Les viroïdes sont des agents pathogènes responsables de maladies affectant les plantes telles que l'avocatier, le pêcher, la tomate, la pomme dé terre, etc. Parce qu'ils dégradent la qualité des fruits et des légumes qu'ils infectent, les viroïdes sont la cause de la perte d'environ 50 % de la production mondiale des cultures touchées. La compréhension des mécanismes couvrant l'infection aux viroïdes constitue un enjeu économique majeur visant l'amélioration de la productivité, dans l'exploitation de ces plantes. Cette étude aborde l'analyse des processus liés à l'infection aux viroïdes par la découverte de nouveaux aspects caractérisant la variabilité génétique du viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Elle décrit la dynamique des populations de PLMVd. La grande variabilité de PLMVd, expliquée par un fort taux de mutations, implique la génération de séquences diverses et variées, prenant la forme de nuages. Notre approche pour comprendre cette variabilité génétique de PLMVd consiste à infecter un pêcher à partir d'une seule séquence de PLMVd, puis à en extraire les séquences et analyser leurs caractéristiques intrinsèques par une nouvelle méthode bio-informatique. À notre connaissance, notre étude, à ce jour, est la première à utiliser les récentes techniques de séquençage à haut débit, à des fins d'analyses des viroïdes. La structure relativement simple des viroïdes, brin d'ARN circulaire d'environ 240 à 400 nucléotides, leur confère l'avantage de pouvoir être séquencé dans leur longueur totale par le séquençage à haut débit. Ce dernier couvre de grands volumes de données biologiques, ce qui convient pour séquencer les nuages de séquences qu'on peut retrouver au sein de la population de PLMVd. En bio-informatique, il existe de nombreux algorithmes permettant de comparer des séquences pour en extraire de l'information. L'un des défis majeurs de ces algorithmes est la prise en charge efficace et rapide de quantité de données en constante croissance. Dans le cadre de notre étude, le volume de séquences généré par PLMVd rend impraticable l'application des algorithmes d'alignement pour comparer les séquences et en estimer leurs similarités. D'autres algorithmes tels que ceux basés sur les N-grammes impliquent une perte partielle de l'information contenue dans les séquences. Nous avons donc utilisé une mesure de similarité basée sur le modèle de probabilité conditionnelle (CPD) qui nous permet d'une part, de conserver l'information sous forme de patrons (sous-séquences) contenus dans les séquences, et d'autre part, d'éviter l'alignement de séquences tout en comparant directement chaque séquence avec un ensemble de séquences. Le modèle CPD est intégré dans un nouvel algorithme de segmentation pour les séquences catégoriques, appelé DHCS. Cette étude révèle de nouveaux aspects dans la variabilité génétique de PLMVd. En effet, elle nous a permis d'une part d'extraire des familles de séquences caractérisées par des mutations spécifiques, puis d'autre part, de représenter la distribution de ces mutations dans une arborescence. Par la suite, elle a favorisé l'observation de mutations localisées dans le noyau d'un motif particulier, nommé le ribozyme en tête de marteau des séquences, servant à l'amélioration de l'adaptation de PLMVd. Celui-ci est effectivement sujet à mutations parce que la séquence inoculée au pêcher après 6 mois d'infections n'a pas été retrouvée et que le nombre de mutations enregistrées varie de 2 à 51. Des deux librairies obtenues, nous avons répertorié 1125 et 1061 séquences pour un total de 2186 nouvelles séquences de PLMVd. Seules 300 séquences étaient connues à ce jour. Nous avons observé que les séquences possèdent, selon la librairie, en moyenne 4.6 et 6.3 mutations par rapport à la séquence inoculée. Certaines d'entre elles ont jusqu'à 20 % de dissimilarité par rapport à la séquence inoculée, ce qui est considérable. Grâce à DHCS, les différentes séquences ont pu être groupées en familles, au nombre de 7 et 8 selon la librairie.

Depuis le développement rapide des méthodes de séquençage à haut débit (SHD) en écologie moléculaire, les moisissures ont eu moins d’attention que les bactéries et les virus, en particulier dans les études de bioaérosols. Les études d'exposition aux moisissures dans différents environnements sont limitées par les méthodes de culture traditionnelles qui sousestiment le large spectre de moisissures pouvant être présentes dans l'air. Bien que certains problèmes de santé soient déjà associés à une exposition fongique, le risque peut être sousestimé en raison des méthodes utilisées. L’application du séquençage à haut débit dans des échantillons de sol par exemple a permis de mieux comprendre le rôle des moisissures dans les écosystèmes. Cependant, la littérature n'est pas clair quant à la région génomique à utiliser comme cible pour l'enrichissement et le séquençage des moisissures. Cette thèse vise à déterminer laquelle des deux régions universellement utilisées, ITS1 et ITS2, convient le mieux pour étudier les moisissures dans l’air. Durant le développement de la méthode moléculaire, un autre défi, touchant la perte de cellules fongiques lors de la centrifugation d'échantillons d'air liquide à des fins de concentration, s’est rajouté. Ainsi, cette thèse décrit une nouvelle méthode de filtration pour remédier à la perte due à la centrifugation. Ces deux objectifs représentent la première partie de la thèse qui se concentre sur le développement de méthodes: le traitement des échantillons d’air avant extraction de l’ADN et la meilleure région à cibler avec la méthode SHD. La deuxième partie consiste à appliquer la méthodologie développée pour caractériser l'exposition aux moisissures dans trois environnements de travail différents: le compost, la biométhanisation et les fermes laitières. Les résultats montrent que la région d’ITS1 a surpasser ITS2 en couvrant davantage de diversité dans les bioaérosols. En raison de profils taxonomiques complémentaires, l'auteur de la thèse suggère d'utiliser les deux régions pour couvrir la plupart des taxons lorsque la taxonomie constitue le principal intérêt de l'étude. Cependant, ITS1 devrait être le premier choix dans les autres études, principalement en raison de la grande diversité et de la similarité des profils taxonomiques obtenus par l’approche métagénomique et l’approche ciblant ITS1. De plus, la nouvelle approche de filtration proposée constitue une meilleure alternative pour compenser la perte fongique due à la centrifugation. Ensemble, ces méthodes ont permis une meilleure description de l’exposition aux moisissures en milieu professionnel / Since the rapid development of high-throughput sequencing methods in molecular ecology, fungi have been the underdogs of the microbial world, especially in bioaerosol studies. Particularly, studies describing fungal exposure in different occupational environments have been limited by traditional culture methods that underestimate the broad spectrum of fungi present in the air. There are potential risks in the human inhalation of fungal spores in an occupational scenario where the quantity and diversity of fungi is high. Although some health problems are already known to be associated with fungal exposure in certain work environments, the risk may be underestimated due to the methods used. Applying high-throughput sequencing in soil samples has helped the explanation of the fungal role in ecosystems. However, the literature is not decisive in terms of the genomic region to use as target for the enrichment and sequencing of fungi. The present thesis deals with the challenge of determining which region from the two universally used regions, ITS1 and ITS2, is best suited for study of fungal aerosols. In tandem with this challenge came another of addressing the loss of fungal cells during the centrifugation of liquid impaction air samples for purposes of concentration. This thesis describes a new filtration-based method to circumvent such losses during centrifugation. These two challenges represent the first part of the thesis, which focuses on methodology development. In synopsis, the treatment of air samples prior to DNA extraction is considered, along with the identification of the best region to target in amplicon-based high throughput sequencing. In the second part of the thesis, the focus turns to the application of the developed methodology to characterize fungal exposure in three different work environments: compost, biomethanization, and dairy farms. All three are of special interest due to potentially high fungal exposure. Results show that ITS1 outperformed ITS2 in disclosing higher levels of fungal diversity in aerosol samples. Due to complementarity in the taxonomic profiles disclosed by the two regions, the author suggests the use of both regions to cover the greatest possible number of taxa when taxonomy is the main interest of the study. However, ITS1 should be the first choice in other studies, mainly because of the high diversity it reveals and its concordance with results obtained via shotgun metagenomic profiling. In addition, the new filtration-based approach proposed in this work might be the best alternative available for compensating the loss of propagules in centrifugation done prior to DNA extraction. Taken together, these methods allowed a profound characterization of fungal exposure in occupational environments.

L’infection broncho-pulmonaire représente le problème majeur des malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs bactéries sont connues depuis des dizaines années comme les principaux agents responsables de ces infections (par exemple Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans…). Récemment, certains genres fongiques notamment les champignons filamenteux (comme Aspergillus, Scedosporium…) ont été identifiés comme des pathogènes émergeants ou ré-émergeants pouvant être responsables d’infection invasive. Ainsi, la détection des microorganismes impliqués dans ces colonisations et/ou infections respiratoires demeure importante sur le plan physiopathologique et clinique.Si la culture microbiologique reste la méthode la plus utilisée à ce jour pour le diagnostic des infections microbiennes, elle ne permet pas d’identifier les microbes non-cultivables ou difficiles à cultiver. Depuis quelques années, grâce au développement de la technique moléculaire de séquençage à haut-débit (next generation sequencing ou NGS), plusieurs études ont montré que l’écologie microbienne du poumon des patients atteints de la mucoviscidose est très complexe et correspond à une flore poly-microbienne, appelée le microbiote pulmonaire, comprenant non seulement des bactéries mais également des micromycètes (levures et/ou champignons filamenteux) et des virus et phages. Une dysbiose (modification en abondance et diversité) de cette flore pourrait influencer la fonction respiratoire et l’état clinique du patient.Alors que le microbiome bactérien et son rôle en pathogenèse sont largement étudiés, peu d’études ont porté sur la composante fongique (mycobiote/mycobiome) du microbiote pulmonaire. Notre travail de thèse s’inscrit dans les différents projets développés au sein de l’axe de recherche « Microbiote pro- et eucaryote pulmonaire » coordonné par le Pr Laurence Delhaes dans l’équipe Biologie et Diversité des Pathogènes Eucaryotes Emergeants (BDPEE) dirigée par le Dr Eric Viscogliosi. Il se focalise sur l’analyse NGS du microbiote pro- et eucaryotique respiratoire chez les patients atteints de la mucoviscidose et notamment la comparaison de différentes approches méthodologiques en vue d’une optimisation et standardisation de la méthode.Dans un premier temps, nous présenterons une synthèse des connaissances actuelles d’une part des phénomènes de colonisations/infections fongiques chez les patients atteints de mucoviscidose et d’autre part dans le domaine du microbiote pulmonaire et surtout du mycobiote pulmonaire autour duquel notre équipe se focalise.2Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à mieux adapter l’approche NGS aux études du microbiote pulmonaire dans la mucoviscidose. En effet, le séquençage à haut-débit est une technique puissante mais pour laquelle des biais peuvent être introduits à de nombreuses étapes méthodologiques. Un des biais les plus importants est que l’approche NGS ne permet pas de différencier les microorganismes vivants, des cellules mortes ou endommagées, ni de l’ADN extracellulaire. Dans le contexte de notre travail –celui du microbiote pulmonaire chez des patients atteints de mucoviscidose et souvent exposés aux antibiotiques par voie intraveineuse à forte dose, l’analyse NGS pourrait évaluer incorrectement l’abondance et la diversité de ce microbiote pulmonaire. Un prétraitement des échantillons par propidium monoazide (PMA), qui permet de cibler sélectivement l’ADN des cellules vivantes, pourrait être une solution pour palier à cette limite. Notre étude avait donc comme objectif de déterminer si un prétraitement par PMA des expectorations modifiait le microbiote pro- et eucaryote pulmonaire analysé par NGS. Nous discutons l’intérêt et la relevance clinique de cette approche « PMA - NGS » permettant une quantification isolée des microorganismes vivants dans le contexte de la mucoviscidose. / Chronic pulmonary infection results in an irreversible decline in lung function in patients with cystic fibrosis (CF). While several bacteria are known as main causes for these infections (for example: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans...), more recently some fungal genera including filamentous fungi (such as Aspergillus, Scedosporium...) have also been identified as emerging or re-emerging pathogens able to cause invasive mycosis. Thus, the identification of the microorganisms involved in the respiratory colonizations and/or infections has become essential.Still now culture methods remain the gold standard for diagnostic of microbial infections. However, it could not identify non-culturable or difficult-to-cultivate microorganisms. Thanks to the development of high-throughput sequencing (next generation sequencing or NGS), recent studies have shown that the lung of patients with CF is a complex poly-microbial flora, also called the CF lung microbiota, which includes not only bacteria but also fungi (yeast and/or filamentous fungi), and viruses and phages. Dysbiosis (loss of abundance and/or diversity) of the lung microbiota has been associated with the patient's decreased lung function and poor clinical status.While lung bacteriota and its role in pathogenesis have widely been studied, few research studies focus on the fungal component (mycobiota/ mycobiome) of the lungs. Our thesis (PhD work) focuses on NGS analysis of pro- and eukaryotic lung microbiota in CF patients, in particular on the comparison of different methodological approaches to optimize and standardize the NGS protocol. This project has been developed under the supervision of Pr. Laurence Delhaes in the “Biology and Diversity of Eukaryotic Emerging Pathogens” team directed by Dr. Eric Viscogliosi.Firstly, we present a state of art on the current knowledge on the fungal colonization/infections risk in CF as well as the development of new concepts of lung microbiota and lung mycobiota on which our team focuses.Secondly, we applied the NGS approach to study the pro- and eukaryotic microbiota in the sputum samples of CF patient lung. Indeed, NGS is a powerful technique that may introduce biases on numerous methodological steps. One of the most important biases is that this technique could not differentiate among the living microorganisms, the dead or damaged cells, and the extracellular DNA. In the context of the CF lung microbiota which is often exposed to high-dose intravenous antibiotics, the analysis by NGS might evaluate4inaccurately the abundance and the diversity of the lung microbiota. Pretreatment of samples by propidium monoazide (PMA), which can target selectively the DNA of viable cells, could be a solution to overcome this limitation. Our study aimed to determine whether a sample pretreatment with PMA modified the lung pro- and eukaryotic microbiota analyzed by NGS. We discuss the clinical relevance of this approach "PMA - NGS" in the context of CF patients to a better quantification of living microorganisms.

Le cancer est une maladie du génome. La transformation tumorale résulte de l’acquisition de mutations somatiques via divers processus mutagènes opérant tout au long de la vie du patient. Les mécanismes à l’origine des mutations incluent les erreurs de réplication, les défauts de réparation de l’ADN, les modifications de base spontanées ou catalysées par des enzymes cellulaires, et l’exposition à des agents mutagènes endogènes (ROS) ou exogènes (tabac, UV…). Au cours de ma thèse, j’ai analysé des données de séquençage exome et génome complet de tumeurs hépatiques pour décortiquer les mécanismes à l’origine des mutations dans ces tumeurs, leur interaction avec les facteurs de risque, les processus cellulaires, les gènes drivers, et leur évolution au cours de la maladie. J’ai utilisé des méthodes statistiques existantes et dévoloppé des outils bioinformatiques innovants pour:- extraire les signatures de mutations et de réarrangements structuraux à l’aide de données de séquençage à haut débit- identifier les facteurs de risque et/ou les altérations génétiques à l’origine de chacune- prédire les mécanismes mutagènes à l’origine de chaque mutation somatique- explorer les corrélations entre la densité des mutations et les processus cellulaires comme la réplication et la transcription- reconstruire l’histoire clonale des tumeurs et dater l’apparition des signatures mutationnelles et des aberrations chromosomiques.Ces approches innovantes m’ont permis d’identifier 10 signatures mutationnelles: 5 signatures ubiquitaires à l’œuvre dans toutes les tumeurs hépatiques mais modulées par les facteurs de risque (sexe, alcool, tabac), et 5 signatures sporadiques opérant dans moins de 5% des tumeurs et associées à des étiologies connues (aflatoxine B1, acide aristolochique) ou restant à identifier. J’ai aussi mis en évidence 6 signatures de réarrangements structuraux, notamment des phénotypes duplicateurs et déléteurs, spécifiques de petits groupes de tumeurs. Chaque processus mutagène est modulé différemment par la réplication et la transcription. Les signatures liées à des molécules formant des adducts sur l’ADN (hydrocarbures polycycliques aromatiques, aflatoxine B1, acide aristolochique) sont nettement moins actives dans les gènes fortement exprimés suite à l’action du transcription-coupled repair, alors que la signature 16, liée à l’alcool, présente un motif unique de transcription-coupled damage. Une corrélation étonnante entre la densité des petites insertions et délétions (indels) et l’expression des gènes a été identifiée, conduisant à une accumulation considérable d’indels dans les gènes très forterment exprimés dans les cellules hépatiques. Enfin, l’histoire clonale des tumeurs hépatiques montre l’évolution des signatures mutationnelles au cours du temps et identifie l’accumulation de gains chromosomiques multiples comme un évènement tardif entraînant probablement une croissance de la tumeur jusqu’à une taille détactable en clinique. Ces résultats nous éclairent sur les mécanismes à l’origine des altérations génomiques dans l’histoire naturelle des cancers du foie. / Cancer is a disease of the genome. A normal cell goes rogue and is transformed into a cancerous cell due to acquired somatic mutations in its genome. The catalogue of these somatic mutations observed in the cancer genome is the outcome of multiple mutational processes that have been operative over the lifetime of a patient. These mutational processes that have occurred throughout the development of cancer may be infidelity of the DNA replication machinery, impaired DNA repair system, enzymatic modifications of DNA, or exposures to exogenous or endogenous mutagens. Each mutational process leaves a characteristic pattern – a “mutational signature” on the cancer genome. Various genomic features related to genome architecture, including DNA replication and transcription, modulate these mutational processes. During my PhD, I analyzed whole exome and whole genome sequencing data from liver tumors to understand the mutational processes remodeling these tumor genomes, their interaction with risk factors, cellular processes, and driver genes, and their evolution along the tumor histories. For that aim, I used existing statistical methods and I developed innovative computational tools to:- extract mutational and structural variant signatures from next-generation sequencing data- identify risk factors or genetic alterations underlying each process- predict the mutational process at the origin of each somatic mutation- explore correlations between mutation rates and cellular processes like replication and transcription- reconstruct the clonal history of a tumor and the timing of mutational processes and copy-number changes These innovative analytical strategies allowed me to identify 10 mutational signatures: 5 ubiquitous signatures operative in every liver cancer but modulated by risk factors (gender, alcohol, tobacco), and 5 sporadic signatures operative in <5% of HCC and associated with specific known (aflatoxin B1, aristolochic acid) or unknown mutational processes. I also identified 6 structural variant signatures, including striking duplicator or deletor phenotypes in rare tumors. Each mutational process showed a different relationship with replication and transcription. Signatures of bulky DNA adducts (polycyclic aromatic hydrocarbons, aflatoxin B1, aristolochic acid) strongly decreased in highly expressed genes due to transcription-coupled repair, whereas the alcohol-related signature 16 displayed a unique feature of transcription-coupled damage. A striking positive correlation between indel rate and gene expression was observed, leading to recurrent mutations in very highly expressed tissue-specific genes. Finally, reconstructing the clonal history of HCC revealed the evolution of mutational processes along tumor development and identified synchronous chromosome duplications as late events probably leading to fast tumor growth and clinical detection of the tumor. Together, these findings shed new light on the mechanisms generating DNA alterations along the natural history of liver cancers.

Le metabarcoding, un domaine alliant les technologies de séquençage à haut débit et l’identification d’organismes biologiques via l’ADN, a permis d’ouvrir les portes à un grand nombre de nouveaux projets scientifiques. Il existe une multitude de programmes capables d’effectuer les analyses, mais ces programmes ne sont souvent pas adaptés pour des projets particuliers comme la détection de pathogènes. ADAPTI a été développé afin de répondre à ce manque. ADAPTI est une méthodologie complète d’analyse adaptée pour la détection de pathogènes, mais capable de s’adapter à différents contextes de recherche grâce à son développement flexible et extensible. Toute la méthodologie a été mise à l’épreuve afin d’évaluer sa capacité, tant au niveau de l’efficacité en temps, mémoire vive et en espace disque, qu’au niveau de la validité et l’exactitude des résultats. Il a été démontré qu’ADAPTI est non seulement capable de fournir des résultats sur des jeux de données de grande taille, mais il le fait avec une grande sensibilité tout en conservant une efficacité multifilaire acceptable. ADAPTI a ensuite été comparé à des programmes open source en utilisant un jeu de données standardisé et il a été déterminé qu’il permet d’effectuer de meilleures analyses que les autres programmes testés. Il a été déterminé que la haute sensibilité fait la force d’ADAPTI, mais aussi l’une de ses faiblesses en permettant une plus grande quantité de séquences « bruits », lesquelles nécessitent des traitements supplémentaires. Certains programmes composant la suite d’ADAPTI nécessitent de l’optimisation au niveau de l’utilisation de la mémoire vive, ce qui est souvent un enjeu en bio-informatique. Il sera aussi nécessaire d’implémenter des capacités de calcul parallèle massif, car l’évolution rapide des technologies de séquençage rendra ADAPTI inefficace dans sa forme actuelle d’ici quelques années. Somme toute, ADAPTI est une méthodologie fonctionnelle capable de répondre à la demande en pathologie.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 janvier 2024) / Les protéines sont des machines moléculaires essentielles au fonctionnement des organismes vivants. Malgré plus de 60 ans de recherche en ce sens, notre compréhension des mécanismes qui façonnent leur évolution reste loin d'être complète. Les nouvelles méthodes d'édition de génome offrent de nouvelles possibilités en termes de méthodologie pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Les connaissances découlant de ces nouvelles approches ont un potentiel important pour améliorer la santé humaine, animale et végétale. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont en premier lieu élaboré une nouvelle méthodologie basée sur l'édition de base pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Cette approche a identifié plus de 700 sites ayant une importance fonctionnelle dans les gènes essentiels de levure. Les données générées par cette expérience ont aussi permis d'identifier des propriétés de sgRNA déterminantes pour l'efficacité de l'édition base. Dans le deuxième chapitre, nous avons utilisé une approche de mutagenèse systématique pour caractériser les mutations menant à la résistance à un antifongique, la 5-fluorocytosine, dans le gène FCY1. Nous avons en même temps pu mesurer les compromis résistance-fonction pour les mutants de ce gène, et pu valider la capacité de notre jeu de données à prédire le phénotype de résistance de mutants d'orthologues provenant d'espèces de levures pathogènes. Finalement, nous avons utilisé nos connaissances des propriétés de FCY1 acquises au chapitre précédent pour en faire un modèle d'évolution des protéines. Plus précisément, nous avons exploré le rôle potentiel de l'épistasie en trans entre des mutants de perte de fonction dans la transition d'un complexe homomérique vers hétéromérique suite à une duplication de gène. Nous avons découvert des centaines de paires d'allèles inactifs de FCY1 pouvant se complémenter, et avons pu explorer les propriétés de ces mutants et des complexes hétéromériques résultants. / Proteins are molecular machines essential to the functioning of living organisms. Despite more than 60 years of research in this direction, our understanding of the mechanisms that shape their evolution remains far from complete. Recently developed genome tools methods offer new possibilities in terms of methodology for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. The knowledge resulting from these new approaches has significant potential in human, animal, and plant health. In the first chapter of this thesis, we developed a new methodology based on base editing for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. This approach identified more than 700 sites of functional importance in essential yeast genes. The data generated by this experiment also made it possible to understand sgRNA properties that are decisive for the efficiency of base editing. In the second chapter, we used a systematic mutagenesis approach to characterize the mutations leading to resistance to an antifungal, 5-fluorocytosine, in the FCY1 gene. At the same time, we measured the resistance-function trade-offs for mutants of this gene and validated the ability of our dataset to predict the resistance phenotype of orthologous mutants from pathogenic species. Finally, we used our knowledge of the properties of FCY1 acquired in the previous chapter to use it as a model for protein evolution. Specifically, we explored the potential role of trans epistasis between loss-of-function mutants in the transition from a homomeric to a heteromeric complex following gene duplication. We have discovered hundreds of pairs of inactive FCY1 alleles that can complement each other, and have been able to explore the properties of these mutants and the resulting heteromeric complexes.

L’énorme diversité des immunoglobulines (IG) permet la reconnaissance spécifique d’un nombre presqu’infini d’antigènes, et assure à l’organisme une protection à long-terme envers les pathogènes déjà rencontrés. La région déterminant de la complémentarité 3 (CDR3) de la chaine lourde des IG est le principal déterminant de la spécificité de l’IG. A l’aide des technologies de séquençage à haut débit, nous avons évalué si une vaccination peut conduire à la production d’IG antigène-spécifiques et partagées entre individus (réponse humorale publique), en nous intéressant particulièrement à la région CDR3. Ces «signatures» antigène-spécifiques peuvent potentiellement être utilisées pour reconstruire a posteriori l’histoire immunitaire d’un individu. Pour tester cette hypothèse, des rats transgéniques produisant des anticorps humains (OmniRatTM) ont été vaccinés avec divers antigènes, en particulier du virus de la rougeole (souche vaccinale et sauvage). Une forte réponse immunitaire publique a été observée au sein de différents groupes de rats, caractérisée par des séquences CDR3 partagées entre les animaux ayant reçu le même vaccin. Ces groupes de CDR3s constituent des signatures complexes antigène-spécifiques. De futures études de suivi vaccinal et d’infection devraient nous permettre de déterminer si les signatures identifiées se retrouvent également chez l’humain. Ces outils pourront se révéler précieux dans le cadre de la campagne de l'Organisation mondiale de la Santé en vue de l’éradication de la rougeole, en permettant de distinguer entre les individus vaccinés et infectés / The enormous diversity of immunoglobulins (IG) allows the specific recognition of an almost infinite number of antigens, and ensure a long-term protection against pathogens previously encountered by the organism. The complementarity-determining region 3 (CDR3) of the immunoglobulin heavy chain (IGH) is the major antigen binding domain and determinant of antigen-specificity of the antibody molecule. Using next-generation sequencing, we tested whether immunization resulted in the generation and accumulation of similar IGH CDR3 sequences that are antigen-specific and shared across individuals, i.e. public IGH CDR3s. Such public "antigen-specific signatures" can potentially be used to retrospectively reconstruct past antigenic challenges. To test this hypothesis, transgenic rats with fully functional human Ig heavy and light chain loci (OmniRatTM) have been immunized with diverse antigens, and particularly measles virus (MV)-derived antigen. We demonstrated a strong public immune response within the different groups of rats characterized by convergent IGH CDR3 amino acid sequences in the animals that received the same vaccine. These clusters of CDR3s represent complex antigen-specific IGH CDR3 signatures. We are now transposing this concept to human studies by performing infection and vaccination follow ups to test whether similar CDR3 signatures can also be found in peripheral blood B cells. In the context of the MV eradication campaign of the World Health Organization, new epidemiological tools that enable to distinguish between immunized and infected individuals would be valuable assets

Contrôler les bactéries altérantes des aliments, notamment les produits carnés crus, est un enjeu majeur pour les industries agroalimentaires. Les conditions de stockage de la viande sous différentes atmosphères exercent une pression de sélection et modifient le comportement et le développement des communautés bactériennes initialement présentes. Des méthodes de séquençage à haut débit, utilisées pour caractériser différents écosystèmes microbiens, ont été appliquées pour étudier la dynamique des communautés bactériennes de la viande de poulet au cours du stockage.Nous avons développé une méthode pour constituer des écosystèmes microbiens standards dont la composition a été déterminée par pyroséquençage du gène de l’ARNr 16S. La présence de Brochothrix thermosphacta et de Pseudomonas parmi les espèces dominantes a été confirmée et nous avons mis en évidence que Shewanella et Carnobacterium étaient sous dominantes. Nous avons sélectionné deux écosystèmes pour effectuer des challenges tests reproductibles sur de la viande de poulet conservée sous 3 atmosphères couramment utilisées. Une analyse métatranscriptomique et métagénomique a été réalisée afin de savoir “Quelles bactéries étaient présentes ?”, “Qu’étaient-elles capables de faire?” et “Qu’exprimaient-elles?” suivant les conditions.Nous avons ainsi pu évaluer l’impact des mélanges gazeux sur la dynamique bactérienne et les fonctions exprimées par les bactéries suivant les contaminants initiaux. Cela nous donne des pistes pour fournir des indications afin d’optimiser la conservation de la viande en contrôlant les écosystèmes microbiens / Controlling spoilage microorganisms, especially in raw meat products, is challenging for the food industry.Storage conditions such as modified atmosphere packaging (MAP) have selective effects on the microbiota dynamics. Thanks to the recent developmentof next generation sequencing methods widely used for characterizing microbes in different ecosystems, we studied bacterial community dynamics during chickenmeat storage.We developed a method to constitute a standard meat microbial ecosystem hosting known bacterial species previously described by 16S rRNA sequencing. Our results confirmed the presence of Brochothrix thermosphacta and Pseudomonas and we also showed the presence of subdominant species as Shewanella and Carnobacterium. We selected 2 bacterial communities enabling reproducible challenge tests on meat during 9 days of storage at 4°C under 3 different atmospheres currently used in the industry.Metatranscriptomic and metagenomic analyses were performed to know “Who is there?”, “What can they do?” and “What are they expressing?” depending on the gaseous mixtures and on the initial microbiota.Consequently, we could evaluate the impact of storage atmosphere on the microbiotas dynamics and on the functions the bacteria expressed, depending on the storage condition and on the nature of the bacterial communities present. This led to indications of optimized storage conditions of poultry meat by managing their ecosystems.

La capacité de détection des agents pathogènes est un enjeu croissant tant les maladies infectieuses représentent un risque pour la santé animale et humaine. La globalisation des échanges commerciaux et des voyages, l’évolution des pratiques agricoles, les changements climatiques ou encore les migrations de masse sont autant de facteurs bouleversant la biologie des micro-organismes et de fait, leurs capacités d’émergence. Ce manuscrit décrit trois approches complémentaires, basées sur trois techniques innovantes de biologie moléculaire pour la détection d’agents pathogènes et appliquées à trois contextes différents : (i) la recherche d’une liste précise de micro-organismes par PCR quantitative en temps réel en format microfluidique, (ii) la détection sans a priori d’agents infectieux dans un milieu complexe par métagénomique et séquençage Illumina (Miseq) et (iii) le génotypage d’un agent infectieux sans amplification préalable des génomes par NGS (Nouvelles Générations de séquençage) de troisième génération, le MinION d’Oxford Nanopore Technologies. Ces trois études ont permis de montrer l’apport de ces techniques, qui présentent toutes des caractéristiques distinctes, adaptées à différentes applications. Au-delà de l’application de ces techniques au domaine du diagnostic microbiologique, leur utilisation dans le cadre du contrôle des médicaments immunologiques vétérinaires est une perspective prioritaire de ce travail. En effet, les préparations vaccinales vétérinaires sont soumises à l’obligation de recherche d’une liste d’agents pathogènes à exclure mais également à la vérification de l’identité génétique des souches vaccinales. L’accessibilité et les performances exponentielles des nouvelles technologies de PCR et de séquençage ouvrent ainsi des perspectives révolutionnaires dans le domaine du diagnostic et du contrôle microbiologique. / Detection of pathogens becomes an increasing challenge, since infectious diseases represent major risks for both human and animal health. Globalization of trade and travels, evolution of farming practices and global climatic changes, as well as mass migrations are impacting the biology of pathogens and their emerging potential. This manuscript describes three approaches, based on three innovative technologies of molecular biology applied to the detection of pathogens in three different settings : (i) detection of a list of pathogens using real-time quantitative PCR on a microfluidic platform, (ii) unbiased detection of pathogens in complex matrix, using metagenomics and Illumina (Miseq) sequencing and (iii) genotyping of pathogens without isolation of PCR-enrichment using a 3rd generation NGS (Next Generation Sequencing) platform MinION from Oxford Nanopore Technologies. The three studies shown the contribution of these techniques, each representing distinctive features, suitable for the respective applications. Beyond application of these techniques to the field of microbial diagnostics, their use for the control of veterinary immunological drugs is a priority of this project. Veterinary vaccines are not only submitted to mandatory detection of listed pathogens to be excluded, but also to validation of the genetic identity of vaccine strains. The exponential availability and performances of new PCR or sequencing technologies open cutting-edge perspectives in the field of microbial diagnostic and control.

De nombreux mécanismes contrôlent et limitent la prolifération des éléments transposables (ET) dans les génomes dont ils menacent l'intégrité structurale et fonctionnelle. Chez les plantes l'interférence ARN (ARNi) joue un rôle important dans ces contrôles via des petits ARN d'environ 20nt qui guident la régulation de l'expression de séquences endogènes ou exogènes par deux types de mécanismes. Un premier mécanisme, partagé par de nombreux organismes eucaryotes, inhibe l'activité d'ARNm par un contrôle post-transcriptionnel. Un deuxième type de régulation, permet un contrôle transcriptionnel de l'activité des ET via un mécanisme appelé RNA directed DNA Methylation (RdDM) qui implique des siARN («  short-interfering RNA ») de 24nt qui guident la méthylation de l'ADN spécifiquement au niveau des séquences d'ET. Les siARN sont impliqués également dans la restauration progressive de la méthylation de l'ADN après une perte induite par la mutation du gène DDM1 (Decrease in DNA Methylation 1). L'objectif de cette thèse est de tirer avantage des technologies de séquençage à haut débit pour caractériser le contrôle des ET par les siARN chez la plante modèle Arabidopsis thaliana.Dans un premier temps, j'ai développé des méthodes et outils bioinformatiques afin de gérer efficacement les données de séquençage à haut débit de banques de petit ARN. Ces outils, regroupés en pipeline, visent à permettre l'étude de l'accumulation des siARN correspondant aux séquences d'ET ou de familles d'ET ainsi que leur visualisation de manière globale ou détaillée.Ces outils ont ensuite été appliqués pour caractériser, dans un contexte sauvage, l'association entre les siARN et les ET afin de déterminer des facteurs pouvant expliquer les différences d'abondance en siARN observées. Ces analyses, réalisées en tenant compte de l'état de méthylation de l'ADN et du contexte génomique des ET apportent une vue statique du contrôle des ET par les siARN et de leur impact sur les gènes situés à proximité.L'analyse de banques de petits ARN de mutants de la voie de l'ARNi a ensuite été réalisée afin mieux caractériser l'impact de la perte de méthylation de l'ADN sur les populations de siARN et notamment définir les mécanismes impliqués dans la production des siARN de 21nt induite dans le mutant ddm1. Ces analyses comparatives du contrôle des ET lors d'une perte de la méthylation de l'ADN ont permis de mettre en évidence une production de siARN de 24nt indépendante de la voie classique du RdDM et de proposer un modèle permettant d'expliquer la production de siARN de 21nt dans le mutant ddm1.Dans un dernier temps, j'ai cherché à mieux définir l'implication des siARN dans la restauration des états de méthylation de l'ADN. Les variations de méthylation de l'ADN induites par la mutation ddm1 ont été caractérisées ainsi que leur stabilité transgénérationnelle au sein d'une population d'epiRIL. La stabilité de l'hypométhylation de l'ADN a été étudiée, au regard de données de séquençage à haut débit de banques de petits ARN de lignées WT, ddm1 ainsi que pour 4 lignées epiRIL, afin d'apporter une notion temporelle à l'étude du contrôle des ET par les siARN.Les résultats soulignent le rôle majeur des petits ARN pour le contrôle des éléments transposables afin de préserver l'intégrité structurale et fonctionnelle du génome et ce, via des mécanismes variés en fonction des ET. Ce travail ouvre la voie vers une analyse du contrôle des ET par les siARN basée sur une approche regroupant les ET en réseaux en fonction des séquences de siARN qu'ils partagent. Cela permettrait d'étudier les « connections-siARN » entre ET afin de, par exemple, explorer l'action en trans des siARN pour la restauration de la méthylation de l'ADN. / Many mechanisms control and limit the proliferation of transposable elements (TEs) which could otherwise threaten the structural and functional integrity of the genome. In plants RNA interference (RNAi) plays an important role in this control through small RNAs that guide the expression regulation of endogenous or exogenous sequences by two types of mechanisms. The first such mechanism, shared by many eukaryotic organisms, acts at the post-transcriptionnal level to inhibit the activity of mRNA. A second type of regulation allows the transcriptional control of TEs activity through a mechanism called RNA directed DNA methylation (RdDM) which involves 24nt long siRNA ("short-interfering RNA") that guide DNA methylation specifically on TEs sequences. Furthermore, siRNAs are also involved in the progressive restoration of DNA methylation after a loss induced by mutation of the DDM1 gene (Decrease in DNA Methylation 1). The aim of this thesis is to take advantage of high-throughput sequencing technologies to characterize these TEs controls mechanisms by siRNA in the model plant Arabidopsis thaliana .At first, I developed methods and bioinformatics tools to effectively manage data produced by high-throughput sequencing of small RNA libraries. These tools, combined in a pipeline, are designed to allow the study the accumulation of siRNA corresponding to TE sequences or TE families as well as their global or detailed visualization.These tools were applied to characterize, in a wild type background, the association between siRNA and TEs in order to define factors that may explain the observed differences in siRNA abundance . These analyses were performed by taking into account both DNA methylation states and genomic context. It provides a static view of siRNA control of TEs and their impact on nearby genes. Then, analysis of small RNA libraries from mutants of the RNAi pathway was performed to better characterize the impact of DNA methylation loss on siRNA populations and to define the mechanisms involved in the production of 21nt siRNA induced in the ddm1 mutant. These comparative analyses of the TE control after loss of DNA methylation allow us to highlight the production of 24nt siRNA independently of the classical RdDM pathway and to propose a model explaining the production of 21nt siRNA in the ddm1 mutant. At last, I tried to clarify the involvement of siRNA in the restoration of DNA methylation. Changes in DNA methylation induced by ddm1 mutation were characterized as well as their transgenerational stability in an epiRIL population. The stability of DNA hypomethylation has been studied in relation to high-throughput sequencing of small RNAs data from WT, ddm1 and 4 epiRIL lines. It provides a temporal view of the TE control by siRNA. The results highlight the important role of small RNAs in the control of transposable elements in order to preserve structural and functional integrity of the genome through a variety of mechanisms depending on TE sequences. This work opens the way to the analysis of the siRNA control on TEs based on approaches that combine TEs in networks based on their shared siRNA sequences. It would allow to study "siRNA-connections" between TEs in order to explore, for example, the action in trans of siRNA in the restoration of DNA methylation defect.