Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [68]-72. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 12 juillet 2005). Bibliogr.

Le plasma récupéré des dons de sang est utilisé pour produire annuellement plusieurs milliers de kg de préparations thérapeutiques d'immunoglobulines pour injection intraveineuse (IglV) qui sont utilisées pour le traitement de patients souffrant d'immunodéficiences primaires ou secondaires. Depuis quelques années, de très fortes doses d'IglV sont également utilisées pour traiter un nombre croissant de maladies autoimmunes, augmentant grandement les risques de pénurie de ce produit pour lequel il n'existe à l'heure actuelle aucun substitut. Il a été rapporté que le traitement in vitro des lymphocytes B humains aux IgPV induit une baisse de leur prolifération ainsi qu'une augmentation de la sécrétion d'IgG. Mes travaux de thèse ont porté sur l'étude des mécanismes par lesquels les IglV agissent sur les lymphocytes B. Dans un premier temps, nous avons utilisé une approche d'immunoprecipitation suivie d'analyses par spectrométrie de masse afin d'identifier les molécules ciblées par les IgPV à la surface des lymphocytes B. Comme prévu, nous avons identifié plusieurs protéines membranaires ou associées à la membrane plasmique telles que le CD91, les molécules du CMH I et II ainsi que les prohibitines 1 et 2. Cependant, des protéines strictement intracellulaires ont aussi été identifiées, telles que l'endoplasmine et le LYST (Lysosomal-trafficking regulator). Ces résultats nous ont permis de démontrer que les IglV étaient internalisées de manière spécifique et spontanée par les lymphocytes B activés in vitro et par les cellules myéloïdes dans le sang total. L'identification de molécules impliquées dans le processus de la présentation antigénique, comme les complexes majeurs d'histocompatibilité (CMH) I et II, nous a conduit à émettre l'hypothèse que les IgPV pouvaient interférer avec ce processus. À l'aide d'un système in vitro de présentation antigénique dépendant du CMH H, nous avons démontré que les IglV inhibaient la présentation d'antigène dépendante et indépendante du récepteur antigénique (BCR). Il a aussi pu être établi que cet effet n'était pas dû à une modulation du niveau de CMH II exprimé à la surface des lymphocytes B ni dépendant du récepteur inhibiteur pour la partie constante des IgG, le FcyRIIb. Nous avons donc proposé un mécanisme dépendant de l'interaction avec des protéines intracellulaires impliquées dans le processus de la présentation antigénique afin d'expliquer cet effet des IglV. Par la suite, à l'aide d'une lignée cellulaire déficiente pour l'expression du CD91, il nous a été possible de démontrer l'implication de ce récepteur dans l'internalisation spontanée des IglV. De plus, nous avons observé que le traitement aux IglV induit une phosphorylation de la partie intracellulaire du CD91 sur la tyrosine 4507. Nos résultats suggèrent aussi que le CD91 pourrait permettre la transcytose des IglV à travers la barrière hémato-encéphalique. En résumé, mes travaux de thèse ont identifié le CD91 comme étant impliqué dans le processus d'internalisation spontanée des IglV et suggèrent que cette internalisation est impliquée dans un nouvel effet des IglV sur les lymphocytes B : l'inhibition de la présentation antigénique.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017 / Chez l’humain, les lymphocytes B mémoires IgG+ et IgA+ sont des cellules clés de l’immunité humorale. Ces cellules mémoires sont maintenues à long-terme dans notre organisme. Elles représentent une défense rapide et efficace contre toutes les infections que nous avons déjà vaincues pendant notre vie. Ces cellules mémoires qui rencontrent à nouveau leur antigène se différencient rapidement en plasmocytes à courte vie, et permettent la sécrétion massive d’immunoglobuline (Ig). La contrepartie mémoire de ces cellules sont les plasmocytes à longue vie qui sont présents dans les niches de la moelle osseuse et y sécrètent en permanence des anticorps protecteurs qui circulent dans le sang. Ces cellules sécrétrices peuvent avoir une durée de vie allant de dizaines d’années à la vie entière de l’individu. Les patients qui reçoivent des traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie sont privés de ces cellules mémoires détruites par ces traitements au même titre que les cellules cancéreuses. Ces patients deviennent vulnérables aux infections et leur survie dépend de la régénération rapide de leur système hématopoïétique. Notre équipe a déjà mis au point une méthode pour préparer de grandes quantités des cellules mémoires capables de sécréter des IgG et des IgA. Les présents travaux visent à générer des plasmocytes fonctionnels et capables de survivre à long terme in vitro. La stratégie expérimentale visait à établir des conditions permettant de se rapprocher de l’environnement de la moelle osseuse. Dans un premier temps, nous avons étudié les paramètres permettant la différenciation des lymphocytes B mémoires en plasmocytes. Étant donné l’importance du potentiel redox dans l’environnement de la moelle osseuse, nous avons d’abord tenté d’en contrôler l’impact avec un antioxydant, le N-acétyle cystéine (NAC). Nos résultats ont démontré que le NAC avait un effet significatif et diminuait la phosphorylation de la protéine STAT3 en raison d’une inhibition des kinases JAK2 et JAK3. Étonnamment, cet antioxydant retardait la différenciation de nos lymphocytes B qui étaient stimulés avec une forte interaction CD40-CD154. Par la suite, la comparaison des interactions CD40-CD154 et CD27-CD70 a permis de conclure qu’il était essentiel de réduire à son minimum l’interaction CD40-CD154 et qu’il fallait ajouter les cytokines IL-6 et IL-10. Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées présentaient un phénotype similaire à celui des plasmocytes de la moelle osseuse. Malheureusement la fréquence de ces cellules était faible et leur viabilité insuffisante. Afin d’augmenter la survie de ces cellules le dernier volet de nos travaux visait à se rapprocher des niches de la moelle osseuse. Notre but a été atteint en ajoutant des cellules mésenchymateuses issues de la moelle osseuse en présence de 8% de dioxygène (O2). Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées ont une excellente viabilité et représentent plus de 50% des cellules totales en culture. De plus, le modèle de culture est maintenant établi dans un milieu exempt de sérum et de protéines animales. Dans l’ensemble, nos résultats permettent de proposer la production ex vivo de plasmocytes autologues avec une perspective thérapeutique pour réduire les risques d’infections des patients devenues immunodéficients, suite à un traitement de radiothérapie ou de chimiothérapie. / In Humans, IgG+- and IgA+ memory B lymphocytes are key cells for the maintenance of humoral immunity. Memory B lymphocytes are long-lived cells maintained as a memory repertoire throughout our lives. Memory B lymphocytes can establish an efficient and rapid defense against previously encountered infections. These cells rapidly differentiate into short-lived plasma cells secreting high levels of antibodies. Their counterpart, the long-lived plasma cells are the memory populations present in the bone marrow microenvironment. The long-lived plasma cells release protective antibodies into the peripheral blood, maintaining a permanent immune protection. Plasma cells can remain active for years or even for the entire life of an individual. Conversely, patients treated for cancer receive massive doses of chemotherapy or radiotherapy, which are detrimental for immune memory cells as well as cancerous cells. Those patients become highly vulnerable to infectious diseases and their survival depends on the regeneration of their hematopoietic system. Our research group has established an in vitro model enabling to prepare large quantities of IgG and IgA-secreting memory B lymphocytes. The present study aims to further investigate in vitro conditions to generate plasma cells with high survival capacity and able to secrete antibodies. Our experimental strategy intends to establish culture conditions similar to the bone marrow environment. The first step was to study parameters involved into differentiation of memory B lymphocytes into plasma cells. The importance of the redox balance in the bone marrow environment led us to measure the impact of Nacetyl cysteine (NAC), an antioxidant. Our results showed that NAC decreased STAT3 activation by inhibiting the phosphorylation of two kinases namely JAK2 and JAK3. Surprisingly, the addition of NAC had a negative effect on the differentiation of memory B lymphocytes in our culture conditions using a high level of CD40 stimulation. By comparing the levels of CD40-CD154 and CD27-CD70 interactions, we then confirmed that a low level of CD40-CD154 interaction was essential. We also established that addition of IL-6 and IL-10 was better to favor plasma cell generation. The cells obtained in this model were CD31+CD38+CD138+, showing a phenotype close to that of plasma cells found in the bone marrow. Unfortunately, those cells were produced in low frequency and were characterized by a low viability. To increase the survival of these in vitro generated plasma cells, we tried to generate culture conditions that resemble the bone marrow environment. We have achieved this by adding mesenchymal stem cells from bone marrow and maintained the cells at a low O2 level (8%). Cells CD31+CD38+CD138+ obtained at the end of the culture periods showed a high viability, and corresponded to more than 50% of total cultured cells. As expected, those cells were non-proliferating and able to secrete IgG. Furthermore, this in vitro culture model was established with a serum free media. In conclusion, our findings pave the way for the ex vivo production of autologous plasma cell for therapeutic purposes in order to reduce the risks of infection of immune-deficient patients.

Les infections opportunistes sont l’une des principales causes de mortalité associées à la greffe de cellules souches. Afin d’aider à reconstituer le système immunitaire des patients greffés, nous proposons d’exploiter les plasmocytes autologues générés in vitro dans notre modèle de culture basé sur l’interaction CD40-CD154. Pour ce faire, les milieux de culture doivent être exempts de protéines animales. Deux milieux sans sérum ont été préalablement développés à Héma-Québec. Notre hypothèse est qu’il serait maintenant possible de promouvoir la différenciation des lymphocytes B et de maintenir la survie des plasmocytes en modifiant la composition de ces milieux sans sérum. Nos résultats montrent que notre milieu sans protéines animales permet de générer un grand nombre de plasmocytes et que ceux-ci ont un profil d’expression de CD38 qui est stabilisé par la vitamine A. En conclusion, la formulation de ce milieu représente un progrès quant à la possibilité d’utiliser ces plasmocytes en immunothérapie.

La lymphocytose polyclonale chronique B (LPCB) est un syndrome peu connu caractérisé par une élévation polyclonale du nombre de lymphocytes B et de l’IgM sérique. Elle se distingue des pathologies lymphoïdes classiques par son origine polyclonale, sa grande stabilité ainsi que sa symptomatologie discrète et affecte majoritairement des femmes fumeuses. La présence de caractéristiques morphologiques et cytogénétiques distinctives, notamment cellules binucléées et anomalies génétiques (réarrangements bcl2/Ig multiples, isochromosome +i(3q)), guide le diagnostic initial. Ces particularités associées à un processus de transformation maligne contrastent avec l’apparente bénignité de la LPCB. Néanmoins, elles n’ont pas permis la délimitation précise de la population B impliquée dans la lymphocytose. Nos travaux avaient pour but d’identifier la population et les mécanismes impliqués dans l’émergence du syndrome, et éventuellement d’estimer les risques de progression clinique. En premier lieu, l’évaluation détaillée du profil immunologique des lymphocytes sanguins chez plusieurs patientes nous a permis de circonscrire formellement la lymphocytose aux cellules B IgD+IgM+CD27+. Mettant à profit les récentes avancées techniques et théoriques concernant la biologie du développement chez le lymphocyte B mature, nous avons entrepris l’analyse moléculaire des régions variables des gènes des immunoglobulines. Ces investigations ont confirmé le statut mémoire des cellules B en expansion dans la LPCB. Elles n’ont toutefois pas révélé la signature moléculaire résultant de sélection antigénique, processus central de la réponse immunitaire T-dépendante. Parallèlement, nos études fonctionnelles ont attesté de l’intégrité des molécules CD40 et AID, deux régulateurs clés de la maturation chez le lymphocyte B. Il ressort de nos analyses qu’un défaut dans la régulation de la réponse immunitaire, permettant le contournement de la sélection antigénique dans les centres germinatifs, plutôt qu’un blocage de différenciation cellulaire, serait probablement à l’origine de la lymphocytose. Alternativement, ces cellules pourraient être dérivées d’une population nouvellement caractérisée, les lymphocytes B mémoires de la zone marginale splénique, aussi retrouvés dans le sang, provenant présumement d’une voie de diversification indépendante des centres germinatifs. En conclusion, nos résultats ont permis de préciser le portrait diagnostique de la LPCB et de délimiter de nouvelles pistes de recherche touchant tant les aspects cliniques que la biologie fondamentale du syndrome. / Persistent polyclonal B cell lymphocytosis (PPBL) is an unusual haematological disorder, mainly detected in adult female smokers, that shares features of both benignity (polyclonal expansion, polyconal IgM secretion, lack of clinical symptoms, stable and mostly uneventful course); and features of malignancy (atypical binucleated cells, multiple bcl-2/Ig translocations, chromosome 3 anomalies, bone marrow involvement). Still, these morphological and clonal genetic anomalies have not been restricted to a distinctive B cell subset, and the apparent heterogeneity of the involved cellular population has long impeded further characterization of the syndrome. The aim of our research was to formally identify the population involved in the lymphocytosis, to gain some insight into the mechanisms at play in its development and to evaluate the risk for subsequent transformation in patients. Over the recent years, technical inputs from the molecular field have largely contributed to a better discrimination of the various B cells subsets and, by extension, of B cell lymphoid disorders. Thus, detailed immunophenotypic studies conducted in numerous PPBL patients allowed us to definitely circumscribe the disorder to IgD+IgM+CD27+ B lymphocytes, whereas exhaustive molecular analysis of immunoglobulin genes’ variable regions has corroborated the memory status of these cells. Yet, molecular signature of the antigenic selection process, the characteristic of a T-dependent immune response, was not detected. Sequencing of the CD40 and AID genes, key regulators in the diversification and affinity maturation of the immunoglobulin receptor, was additionally carried out and expression of both molecules was assessed. No anomaly was evidenced for either gene. In light of those observations, we conclude that a differentiation block in PPBL B lymphocytes is unlikely. Rather, we propose that defects in the affinity maturation process, namely impairment of the antigenic selection mechanism, allows the survival of low affinity IgD+IgM+CD27+ memory B lymphocytes in PPBL patients. Conversely, these cells could be related to the as yet scantily characterized IgD+IgM+CD27+ memory B cell subset from the splenic MZ, also found in the blood, and presumably derived from a germinal centre independent diversification pathway. Altogether, our results contributed to the elaboration of an accurate clinical definition for PPBL, and delineated avenues for future investigations regarding both the pathological aspects of the disorder and its purely fundamental biologic ramifications.

Les anticorps, piliers de la réponse immunitaire humorale, sont fréquemment utilisés pour traiter certaines immunodéficiences et maladies autoimmunes. Des préparations d'anticorps spécifiques à un antigène sont également administrées à des individus, suite à un contact avec un pathogène. Cependant, nous sommes limités dans leur production ainsi que dans la variété des spécificités antigéniques puisque leur préparation dépend de la disponibilité d'individus hyperimmunisés. Ce projet a donc pour objectif de produire des anticorps spécifiques in vitro en cultivant les lymphocytes B humains isolés du sang de participants. En stimulant les lymphocytes B humains avec du LPS d'Escherichia coli, la sécrétion d'anticorps spécifiques et la sécrétion de cytokines ont augmenté. Nous pensons que ce mécanisme accélère la réponse secondaire lors d'une infection bactérienne. Nous avons également tenté de stimuler la prolifération des lymphocytes B humains en surexprimant le gène AgT, un gène stimulant la croissance cellulaire chez les cellules COS7. Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'obtenir obtenir un effet biologique.

La signalisation calcique est un mécanisme physiologique essentiel pour l’homéostasie cellulaire, et en particulier pour les cellules immunitaires telles que les lymphocytes B (LB). Chez l’homme, la caractérisation des molécules impliquées dans la signalisation calcique des LB est encore restreinte. Nous avons donc choisi d’étudier les molécules STIM1, STIM2, Orai1 et TRPC1 afin de rendre compte des modifications de la signalisation calcique observées dans deux modèles physiopathologiques : le Lupus Erythémateux Systémique (LES) et la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Pour les LB de LES, par rapport à des LB de témoins, ce travail a permis de montrer que la surexpression de la molécule STIM1 dans les LB de LES, surtout au stade des LB transitionnels, était associée avec un influx constitutif et extracellulaire de calcium et que cet influx était responsable d’une phosphorylation modérée de la MAPK Erk1/2 dans les cellules au repos. Cependant, cet effet positif est contrebalancé par un défaut de l’influx SOCE (strore operated calcium entry) et d’un défaut d’activation de la phosphorylation de la MAPK Erk après stimulation du récepteur à l’antigène des LB (BCR). Les effets positifs et négatifs observés sur la phosphorylation d.Erk1/2 sont directement attribuables au niveau d’expression de STIM1 comme nous l’avons démontré en sur-exprimant STIM1 dans des LB de témoins (vecteur pSTIM1-STIM1) ou en ayant recours à un siRNA spécifique de STIM1 dans les LB de LES. Le défaut d’activité régulatrice des LB de LES sur la prolifération des LT dans un modèle de co-culture autologue LT/LB en présence de CpG (activation du TLR9 des LB), et d’anticorps anti-CD3/CD28 (activation des LT) est levé en inhibant l’expression de STIM1 dans ces cellules ce qui permet de restaurer la production d.IL-10 par les LB de LES et la génération de LT régulateurs. Le défaut d’activation de la voie Erk/DNMT1/méthylation de l’ADN dans les LB de LES semble également contrôlée par le niveau d’expression de la molécule STIM1.Pour les LB CD5+ de LLC, l’analyse des partenaires calciques nous a permis de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe qui exprime le complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 et un second groupe qui n’exprime qu’Orai1. La présence du complexe membranaire STIM1/TRPC1/Orai1 est associée avec un influx constitutif de calcium, la phosphorylation d’Erk1/2, et un défaut d’activation du signal SOCE après stimulation du BCR. Le rôle de la molécule CD5 sur l’influx constitutif des LLC du groupe I a été démontré en utilisant des siRNA spécifiques pourCD5 et en analysant la lignée B humaine Jok-1 transfectée avec CD5. Enfin, l’utilisation d’un anticorps anti-STIM1 est capable d’induire l’apoptose in vitro des LB de LLC du groupe I, alors que l’anticorps anti-CD20, rituximab, n’est efficace que sur les LLC du groupe II.En conclusion, cette étude ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques en auto-immunité dans le LES et en cancérologie dans la LLC. / Calcium signaling is a central mechanism for cellular homeostasis, including for immune cells such as B lymphocytes (B cells). In human, the characterization of the molecules involved in B cell calcium signalisation is still limited and we have focused our study on STIM1, STIM2, Orai1 and TRPC1. In order to better understanding the role of these molecules, two pathologies, with known calcium dysregulations, were chosen : Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).For SLE B cells, compared to healthy control (HC) B cells, this work has established that overexpression of the STIM1 molecule characterizes SLE B cells, especially at the transitional B cell stage. STIM1 overexpression in SLE B cells was associated with a constitutive extracellular calcium influx that in turn contributes to the moderate phosphorylation of the MAPK Erk1/2. However, this positive effect is counterbalanced by a defective strore operated calcium entry (SOCE), and a defective Erk phosphorylation after B cell receptor (BCR) activation. The positive and negative effects on the MAPK Erk1/2 in SLE B cells are directly linked to level of STIM1 as demonstrated in HC B cells transfected with a STIM1 vector (pSTIM1-STIM1), or by using a specific siRNA to STIM1 (siSTIM1) in SLE B cells.The incapacity of SLE B cells to regulate T cell proliferation in an autologous co-culture T/B cell model is reversed by using siSTIM1 in SLE B cells. In this model, using siSTIM1 in SLE B cells also restores the production of IL-10 by B cells, and the generation of regulatory T cells. The defective Erk/DNMT1/DNA methylation pathway in SLE B cells is suspected to be under the control of STIM1 overexpression.For CD5+ CLL B cells, analysis of calcium partners has enabled us to distinguish two groups of patients: one group that expresses at the plasma membrane the complex STIM1/TRPC1/Orai1 and a second group that expresses onlyOrai1. The presence of the membrane complex STIM1/TRPC1/Orai1 in CLL group I is associated with a constitutive extracellular calcium influx, the basal phosphorylation of Erk1/2, and a defaut to mobilize SOCE upon BCR engagement. In the CLL group I patients, a role of CD5 on the constitutive extracellular calcium influx was shown using siRNA specific to CD5 and using the transfected CD5 expressing B cell line Jok-1. Finally, the in vitro use of an anti-STIM1 antibody is able to induce apoptosis in CLL B cells from group I patients, while the anti-CD20 antibody (rituxan) was only effective in the CLL B cells from group II patients.In conclusion, this study opens new diagnostic and therapeutic perspectives in autoimmunity and in cancer.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 101-110. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.