement of siRNA in the restoration of DNA methylation. Changes in DNA methylation induced by ddm1 mutation were characterized as well as their transgenerational stability in an epiRIL population. The stability of DNA hypomethylation has been studied in relation to high-throughput sequencing of small RNAs data from WT, ddm1 and 4 epiRIL lines. It provides a temporal view of the TE control by siRNA. The results highlight the important role of small RNAs in the control of transposable elements in order to preserve structural and functional integrity of the genome through a variety of mechanisms depending on TE sequences. This work opens the way to the analysis of the siRNA control on TEs based on approaches that combine TEs in networks based on their shared siRNA sequences. It would allow to study "siRNA-connections" between TEs in order to explore, for example, the action in trans of siRNA in the restoration of DNA methylation defect.

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d’ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l’expression de gènes sur la base d’une complémentarité de séquence. L’exemple le mieux connu est le cas de l’interférence par l’ARN telle qu’elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l’existence de mécanismes apparentés à l’interférence par l’ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n’existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d’un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n’a été observée jusqu’à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l’étude de l’induction de l’expression par des petits ARN. Ils reposent tout d’abord sur le développement d’une approche expérimentale qui permet de suivre l’activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j’ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d’un promoteur bidirectionnel qui contrôle l’expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l’on cible le messager de l’une de ces protéines, l’expression de l’autre est augmentée et j’ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d’ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l’utilisation d’un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l’expression détectée de manière « controlatérale » n’est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l’un des transcrits de la construction indicatrice. L’induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s’ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j’ai développées sont donc biaisées en faveur d’une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L’utilisation d’un promoteur bidirectionnel est probablement à l’origine de ce biais à travers la possibilité d’induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu’ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l’induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l’induction, j’ai pu montrer que dans le deuxième cas c’était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l’induction sans toucher au silencing s’il procède en mode siRNA. De plus l’ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d’ancrage m’a permis d’identifier les domaines nécessaires au silencing et à l’induction et de montrer qu’ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l’induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu’elle relève d’une activité spécifique du complexe RISC. / In the majority of the eucaryote, the presence of double-strands RNA induce the inhibition of gene expression base on the complementary of sequence. The best known example is the case of RNA interference in C. elegans which is the first model described, in which the double-strands RNA generate an specific endonuclease who degrade all RNA complementary perfectly to the small RNA guide included in the complex RISC. In addition to this post-transcriptional activity, it has been observed in many eukaryotes the existence of mechanisms related to RNA interference and it inhibit transcription by acting at the chromatin. If these mechanisms have been clearly demonstrated in plants, fungi, there are only several examples of this type of regulation in mammals. Unexpectedly, the targeting the promoter of a gene with small double-stranded RNA can lead to increased expression. This paradoxical response has not been observed so far in mammalian cells, but it raises interest particularly to stimulate the expression of tumor suppressor genes, unfortunely the mechanism is still unknown.My work has focused on studying the induction of expression by small RNAs. They are based first on the development of an experimental approach that allows to monitor the promoter activity of the targeted gene. To do this I used indicator constructions organized around a bidirectional promoter that controls the expression of two fluorescent proteins. When targeting the messenger of one of these proteins, the expression of the other is increased and I was able to show that thisincrease correlates with the amount of RNA messenger polymerase II presented on the bidirectional promoter. Thus, the use of a bidirectional promoter can effectively monitor the level of transcription of the gene targeted by the small RNA. This induction of expression detected in a "contralateral" is not due to an off-target effect of siRNA because it requires the presence of the target sequence on one of the transcripts of the construction indicator. The induction can be observed with many different small RNAs, including the interact as micro RNA. Thus the construction indicator that I developed are biased in an induction response transcriptionally in response to a silencing. The use of a bidirectional promoter is probably the origin of this bias through the possibility of inducing a convergent transcription when the plasmids are circular. In fact, the linearization of the construction indicator removes the induction, at least for the simplest constructions. If the heart of the complex RISC is the protein Ago2, is necessary for the silencing and the induction, I was able to show that in the second case Ago2 was in fact to guide the RISC complex on the transcripts but not to cut it. Indeed, the silencing of proteins TNRC6A and B reduces induction significantly without affecting the silencing if it processe in the siRNA model. Also anchoring the transcript EGFP induces a response similar to the small RNA (silencing and induction). This anchor approach allowed me to identify domaines necessary for silencing and induction and show that they are distinct. This work makes it possible to demonstrate that the transcriptional induction observed in our constructions indicator is due to a activity partner ofArgonaute proteins, the GW182/TNRC6 family. This observation open the way for characterization of the mechanism of this induction by showing that it belongs to a specific activity of the RISC complex.

Les éléments transposables (ET) sont des parasites génomiques présents dans tous les génomes, dont une partie présente une structure similaire à celle de certains virus. Dans les cellules ovariennes d'insecte, l'abondance des transcrits d’ET est contrôlée par ARN interférence (ARNi), et plus particulièrement par la voie piARN (Piwi-interacting RNA). Une autre voie d'ARNi, la voie siARN (Small interfering RNA), constitue l'une des principales réponses immunitaires des insectes contre les infections virales, et est aussi dédiée au contrôle somatique des ET. Ces deux voies d'ARNi sont dirigées par des effecteurs moléculaires distincts et décrites comme indépendantes. Cependant, des similitudes structurales et de mécanisme de contrôle entre les ET et les virus suggèrent la possibilité d’une interaction. Nous avons utilisé la drosophile comme modèle et infecté l'organisme avec le virus Sindbis (SINV), un arbovirus (Arthropod-Borne virus), ou le virus Sigma (SV), un virus spécifique de drosophile. À l'aide d'un séquençage à haut débit, nous avons caractérisé les répertoires d'ARN et de petits ARN interférents produits par les drosophiles infectées, à partir des tissus de carcasses ou d'ovaires. Globalement, nos résultats démontrent un impact de l'infection virale sur les quantités de transcrits d’ET via la modulation des répertoires piARN et siARN, et représentent la première démonstration des effets d’infections virales sur l’activité des ET. Plus précisément, l’infection par SINV favorise une diminution globale des quantités de transcrits d’ET alors que l’infection par SV réactive de nombreux ET. Nos données suggèrent que la modulation résulte de substrats d'ARN partagés et de trans-régulateurs communs des voies de l'ARNi. Ces résultats ouvrent un nouvel axe de recherche en génomique, suggérant que les épidémies virales ou les infections chroniques peuvent avoir un impact sur l'activité des ET, et donc sur le taux de diversification génétique ultérieure / Transposable elements (TEs) are genomic parasites that are found in all genomes, a part of which display structure similarity to some viruses. In insect ovarian cells, TE transcript abundance is controlled by RNA interference (RNAi) machinery and more particularly by the piRNA pathway (Piwi-interacting RNA). Another RNAi pathway, named siRNA pathway (Small interfering RNA), is one of the key insect immune responses against viral infections and is also dedicated to TE somatic control. These two interfering RNA pathways are led by distinct molecular effectors and described as independent. However, similarities in structure and control mechanisms across TEs and viruses suggest that an interplay may exist. We used Drosophila as a model, and infected the organism with Sindbis virus (SINV), an arbovirus (Arthropod-Borne virus), or Sigma virus (SV), a Drosophila-specific virus. Using high-throughput sequencing, we characterized the RNA and small-RNA repertoires produced by Drosophila flies from carcass or ovary tissues. Overall, our results demonstrate an impact of viral infection on TE transcript amounts via modulation of the piRNA and siRNA repertoires and represent the first demonstration of the effects of viral infection on TE activity. More precisely, SINV infection promotes a global decrease of TE transcript levels while SV infection reactivates many TEs. Our data suggest that the modulation results from shared RNA substrates and common trans-regulators of the small RNA pathways. These results open new avenue of research in genomics, suggesting that viral epidemics or chronic infections can impact TE activity and thus the rate of subsequent genetic diversification

Les ARNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques et peuvent adopter des structures secondaires différentes. Par leurs propriétés, ils constituent des outils biologiques puissants pour des applications diverses, tels les ARNs interférents (siARN) qui permettent l’extinction de l’expression des gènes par exemple. L’introduction de modifications sur des ARNs s’est avérée essentielle pour améliorer leurs propriétés et faciliter l’étude de leurs rôles biologiques et leurs applications thérapeutiques.Ce manuscrit rapporte la synthèse et les propriétés d’ARNs modifiés en position 2’ du ribose par des groupements contenant des ponts disulfures, sensibles à un environnement réducteur.Dans la première partie, la synthèse de prodrogues de siARNs partiellement modifiés par des groupements benzyldithiométhyles est décrite. Leurs stabilités thermiques et enzymatiques, ainsi que leur démasquage en milieu réducteur, sont montrés. Les résultats prometteurs d’activité inhibitrice et de pénétration cellulaire, sur une lignée cellulaire du sarcome d’Ewing, permettent d'envisager une application potentielle de ces siARNs modifiés comme outils thérapeutiques.La deuxième partie décrit une approche de co-délivrance par des siARNs couplés avec une drogue anticancéreuse, la doxorubicine, via un lien auto-immolable contenant des ponts disulfures. Les propriétés physico-chimiques des conjugués sont déterminées, et la libération du siARN et de la drogue en milieu réducteur est mise en évidence.La troisième partie présente une autre méthode de conjugaison en solution entre la position 2’ d’un ARN et des petites molécules (sucres, coumarine, biotine, acide désoxycholique, glutathion) via un pont disulfure. La synthèse des ARNs conjugués et leur devenir en milieu réducteur sont décrits.Dans la dernière partie, l’impact d’un lien avec un pont disulfure intrabrin entre les positions 2’ de deux nucléotides adjacents est étudié dans un duplex ou la partie boucle d’hairpins. L’influence du pont disulfure sur l’équilibre des conformations duplex et hairpin d’un ARN d’intérêt biologique est évaluée, en absence et en présence d’agents réducteurs. Une application en fluorescence d’une hairpin contrainte en tant que « molecular beacon » montre des utilisations potentielles de ce lien dans des outils pour étudier la conformation de structures secondaires d’ARNs ou dans des sondes pour détecter les agents réducteurs. / RNAs are involved in numerous biological processes and can adopt different secondary structures. Thanks to their properties, they are powerful biological tools for diverse applications, such as small interfering RNA (siRNA) for gene silencing. Modified RNAs have proven to be essential to improve their properties, and to facilitate the study of their biological and therapeutic functions.This manuscript reports the synthesis and properties of 2’-O-modified RNAs bearing disulfide-containing groups, sensitive to reductive environment.The first part describes the synthesis of siRNAs prodrugs bearing lipophilic benzyldithiomethyl groups. The thermal stability, the serum stability and the response to glutathione treatment of modified siRNAs are thoroughly investigated. The gene silencing and the gymnotic delivery of several siRNAs are assessed, and demonstrates promising results on Ewing’s sarcoma cell line.A second part concerns the co-delivery of siRNAs and a hydrophobic anti-cancer drug (doxorubicin) using a self-immolative spacer bearing disulfide bonds. The chemico-physical properties of these conjugates are determined and the recovery of native siRNA and doxorubicin in response to reductive treatment is highlighted.A third part presents the conjugation of RNAs to small molecules (sugars, coumarin, biotin, deoxycholic acid, glutathione) using disulfide linkages. The synthesis of the RNA conjugates and their release in reducing conditions are also demonstrated.The last part reports the synthesis and the impact of an intrastrand dimethylene disulfide bridge between 2’-O-positions of two adjacent nucleotides in an RNA duplex and in the loop of RNA hairpins. Then, the influence of this linkage on the folding of a biologically relevant RNA structure is reported. Finally, an application of a constrained hairpin as a fluorescent molecular beacon highlights its potential use in tools for understanding RNA folding and in probes for the detection of reducing reagents

L'interférence par l'ARN (ARNi) désigne la dégradation spécifique de séquence des ARN induite par des ARN double brin. Dans les cellules de mammifères, l'ARNi peut être induite par des petits ARN interférants (siARN). L'ARNi est effectuée par le complexe RISC (RNA induced silencing complex) contenant, entre autre, la séquence d'ARN guide, qui permet la reconnaissance de la cible et la nucléase Ago2, responsable de son clivage.<br />Ces travaux ont porté sur l'analyse cinétique de la dégradation des ARNm induite par les siARN dans des cellules de mammifères. Nous avons mesuré les vitesses de dégradation des ARNm de β-globine et de lymphotoxine-α sous interférence et montré, d'une part, que les différences d'efficacité des siARN sont liées à des différences de vitesses de dégradation et, d'autre part, que ces vitesses s'accélèrent entre 16h et 24h après la transfection pour deux siARN inhibant 80 à 90% des messagers. Nous avons aussi observé qu'un même siARN induit des inhibitions différentes pour les deux messagers de la lymphotoxine-α, ce qui nous a amené à proposer l'existence d'une interaction entre la traduction et l'interférence par l'ARN. <br />Nous avons analysé l'impact de l'interférence sur le métabolisme nucléaire des ARNm. Nous avons ainsi démontré que les siARN induisent la dégradation des ARN nucléaires avec une efficacité qui dépend d'une compétition cinétique entre l'interférence et les réactions de maturation et d'export qui affectent le transcrit ciblé. De plus, nous avons observé que la dégradation d'un ARN messager pouvait s'accompagner d'une accumulation de ses précurseurs, probablement par une augmentation de synthèse. Ainsi, l'interférence permet-elle de mettre en évidence de nouvelles régulations du métabolisme nucléaire des ARN.

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d'ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l'expression de gènes sur la base d'une complémentarité de séquence. L'exemple le mieux connu est le cas de l'interférence par l'ARN telle qu'elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l'existence de mécanismes apparentés à l'interférence par l'ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n'existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d'un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n'a été observée jusqu'à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l'expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l'étude de l'induction de l'expression par des petits ARN. Ils reposent tout d'abord sur le développement d'une approche expérimentale qui permet de suivre l'activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j'ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d'un promoteur bidirectionnel qui contrôle l'expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l'on cible le messager de l'une de ces protéines, l'expression de l'autre est augmentée et j'ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d'ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l'utilisation d'un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l'expression détectée de manière " controlatérale " n'est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l'un des transcrits de la construction indicatrice. L'induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s'ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j'ai développées sont donc biaisées en faveur d'une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L'utilisation d'un promoteur bidirectionnel est probablement à l'origine de ce biais à travers la possibilité d'induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu'ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l'induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l'induction, j'ai pu montrer que dans le deuxième cas c'était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l'induction sans toucher au silencing s'il procède en mode siRNA. De plus l'ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d'ancrage m'a permis d'identifier les domaines nécessaires au silencing et à l'induction et de montrer qu'ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l'induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu'elle relève d'une activité spécifique du complexe RISC.