Der Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer-Binding Protein alpha (C/EBPa) koordiniert Proliferationshemmung und Differenzierung von myeloiden VorlŠuferzellen und Adipozyten. C/EBPa ist ein transkriptioneller Aktivator von abstammungspezifischen Genen und blockiert den Zellzyklus durch Repression von proliferationsfšrdernden E2F Zielgenen. Die hier gezeigten Daten zeigen, dass auch umgekehrt E2F die transkriptionelle und differenzierungsfšrdernde AktivitŠt von C/EBPa entgegenwirkt. Somit besitzen E2F-C/EBPa eine zentrale Schalterfunktion zwischen Proliferation und Differenzierung. Der Repressionsmechanismus durch E2F ist in mehreren Aspekten neuartig: Zum erstenmal wurde gezeigt, dass E2F einen anderen Transkriptionsfaktor reprimieren kann. E2F reprimiert die transkriptionelle AktivitŠt von C/EBPa ohne Bindung an cis-regulatorischen Elemente, sondern durch direkte Protein-Protein Interaktionen, die die Bindung von C/EBPa an DNA verhindern. Diese Form der transkriptionellen Repression geschieht unabhŠngig von "Pocket-Proteinen''". Patienten mit Akuter Myeloiden LeukŠmie (AML) weisen hŠufig eine gestšrte DNA Bindung von C/EBPa auf, welche ursachlich fŸr granulozitŠren Funktionsstšrungen sein kšnnte. Daher wŠre es wichtig zu analysieren ob E2F die DNA Bindung von C/EBPa in AML Patienten beeintrŠchtigt und ob auf E2F gerichtete Therapien granulozitŠre Reifung wiederherstellen. C/EBPa blockiert Zellproliferation durch vielseitigen Mechanismen. Hier wurde gezeigt, dass C/EBPa mit UBF1, dem Co-Aktivator der RNA Polymerase I, an chromosomalen Foci positioniert wird. Eine €hnlichkeit zu anderen fokalen Strukturen suggeriert, dass C/EBPa die Transkription von Polymerase I regulierten rRNA Gene reprimieren und somit ribosomale Biogenese beeintrŠchtigen kšnnte. Die Assoziation zwischen C/EBPa und UBF1 wird durch die Histon-Methyltransferase SUV39H1 stimuliert. Demnach kšnnte die antiproliferative Funktion von C/EBPa nicht nur auf der Regulierung von RNA Pol II-abhŠngiger Transkription, sondern auch auf der Repression von RNA Pol I regulierter rRNA Synthese basieren. / The transcription factor CCAAT/Enhancer-Binding Protein alpha (C/EBPa) coordinates proliferation arrest and differentiation of myeloid progenitors and adipocytes. C/EBPa acts as a transcriptional activator of lineage specific genes and blocks the cell cycle by repressing transcription of E2F-regulated genes. Data presented here suggest that also inversely E2F interferes with the transcriptional activity of C/EBPa, counteracting C/EBPa-mediated differentiation processes. Thus, E2F-C/EBPa are part of a switch mechanism between proliferation and differentiation. The mechanism by which E2F suppresses C/EBPa-mediated transactivation is novel in several aspects. E2F acts as a co-repressor of another transcription factor, C/EBPa, without binding to cis-regulatory elements, but by direct protein-protein interactions that abolish the binding of C/EBPa to DNA. This mechanism of transcriptional repression occurs independent of pocket proteins. Disturbed DNA binding of C/EBPa is often observed in AML patients suggesting a causative role in granulocytic disorders. Thus, it would be of main interest to analyze whether E2F mediates disruption of C/EBPa''s DNA-binding in AML patients and whether therapies directed against E2F could restore granulocytic maturation. Despite the extensive knowledge of mechanisms involved in the inhibitory function of C/EBPa, it has not been addressed whether C/EBPa may impinge on cell proliferation by affecting the ribosomal biogenesis of a cell. This work demonstrates an association of C/EBPa to the RNA Pol I transcription factor UBF1, both proteins retained in large chromosomal foci. Similarities to other focal structures associated to UBF1, suggest that C/EBPa may repress transcription of Pol I-transcribed rRNA genes, and thus affect ribosomal biogenesis. The enrichment of C/EBPa at sites of UBF1 is induced by the histone methyltransferase SUV39H1. Thus, C/EBPa may not only control lineage commitment and cell proliferation by regulating genes transcribed by RNA Pol II, but also may act as a repressor of RNA Pol I mediated rRNA synthesis.

Bisher wurde davon ausgegangen, dass der IKK-komplex durch Regulation des Transkriptionsfaktors NF-kappaB die stressinduzierte Expression von Zielgenen steuert. Im Rahmen der hier vorgelegten Dissertation konnte jedoch gezeigt werden, dass der IKK-Komplex unabhängig von seiner Rolle in der NF-kappaB-Aktivierung die Stabilität einer Vielzahl von mRNAs kontrolliert. Mittels der Kombination von Ko-Immunopräzipitationsstudien und SILAC-MS konnte die induzierte Interaktion der regulatorischen Untereinheit des IKK-Komplexes IKKgamma mit dem Gerüstprotein EDC4 (Enhancer of Decapping 4) nachgewiesen werden. EDC4 ist eine essentielle Komponente sogenannter zytoplasmatischer „Processing Bodies“ (P-Bodies). Diese fungieren als Depots für die Speicherung von mRNAs, aber auch als Orte der mRNA-Degradation und der miRNA-vermittelten Repression spezifischer Zielgene. Die Interaktion von IKKgamma mit EDC4 konnte durch verschiedene Stimuli induziert werden. Dazu zählen DNA-Schäden durch Doppelstrangbrüche, aber auch die Aktivierung von Oberflächenrezeptoren durch TNFalpha und IL-1beta. EDC4 dient darüber hinaus als Substrat der Kinase IKKbeta. Mittels Massenspektrometrie und Kinaseassays konnten vier IKK-abhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Die IKK-vermittelte Phosphorylierung von EDC4 ist essentiell für die Regulation von mRNAs und die damit verbundene Bildung der zytoplasmatischen P-Bodies. Diese Befunde konnten sowohl in stabilen induzierbaren Zelllinien, mittels transienter Transfektion und durch den Gebrauch von Kinaseinhibitoren in primären als auch in Krebszelllinien bestätigt werden. mRNA-Stabilitätsassays und eine RNA-Seq Analyse bestätigten die stressinduzierten Änderungen in den Halbwertszeiten spezifischer Transkripte und offenbarten einen gemeinsamen Regulationsmechanismus des IKK-Komplexes mit EDC4. / The IKK complex is deemed to regulate gene expression through the activation of the transcription factor NF-kappaB. Here I describe an NF-kappaB-independent function of the IKK complex in regulating mRNA stability across different cell types and stimuli. A SILAC-MS screen for interaction partners of the regulatory subunit IKKgamma revealed an inducible interaction with Enhancer of mRNA Decapping 4 (EDC4). EDC4 is an essential component of cytoplasmic processing bodies (P-bodies). P-bodies function as sites of mRNA storage, degradation and miRNA-mediated silencing. Interaction between IKKgamma and EDC4 can be induced by various stimuli, including DNA damage, TNFalpha and IL-1beta. EDC4 was identified as a novel IKK substrate and four IKKbeta phosphorylation sites were determined by mass spectrometry and in kinase assays. Stable inducible cell lines, transient transfection and kinase inhibitors were used in different human cancer and in primary cell lines and demonstrated that phosphorylation of EDC4 by IKK is essential for formation of P-Bodies in response to numerous stimuli. mRNA stability assays confirmed stress-induced changes in the half-life of target mRNAs and revealed common regulation of mRNA stability by IKK and EDC4. The transcriptome-wide reach of this joint regulation was assessed via RNA-Seq analysis.

Die vorliegende Arbeit ist im Rahmen eines Projektes zur Untersuchung der Genexpression bei Tiermodellen neurologischer Erkrankungen entstanden. Mit herkömmlichen Kandidatenansätzen ist eine Genexpressionsanalyse nur in beschränktem Umfang zu realisieren. Ziel war daher die Etablierung eines Verfahrens wie SAGE (serielle Analyse der Genexpression), das die Analyse des gesamten Transkriptoms zuläßt. Wie die Arbeit zeigt, ist SAGE in einem Standardlabor durchführbar. Es wurden geringfügige Abwandlungen der Orginalmethode eingeführt. Zur Sequenzfehlerkorrektur wurde ein spezielles Computerprogramm entwickelt und evaluiert. Zur Evaluierung der statistischen Auswertung von SAGE wurde zusätzlich zu einer Darstellung des gesamten statistischen Entscheidungsprozesses explorativ die Situation statistischer Entscheidungen wie sie im Rahmen üblicher SAGE Experimente auftreten mit vier Tests nachgeahmt. Es wurde eine Testvariante (modifizierter Z-Test) angewandt und evaluiert, die bis dato noch nicht zur Auswertung von SAGE benutzt worden war. Um die Reliabilität von SAGE abschätzen zu können, wurde von vier Mäusegroßhirnen die Gesamt-RNS vereinigt. Diese Transkriptgrundpopulation wurde zweigeteilt und parallel untersucht. Die beiden Gruppen wurden anhand eines statistischen Tests, der die gesamte Verteilungen der beiden Profile prüft, auf Homogenität untersucht. Zusätzlich wurde das Zusammenhangsmaß ermittelt. Dies ergab, daß die Reliabilität von SAGE im vorliegenden Kontext (relativ geringe Stichprobe und ein komplexes Gewebe) nicht optimal ist. Es kann jedoch keine Aussage dazu gemacht werden, ob dies der Methode selbst, das heißt ihrer molekularbiologischen Praxis und der Datenaufbereitung, anzulasten ist oder einer großen Stichprobenvariabilität. Dies bedeutet, daß in der vorliegenden Arbeit keine endgültige Aussage zur Reliabilität von SAGE möglich ist. Es werden Möglichkeiten dargestellt mit einer suboptimale Reliabilität im Rahmen von zukünftigen Projekten umzugehen. / The work presented here evolved within the framework of a project that examines gene expression of neurological conditions in animal models. Using conventional methods (candidate genes study) gene expression analysis is limited. Hence, the aim was to establish a procedure like SAGE (serial analysis of gene expression) that allows for analysis of the entire transcriptome. As shown it is possible to perform SAGE in a standard laboratory. Minor changes to the original version were made. A special computer program was developed and evaluated to reduce sequencing errors. In addition to a description of the entire statistical process, the statistics of SAGE were explored by simulating normal SAGE experiments, using 4 statistical tests. One test version (modified Z-test) that has not been used for statistical analysis of SAGE yet was applied and reviewed. To assess the reliability of SAGE the total-RNA of 4 corteces of mice was extracted and combined. This basic transcript population was divided in two and the parts examined in parallel. Both groups were analysed using a statistical test that tests the entire distribution of both profiles for homogeneity. Additionally the correlation (and its degree) of the profiles was calculated. The result was that the reliability of SAGE is not optimal in the context of this work (relatively small sample and complex tissue). However, no conclusion can be drawn as to whether the method itself (biomolecular practice and data analysis) is responsible for this, or whether it is due to sample variability. This means that in the work presented here no final statement concerning the reliability of SAGE is possible. Possibilities are described to deal with the issue of suboptimal reliability within the framework of future projects.

Während der Evolution entwickelten sich Promotorelemente von Prokaryonten, Eukaryonten und Plastiden in Sequenz und Struktur unterschiedlich. Ein Transfer von Promotorsequenzen zwischen Prokaryonten, Eukaryonten und Plastiden sollte daher zu keiner effizienten Genexpression führen. Mit dieser Arbeit sollte die Spezifität von Promotoren analysiert und ihre Funktionalität über `kingdom´-Grenzen hinaus untersucht werden. Hierfür wurden zwölf pflanzenspezifische Promotoren, welche in der Gentechnik zur Herstellung von transgenen Pflanzen eingesetzt werden, auf Genexpression in fünf Bakterienarten untersucht. Weiterhin wurden drei bakterielle und sechs Plastiden Promotoren auf Genexpression in Nicotiana tabacum untersucht. Die Frequenz, mit der die pflanzenspezifischen Promotoren (P) in den untersuchten Bakterienarten zu einer Expression führten, lag bei 50 % der getesteten Kombinationen. Für den P ST-LS1 aus Solanum tuberosum wurde eine Expression in den fünf untersuchten Bakterienarten nachgewiesen. Zwei der getesteten pflanzenspezifischen Promotoren, P RolC aus Agrobacterium rhizogenes und P 247 aus N. tabacum zeigten keine Expression in den untersuchten Bakterienarten. Die Charakterisierung der mRNA-Transkripte ausgewählter Fusionen der pflanzenspezifischen Promotoren mit den Reportergenen zeigten eindeutig, dass für die Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNA-Polymerase Sequenzelemente der pflanzenspezifischen Promotoren genutzt wurden. Mit einer ortsspezifischen Mutagenese des P ST-LS1 konnte die von der bakteriellen RNA-Polymerase genutzte -10-Region in Escherichia coli und Acinetobacter sp. ermittelt werden. Die `down-Mutanten´ führten in E. coli und Acinetobacter sp. zu einer Reduktion der Expression, wohingegen sie nach stabiler Integration in das Pflanzengenom von N. tabacum eine unverminderte Expression in bezug auf den Wildtyp-Promotor zeigten. Die Untersuchung der bakteriellen und Plastiden Promotoren ergab nur in einem einzigen Fall von neun getesteten Promotoren eine sehr geringe transiente Expression. / During evolution the promoter elements from prokaryotes, eukaryotes and plastids have developed differently with regard to their sequence and structure, implying that in general a transfer of promoter sequences between prokaryotes, eukaryotes and plastids will not cause an efficient gene expression. The aim of this study was to investigate the specificity of promoter sequences and their functionality in different kingdoms. Therefore 12 different plant-specific promoters, all used for the construction of genetically modified plants, were tested for their capability to direct a gene expression in various bacteria. Furthermore three bacterial and six plastid promoters were tested with respect to their ability to direct a gene expression in Nicotiana tabacum. The frequency of plant-specific promoters (P) directing gene expression in bacteria was 50 % of the combinations analysed. The promoter P ST-LS1 of Solanum tuberosum was functional in all bacteria tested. Two of the plant-specific promoters, P RolC of Agrobacterium rhizogenes and P 247 of N. tabacum, caused no gene expression in the bacteria tested. The characterisation of mRNA-transcripts of fusions between the plant-specific promoter sequences and the reporter genes proved that sequence elements of the plant-specific promoters themselves were used for transcription initiation by the bacterial RNA polymerase. By site-directed mutagenesis of the P ST-LS1 the -10 region used by the bacterial RNA polymerase of E. coli and Acinetobacter sp. was identified. The generated `down-mutants´ of the P ST-LS1 promoter showed a reduction of expression in E. coli and Acinetobacter sp. while these mutants were still fully active after stable integration in the genome of N. tabacum compared to the wildtype promoter. The investigation of the bacterial and the plastid promoters showed a very low transient expression of one out of nine promoters tested.

Genregulation bezeichnet die geregelte Steuerung der Genexpression durch das Zusammenspiel einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren die in ihrer Gesamtheit hoch komplexe und zell-spezifische genregulatorische Netzwerke bilden. Im Rahmen meiner Arbeit beschäftigte ich mich mit zwei Ansätzen der computergestützten Analyse solcher Netzwerke, Modellierung und Reverse Engineering. Der erste Teil meiner Arbeit beschreibt die Entwicklung der Web-Anwendung GEne Network GEnerator (GeNGe). Hierbei handelt es sich um ein System für die automatische Erzeugung von genregulatorischen Netzwerken. Hierfür entwickelte und implementierte ich einen neuartigen Algorithmus für die Generierung von Netzwerkstrukturen die wichtige Eigenschaften biologischer Netzwerke zeigen. Für die dynamische Beschreibung der Transkription modifizierte ich eine nicht-lineare Kinetik. Diese neue Formulierung der Kinetik eignet sich besonders für die Erstellung von komplexen genregulatorischen Modellen am Computer. Desweiteren unterstützt GeNGe die Durchführung verschiedener in silico Experimente, um theoretische Aussagen über den Einfluss von Störungen des Systems treffen zu können. Der zweite Teil meiner Arbeit beschreibt die Entwicklung von GNRevealer. Es handelt sich hierbei um eine Methode zur Rekonstruktion von genregulatorischen Netzwerken auf Basis zeitdiskreter Messungen der Genexpression. Diese Methode verwendet ein neuronales Netz zusammen mit einem passenden Lernalgorithmus (backpropagation through time). Modifizierungen, welche notwendig für die Anwendung im Reverse Engineering Bereich sind, wurden von mir entwickelt, wie z.B. die Etablierung eines vollständigen Lernprozesses, die Diskretisierung der Ergebnisse und anschließende Validierungen. Im letzten Teil dieser Arbeit beschreibe ich eine Studie, in der sechs verschiedene Reverse Engineering Anwendungen von mir miteinander verglichen wurden. Diese Untersuchung hebt GNRevealer als geeignetste Anwendung aller getesteten Methoden hervor. / Gene regulation is accomplished mainly by the interplay of multiple transcription factors. This gives rise to highly complex and cell-type specific, interwoven structures of regulatory interactions summarized in gene regulatory networks. In this thesis, I address two approaches of computational analysis of such networks, forward modeling and reverse engineering. The first part of this thesis is about the Web application GEne Network GEnerator (GeNGe) which I have developed as a framework for automatic generation of gene regulatory network models. I have developed a novel algorithm for the generation of network structures featuring important biological properties. In order to model the transcriptional kinetics, I have modified an existing non-linear kinetic. This new kinetic is particularly useful for the computational set-up of complex gene regulatory models. GeNGe supports also the generation of various in silico experiments for predicting effects of perturbations as theoretical counterparts of biological experiments. Moreover, GeNGe facilitates especially the collection of benchmark data for evaluating reverse engineering methods. The second part of my thesis is about the development of GNRevealer, a method for reverse engineering of gene regulatory networks from temporal data. This computational approach uses a neural network together with a sophisticated learning algorithm (backpropagation through time). Specialized features developed in the course of my thesis include essential steps in reverse engineering processes such as the establishment of a learning workflow, discretization, and subsequent validation. Additionally, I have conducted a large comparative study using six different reverse engineering applications based on different mathematical backgrounds. The results of the comparative study highlight GNRevealer as best performing method among those under study.

Post-transkriptionelle Genregulation ist ein zentraler Mechanismus, den lebende Organismen nutzen, um Funktionalität, Entwicklung und Anpassung zu gewährleisten. Defizite in diesem Mechanismus haben zahlreiche Krankheiten und Fehlfunktionen zur Folge. Post-transkriptionelle Genregulation wird von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) ausgeführt. Ihr kombinatorisches Agieren ermöglicht eine genau abgestimmte Kontrolle räumlicher und zeitlicher Genexpression. Ein RBP erkennt seine Zielmoleküle typischerweise anhand sogenannter Bindemotive: Nukleotidsequenzen, die kompatibel sind mit einer Aminosäuretasche innerhalb des Proteins. Es gibt jedoch einen Sonderfall der Zielmolekülerkennung, der überRNAs, insbesondere microRNAs (miRNAs), vermittelt wird. miRNAs sind im Genom kodierte 20-25 Nukleotid lange RNAs, die in Argonaut (Ago)-Proteine geladen werden können, um diese zu ihren Zielmolekülen (z.B mRNAs) zu navigieren. Es wird angenommen, dass miRNA:Ago-Komplexe nahezu alle zellulären Prozesse kontrollieren. Dementsprechend werden miRNA-Fehlfunktionen (z.B. verursacht durch Mutation nur eines einzelnen Nukleotids in einer Bindestelle) mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die Charakterisierung aller miRNA-Zielmoleküle („miRNA targetome“) ist eine der wichtigsten Fragen, die mithilfe der Systembiologie adressiert werden kann. / Post-transcriptional gene regulation is a key mechanism exploited by living organisms to ensure their functionality, development and adaptation. Deficiencies in this mechanism lead to various diseases and malfunctions. Post-transcriptional gene regulation is exerted by RNA-binding proteins (RBPs). Their combinatorial action allows fine-tuned control over spatial and temporal gene expression to meet the actual cell demands. An RBP typically recognizes its targets via so called binding motifs: nucleotide sequences compatible with an amino-acid pocket inside the protein. However, there is a special case of target recognition guided by RNAs. In particular, micro RNAs(miRNAs) – 20-25 nucleotide long transcripts encoded in the genome–can be loaded into Argonaute (Ago) proteins to navigate them to their target RNAs. It is estimated that miRNA:Ago complexes control virtually all processes occurring in the cell. Consequently, malfunctions in the miRNA pathway (including even a single nucleotide mutation in a binding site) are implicated in multiple disorders. Therefore, the characterization of the “miRNA targetome” is one of the most important questions addressed to the systems biology

Der Ribonukleinsäure (RNS) Stoffwechsel umfasst verschiedene Schritte, beginnend mit der Transkription der RNS über die Translation bis zum RNA Abbau. Poly(A) Schwänze befinden sich am Ende der meisten der Boten-RNS, schützen die RNA vor Abbau und stimulieren Translation. Die Deadenylierung von Poly(A) Schwänzen limitiert den Abbau von RNS. Bisher wurde RNS Abbau meist im Kontext von cytoplasmatischen Prozessen untersucht, ob und wie RNS Deadenylierung und Abbau in Nukleus erfolgen ist bisher unklar. Es wurde daher eine neue Methode zur genomweiten Bestimmung von Poly(A) Schwanzlänge entwickelt, welche FLAM-Seq genannt wurde. FLAM-Seq wurde verwendet um Zelllinien, Organoide und C. elegans RNS zu analysieren und es wurde eine signifikante Korrelation zwischen 3’-UTR und Poly(A) Länge gefunden, sowie für viele Gene ein Zusammenhang von alternativen 3‘-UTR Isoformen und Poly(A) Länge. Die Untersuchung von Poly(A) Schwänzen von nicht-gespleißten RNS Molekülen zeige, dass deren Poly(A) Schwänze eine Länge von mehr als 200 nt hatten. Die Analyse wurde durch eine Inhibition des Spleiß-Prozesses validiert. Die Verwendung von Methoden zur Markierung von RNS, welche die zeitliche Auflösung der RNS Prozessierung ermöglicht, deutete auf eine Deadenylierung der Poly(A) Schwänze schon wenige Minuten nach deren Synthesis hin. Die Analyse von subzellulären Fraktionen zeigte, dass diese initiale Deadenylierung ein Prozess im Nukleus ist. Dieser Prozess ist gen-spezifisch und Poly(A) Schwänze von bestimmten Typen von Transkripten, wie nuklearen langen nicht-kodierende RNS Molekülen waren nicht deadenyliert. Um Enzyme zu identifizieren, welche die Deadenylierung im Zellkern katalysieren, wurden verschiedene Methoden wie RNS-abbauende Cas Systeme, siRNAs oder shRNA Zelllinien verwendet. Trotz einer effizienten Reduktion der RNS Expression entsprechender Enzymkomplexe konnten keine molekularen Phänotypen identifiziert werden welche die Poly(A) Länge im Zellkern beeinflussen. / The RNA metabolism involves different steps from transcription to translation and decay of messenger RNAs (mRNAs). Most mRNAs have a poly(A) tail attached to their 3’-end, which protects them from degradation and stimulates translation. Removal of the poly(A) tail is the rate-limiting step in RNA decay controlling stability and translation. It is yet unclear if and to what extent RNA deadenylation occurs in the mammalian nucleus. A novel method for genome-wide determination of poly(A) tail length, termed FLAM-Seq, was developed to overcome current challenges in sequencing mRNAs, enabling genome-wide analysis of complete RNAs, including their poly(A) tail sequence. FLAM-Seq analysis of different model systems uncovered a strong correlation between poly(A) tail and 3’-UTR length or alternative polyadenylation. Cytosine nucleotides were further significantly enriched in poly(A) tails. Analyzing poly(A) tails of unspliced RNAs from FLAM-Seq data revealed the genome-wide synthesis of poly(A) tails with a length of more than 200 nt. This could be validated by splicing inhibition experiments which uncovered potential links between the completion of splicing and poly(A) tail shortening. Measuring RNA deadenylation kinetics using metabolic labeling experiments hinted at a rapid shortening of tails within minutes. The analysis of subcellular fractions obtained from HeLa cells and a mouse brain showed that initial deadenylation is a nuclear process. Nuclear deadenylation is gene specific and poly(A) tails of lncRNAs retained in the nucleus were not shortened. To identify enzymes responsible for nuclear deadenylation, RNA targeting Cas-systems, siRNAs and shRNA cell lines were used to different deadenylase complexes. Despite efficient mRNA knockdown, subcellular analysis of poly(A) tail length by did not yield molecular phenotypes of changing nuclear poly(A) tail length.

Chromatin ist ein Makromolekül, dessen Genregulation innerhalb des räumlich eingeschränkten Zellkerns organisiert werden muss. Die Genomorganisation ist eng mit Genaktivierung und Genrepression verknüpft. In den vergangenen Jahren wurde gezeigt, dass die DNA hierarchisch organisiert ist. Die Faltung läuft in aufeinander folgenden Schritten ab, wobei jede Organisationsebene sowohl zur räumlichen Komprimierung, als auch zur Genregulation beiträgt. In dieser Dissertation wurden mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie verschiedene Ebenen der 3D Chromatinorganisation auf Einzelzell-Basis untersucht. Auf der kleinsten Organisationsebene wurde die Struktur zweier, nebeneinander liegender topologischer Domänen (TADs) am Sox9-Lokus erforscht. Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) in 3D Zellen, sowie Cryoschnitten in embryonalen Stammzellen von Mäusen konnten Interaktionen zwischen den benachbarten TADs festgestellt werden. FISH in Zellen mit genomischen Duplikationen, zeigte das Entstehen von zwei unterschiedlichen, durch die Duplikation entstandenen, Konformationen. Unter Verwendung von FISH wurden long-range Kontakte, die zuvor mit GAM entdeckt wurden, untersucht und es zeigte sich, dass sie häufig zwischen TADs die regulatorischen Domänen enthalten auftreten. Zudem zeigte sich die Bildung von Clustern zwischen mehreren, weit auseinander liegenden, regulatorischen Elementen. Dies lässt unter Umständen auf das Entstehen von regulatorischen Zentren zwischen diesen Enhancer-reichen Regionen schließen. Weitere Untersuchungen zeigten Veränderung der sogenannten Super-Enhancer Cluster in unterschiedlichen Zelltypen. Des Weiteren sind Super-Enhancer TADs sehr dekondensiert und wurden häufig an Splicing-Speckle Regionen vorgefunden. / Chromatin needs to organize gene regulation whilst fitting into the confined space of the nucleus. Chromatin organization is therefore intertwined with gene activation and silencing. In recent years many advances in the field of chromatin architecture have been made showing that chromatin is organized hierarchically. Folding occurs in subsequent units, where each level of organization contributes to the spatial compaction of DNA and gene regulation. In this dissertation different levels of 3D chromatin organization were analysed using single-cell, high-resolution imaging. On the smallest scale, the 3D organization of two neighbouring Topologically Associating Domains (TADs) at the Sox9 locus was investigated. Performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) in 3D and cryosectioned mouse embryonic stem cells, extensive contacts between the two neighbouring TADs across the TAD boundary were detected. Applying FISH in a cell line bearing a genomic duplication within the Sox9 locus, the occurrence of two different conformations that result from the duplication was shown. Recent evidence from GAM showed the formation of long-range, multimer contacts between distal regulatory elements. Investigating the occurrence of long-range contacts between super-enhancer TADs in single cells by FISH, showed that they establish frequent interactions at close spatial distances. Furthermore the formation of clusters containing distal super-enhancer TADs could be demonstrated, indicating the possibility of higher-order regulatory hubs between these enhancer-rich regions. Further investigation showed that super-enhancer regions form different clusters in different cell types. Finally, it was shown that super-enhancers are highly decondensed and preferentially located at splicing speckles.

Koordinierte Phosphorylierung der C-terminale Domäne von RNA Polymerase II (RNAPII) ist essentiell für eine effiziente Kupplung von naszierender RNA Synthese und co-transkriptionalem RNA Prozessierens. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine neue Klasse von RNA Molekülen mit hoher Prävalenz in neuronalen Zelltypen. Die Biogenese von circRNAs ist noch ungeklärt, insbesondere die Frage warum das Intron upstream der circRNA während der Transkription des circRNA Exons zurückbehalten wird um Rück-Spleißen zu ermöglichen. Verschiede Belege suggerieren, dass unzulängliche Rekrutierung des Spleiceosoms zur circRNA Formation führen kann. In dieser Arbeit untersuche ich die Mechanismen die zu Defekten in der Erkennung und des Spleißens des Introns upstream der circRNA führen. Mit diesem Ziel erfasste ich die genomweite Verteilung von chromatinassoziierter RNAPII mit verschiedenen Phosphorylierungen, sowie Spleißfaktoren und Transkriptionsreglern mittels ChIP-seq in neuronaler Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen zu dopaminergen und Motoneuronen. Während der gesamten Differenzierung, aber insbesondere in den differenzieren Neuronen, konnten circRNAs detektiert werden. In meiner Arbeit finde ich, dass circRNAs detektiert werden, wenn Gene hohe Levels an mRNA exprimieren und, dass die Produktion von circRNA mit einer Dysbalance zwischen dem Laden der RNA-Polymerase II auf die DNA und dem Rekruitieren der Splice-Maschinerie zusammen hängt. Um funktionell mit den Pausier-Mechanismen der RNA-Polymerase II zu interferieren, habe ich einen ''promotor-proximal-pausing'' Faktor depletiert. Dabei stellte ich fest, dass diese Depletion genügt, um die circRNA Levels in embryonalen Stamzellen zu erhöhen. Die Ergebnisse die in dieser Arbeit gezeigt werden, beschreiben die Beteiligung des Pausierens der RNA-Polymerase II and der Formierung von circRNAs. / Coordinated phosphorylation of RNA polymerase II (RNAPII) C-terminal domain is essential for efficient coupling of nascent RNA synthesis with co-transcriptional RNA processing events. Circular RNAs (circRNAs) are a novel class of RNAs whose biogenesis remains ill understood, namely why the upstream intron is not spliced before the circRNA-exon is fully transcribed. Indirect evidence suggests that altered spliceosome recruitment can lead to circRNA formation. To investigate the mechanisms that may be involved in deficient recognition and splicing of introns upstream of exons included in circRNAs, I mapped the chromatin occupancy of RNAPII phosphorylated forms, splicing factors, and transcription regulators by ChIP-seq during mouse ESC differentiation to dopaminergic and spinal motor neurons. CircRNAs are detected throughout differentiation, peaking in differentiated neurons, as expected. I found that circRNAs are detected when genes express high levels of mRNA, and that circRNA production is associated with an imbalance between RNAPII loading and recruitment of the splicing machinery. To mechanistically interfere with pausing mechanisms, I depleted an RNAPII promoter-proximal pausing factor, and found that it was sufficient to increase the formation of circRNAs in stem cells. Results shown in this work implicate RNAPII regulation mechanisms in the formation of circRNAs.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die auf posttranskriptionaler Ebene die Genexpression hemmen. Dafür bilden miRNAs Ribonukleoprotein-Komplexe, deren Kernbestandteile aller Bilateria Argonaute (AGO) und GW182 /TNRC6 Proteine sind. GW182 / TNRC6-Proteine rekrutieren CCR4-NOT-Deadenylasen über kurze Tryptophan-reiche Motive (W-Motive), welche additiv wirken und fördern so die translationale Repression und den Abbau von Ziel-mRNAs. Um mehr über die Mechanismen der miRNA-abhängigen Genrepression zu erfahren, habe ich W-Motiv-abhängige Interaktionspartner humaner TNRC6C Proteine bestimmt. Hierzu habe ich, mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie, das Interaktom von wildtyp TNRC6C Proteinen mit dem von TNRC6C Proteinen, deren W-Motive mutiert wurden, verglichen. Neben bekannten Interaktionspartnern, wie Untereinheiten des CCR4-NOT Komplexes, habe ich Komponenten von Clathrin-Vesikeln (CCVs), Stoffwechsel assoziierte Enzyme, mitochondriale Proteine, RNA Helikasen, Kinasen und Phosphatasen mit potentiellen Funktionen in der miRNA-assoziierten Repression identifiziert. Die im ersten Teil dieser Studie vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass CCVs die Speicherung oder das Recycling von TNRC6 und AGO Proteinen vermitteln können und somit das miRNA-Silencing modulieren. Der zweite Teil dieser Studie befasst sich mit der Konservierung von miRNA vermitteltem Gen-Silencing in Cnidaria (Nematostella vectensis), welche sich vor 600 Millionen Jahren von der Ahnenreihe der Metazoa abspalteten. Hier zeige ich anhand humaner Zellen, dass Nematostella GW182, ähnlich wie in Bilateria, von AGO rekrutiert wird und nachfolgend in der Repression der mRNA fungiert, was darauf hinweist, dass dieser Mechanismus der miRNA-vermittelten Geninhibition bereits in den letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria aktiv war. / MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that act as post-transcriptional repressors of gene expression. To function miRNAs are assembled in ribonucleoprotein complexes, whose core components in bilaterian animals are Argonaute (AGO) and GW182/TNRC6 proteins. GW182/TNRC6 proteins additively recruit CCR4-NOT deadenylases via short tryptophan-containing motifs (W-motifs), thereby promoting translational repression and the decay of target mRNAs. To gain deeper insights into the mechanisms of miRNA silencing I determined the W-motif-specific interactome of human TNRC6C proteins. Using Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell Culture (SILAC) coupled to affinity purification and Mass Spectrometry (MS) I identified proteins enriched with wild type TNRC6C as compared to two mutants with disrupted W-motifs. Besides known functional interactors, such as subunits of the CCR4-NOT complex, I identified several components of clathrin-coated vesicles (CCVs), metabolic enzymes, mitochondrial proteins, RNA helicases, kinases, and phosphatases with potential functional roles in miRNA-mediated repression. The results presented in the first part of this thesis indicate that CCVs may mediate the storage or recycling of TNRC6 and AGO proteins, thus modulating miRNA silencing. The second part of the thesis addressed the conservation of the mechanisms of miRNA silencing via W-motifs in the cnidarian Nematostella vectensis, separated by 600 million years from other Metazoa. Using cultured human cells, I showed that similarly to bilaterians, GW182 in Nematostella is recruited to the miRNA repression complex via interaction with AGO proteins, and functions downstream to repress mRNA, indicating that this mechanism of miRNA-mediated silencing was already active in the last common ancestor of Cnidaria and Bilateria.