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Chez la plupart des eucaryotes, la présence d’ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l’expression de gènes sur la base d’une complémentarité de séquence. L’exemple le mieux connu est le cas de l’interférence par l’ARN telle qu’elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l’existence de mécanismes apparentés à l’interférence par l’ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n’existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d’un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n’a été observée jusqu’à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l’étude de l’induction de l’expression par des petits ARN. Ils reposent tout d’abord sur le développement d’une approche expérimentale qui permet de suivre l’activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j’ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d’un promoteur bidirectionnel qui contrôle l’expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l’on cible le messager de l’une de ces protéines, l’expression de l’autre est augmentée et j’ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d’ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l’utilisation d’un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l’expression détectée de manière « controlatérale » n’est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l’un des transcrits de la construction indicatrice. L’induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s’ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j’ai développées sont donc biaisées en faveur d’une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L’utilisation d’un promoteur bidirectionnel est probablement à l’origine de ce biais à travers la possibilité d’induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu’ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l’induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l’induction, j’ai pu montrer que dans le deuxième cas c’était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l’induction sans toucher au silencing s’il procède en mode siRNA. De plus l’ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d’ancrage m’a permis d’identifier les domaines nécessaires au silencing et à l’induction et de montrer qu’ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l’induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu’elle relève d’une activité spécifique du complexe RISC. / In the majority of the eucaryote, the presence of double-strands RNA induce the inhibition of gene expression base on the complementary of sequence. The best known example is the case of RNA interference in C. elegans which is the first model described, in which the double-strands RNA generate an specific endonuclease who degrade all RNA complementary perfectly to the small RNA guide included in the complex RISC. In addition to this post-transcriptional activity, it has been observed in many eukaryotes the existence of mechanisms related to RNA interference and it inhibit transcription by acting at the chromatin. If these mechanisms have been clearly demonstrated in plants, fungi, there are only several examples of this type of regulation in mammals. Unexpectedly, the targeting the promoter of a gene with small double-stranded RNA can lead to increased expression. This paradoxical response has not been observed so far in mammalian cells, but it raises interest particularly to stimulate the expression of tumor suppressor genes, unfortunely the mechanism is still unknown.My work has focused on studying the induction of expression by small RNAs. They are based first on the development of an experimental approach that allows to monitor the promoter activity of the targeted gene. To do this I used indicator constructions organized around a bidirectional promoter that controls the expression of two fluorescent proteins. When targeting the messenger of one of these proteins, the expression of the other is increased and I was able to show that thisincrease correlates with the amount of RNA messenger polymerase II presented on the bidirectional promoter. Thus, the use of a bidirectional promoter can effectively monitor the level of transcription of the gene targeted by the small RNA. This induction of expression detected in a "contralateral" is not due to an off-target effect of siRNA because it requires the presence of the target sequence on one of the transcripts of the construction indicator. The induction can be observed with many different small RNAs, including the interact as micro RNA. Thus the construction indicator that I developed are biased in an induction response transcriptionally in response to a silencing. The use of a bidirectional promoter is probably the origin of this bias through the possibility of inducing a convergent transcription when the plasmids are circular. In fact, the linearization of the construction indicator removes the induction, at least for the simplest constructions. If the heart of the complex RISC is the protein Ago2, is necessary for the silencing and the induction, I was able to show that in the second case Ago2 was in fact to guide the RISC complex on the transcripts but not to cut it. Indeed, the silencing of proteins TNRC6A and B reduces induction significantly without affecting the silencing if it processe in the siRNA model. Also anchoring the transcript EGFP induces a response similar to the small RNA (silencing and induction). This anchor approach allowed me to identify domaines necessary for silencing and induction and show that they are distinct. This work makes it possible to demonstrate that the transcriptional induction observed in our constructions indicator is due to a activity partner ofArgonaute proteins, the GW182/TNRC6 family. This observation open the way for characterization of the mechanism of this induction by showing that it belongs to a specific activity of the RISC complex.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die auf posttranskriptionaler Ebene die Genexpression hemmen. Dafür bilden miRNAs Ribonukleoprotein-Komplexe, deren Kernbestandteile aller Bilateria Argonaute (AGO) und GW182 /TNRC6 Proteine sind. GW182 / TNRC6-Proteine rekrutieren CCR4-NOT-Deadenylasen über kurze Tryptophan-reiche Motive (W-Motive), welche additiv wirken und fördern so die translationale Repression und den Abbau von Ziel-mRNAs. Um mehr über die Mechanismen der miRNA-abhängigen Genrepression zu erfahren, habe ich W-Motiv-abhängige Interaktionspartner humaner TNRC6C Proteine bestimmt. Hierzu habe ich, mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie, das Interaktom von wildtyp TNRC6C Proteinen mit dem von TNRC6C Proteinen, deren W-Motive mutiert wurden, verglichen. Neben bekannten Interaktionspartnern, wie Untereinheiten des CCR4-NOT Komplexes, habe ich Komponenten von Clathrin-Vesikeln (CCVs), Stoffwechsel assoziierte Enzyme, mitochondriale Proteine, RNA Helikasen, Kinasen und Phosphatasen mit potentiellen Funktionen in der miRNA-assoziierten Repression identifiziert. Die im ersten Teil dieser Studie vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass CCVs die Speicherung oder das Recycling von TNRC6 und AGO Proteinen vermitteln können und somit das miRNA-Silencing modulieren. Der zweite Teil dieser Studie befasst sich mit der Konservierung von miRNA vermitteltem Gen-Silencing in Cnidaria (Nematostella vectensis), welche sich vor 600 Millionen Jahren von der Ahnenreihe der Metazoa abspalteten. Hier zeige ich anhand humaner Zellen, dass Nematostella GW182, ähnlich wie in Bilateria, von AGO rekrutiert wird und nachfolgend in der Repression der mRNA fungiert, was darauf hinweist, dass dieser Mechanismus der miRNA-vermittelten Geninhibition bereits in den letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria aktiv war. / MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that act as post-transcriptional repressors of gene expression. To function miRNAs are assembled in ribonucleoprotein complexes, whose core components in bilaterian animals are Argonaute (AGO) and GW182/TNRC6 proteins. GW182/TNRC6 proteins additively recruit CCR4-NOT deadenylases via short tryptophan-containing motifs (W-motifs), thereby promoting translational repression and the decay of target mRNAs. To gain deeper insights into the mechanisms of miRNA silencing I determined the W-motif-specific interactome of human TNRC6C proteins. Using Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell Culture (SILAC) coupled to affinity purification and Mass Spectrometry (MS) I identified proteins enriched with wild type TNRC6C as compared to two mutants with disrupted W-motifs. Besides known functional interactors, such as subunits of the CCR4-NOT complex, I identified several components of clathrin-coated vesicles (CCVs), metabolic enzymes, mitochondrial proteins, RNA helicases, kinases, and phosphatases with potential functional roles in miRNA-mediated repression. The results presented in the first part of this thesis indicate that CCVs may mediate the storage or recycling of TNRC6 and AGO proteins, thus modulating miRNA silencing. The second part of the thesis addressed the conservation of the mechanisms of miRNA silencing via W-motifs in the cnidarian Nematostella vectensis, separated by 600 million years from other Metazoa. Using cultured human cells, I showed that similarly to bilaterians, GW182 in Nematostella is recruited to the miRNA repression complex via interaction with AGO proteins, and functions downstream to repress mRNA, indicating that this mechanism of miRNA-mediated silencing was already active in the last common ancestor of Cnidaria and Bilateria.

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d'ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l'expression de gènes sur la base d'une complémentarité de séquence. L'exemple le mieux connu est le cas de l'interférence par l'ARN telle qu'elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l'existence de mécanismes apparentés à l'interférence par l'ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n'existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d'un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n'a été observée jusqu'à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l'expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l'étude de l'induction de l'expression par des petits ARN. Ils reposent tout d'abord sur le développement d'une approche expérimentale qui permet de suivre l'activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j'ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d'un promoteur bidirectionnel qui contrôle l'expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l'on cible le messager de l'une de ces protéines, l'expression de l'autre est augmentée et j'ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d'ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l'utilisation d'un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l'expression détectée de manière " controlatérale " n'est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l'un des transcrits de la construction indicatrice. L'induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s'ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j'ai développées sont donc biaisées en faveur d'une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L'utilisation d'un promoteur bidirectionnel est probablement à l'origine de ce biais à travers la possibilité d'induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu'ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l'induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l'induction, j'ai pu montrer que dans le deuxième cas c'était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l'induction sans toucher au silencing s'il procède en mode siRNA. De plus l'ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d'ancrage m'a permis d'identifier les domaines nécessaires au silencing et à l'induction et de montrer qu'ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l'induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu'elle relève d'une activité spécifique du complexe RISC.