Les microARNs, régulateurs post-transcriptionnels de l’expression des gènes eucaryotes, sont impliqués dans la défense contre les pathogènes. Afin de favoriser leur multiplication, les virus et les bactéries ont développé des stratégies pour altérer la voie des miRNAs. Dans ce travail, nous avons montré que Helicobacter pylori, une bactérie responsable chez l’Homme de pathologies gastriques sévères, telles que l’ulcère ou le cancer, réprime un cluster de microARNs spécifique des cellules souches embryonnaires dans une lignée épithéliale gastrique. En utilisant une technique de séquençage à haut débit, nous avons identifié miR-372 comme le miRNA le plus exprimé dans cette lignée gastrique. Avec miR-373, miR-372 permet la prolifération cellulaire réprimant l’expression d’un inhibiteur du cycle cellulaire, the LArge Tumor Suppressor 2 (LATS2). Au cours de l’infection par H. pylori, l’expression de miR-372&373 est réprimée, provoquant une accumulation de LATS2 et un arrêt du cycle cellulaire. De manière importante, la répression de ces miRNAs est dépendante de la translocation de l’effecteur bactérien CagA dans la cellule hôte. Ces données constituent un nouvel exemple d’interaction hôte-pathogène impliquant les miRNAs et ont identifié le couple LATS2/miR-372&373 comme un mécanisme inattendu dans l’arrêt du cycle cellulaire observé au cours de l’infection. Ce mécanisme pourrait refléter l’inhibition de l’auto-renouvellement de l’épithélium gastrique, processus impliqué dans la défense contre les infections bactériennes. / MicroRNAs, post-transcriptionnal regulators of eukaryotic gene expression, are implicated in host defense against pathogens. Viruses and bacteria have evolved strategies to suppress miRNA functions with the aim to establish a sustainable infection. In this work, we report that Helicobacter pylori, a bacterium responsible for severe human gastric inflammatory diseases and cancers, down-regulates an embryonic-specific microRNAs cluster in a gastric epithelial cell line. We reveal by using a deep sequencing approach that hsa-miR-372 is the most abundant miRNA expressed in this gastric cell line where, together with hsa-miR-373, it promotes cell proliferation by silencing the expression of a cell cycle inhibitor, the LArge Tumor Suppressor 2 (LATS2). Upon H. pylori infection, miR-372&373 synthesis is inhibited, leading to the derepression of LATS2 and thus, to a cell cycle arrest at the G1/S transition. Importantly, this down-regulation of a specific cell cycle-regulating microRNA is dependent on the translocation of the bacterial effector CagA into the host cells. These data constitute a novel example of host-pathogen interplay involving microRNAs and unveil the couple LATS2/miR-372&373 as an unexpected mechanism in infection-induced cell cycle arrest in proliferating gastric cells which may be relevant of inhibition of gastric epithelium renewal, a major host defense mechanism against bacterial infections.

Vibrio splendidus LGP32 est une bactérie pathogène associée aux épisodes de mortalités estivales qui affectent la production d'huître Crassostrea gigas depuis des décennies. Nous avons montré ici que la porine OmpU était un effecteur majeur de l'interaction V. splendidus / C. gigas. Nous avons pour cela construit un mutant ΔompU de V. splendidus. Celui-ci nous a permis de mo ntrer l'implication de OmpU (i) dans la résistance de V. splendidus aux antimicrobiens, incluant ceux de l'huître, (ii) dans la « fitness » chez l'huître, et (iii) dans la virulence en infections expérimentales (mortalités de 56 % pour le sauvage versus pour le 11% mutant). En accord avec ces résultats, nous avons montré que la délétion de ompU modifiait la sécrétion de protéines dont l'expression est contrôlée par les voies de régulation de la virulence (ToxR) et de l'intégrité membranaire (SigmaE). Par ailleurs, nous avons montré que OmpU jouait un rôle essentiel dans la reconnaissance par les hémocytes. En effet, (i) in vivo, les gènes hémocytaires répondent différemment à l'infection par le Vibrio sauvage ou ΔompU, et (ii) in vitro, OmpU est nécessaire à l'invasion hémocytaire par V. splendidus. Cette invasion utilise la phagocytose dépendante de l'intégrine b et la SOD extracellulaire du plasma d'huître comme opsonine qui lie OmpU. Ainsi, OmpU est un facteur de virulence majeur qui permet l'infection des hémocytes dans lesquels il est capable de survivre en inhibant la formation de radicaux oxygénés et de vacuoles acides. La résistance du Vibrio aux antimicrobiens hémocytaires de l'huître, elle-même dépendante de OmpU, est probablement un élément supplémentaire favorable à la survie intra-cellulaire. / Vibrio splendidus LGP32 is a bacterial pathogen associated to the summer mortality outbreaks that have affected the production of Crassostrea gigas oysters over the past decades. We showed here that the OmpU porin is a major effector of the V. splendidus / C. gigas interaction. For that, we have constructed a ΔompU mutant of V. splendidus, and shown that the OmpU porin is implicated (i) in the resistance of V. splendidus to antimicrobials, including those of oyster, (ii) in its in vivo fitness, and (iii) in its virulence in oyster experimental infections (mortalities have been reduced from 56 % to 11 % upon mutation). In agreement, we have shown that the ompU deletion modified the expression of secreted proteins controlled by the virulence (ToxR) and the membrane integrity (SigmaE) regulation pathways. Furthermore, we have shown that OmpU has a major role in the recognition of V. splendidus by oyster hemocytes. Indeed, (i) in vivo, hemocyt e genes displayed differential responses to an infection with the wild-type or the ΔompU mutant, and (ii) in vitro, OmpU was necessary for hemocyte invasion by V. splendidus. This invasion process required the hemocyte b-integrin and the oyster plasma extracellular SOD, which was found to act as an opsonin recognizing OmpU. Thus, OmpU is a major virulence factor that allows infection of hemocytes in which V. splendidus is able to survive by inhibiting the production of reactive oxygen species and the formation of acidic vacuoles. Resistance of V. splendidus to hemocyte antimicrobials, which is also OmpU-dependant, is probably an additional determinant of V. splendidus intracellular survival.

La voie de l’ARN interférence (ARNi), en particulier celle des siRNA, constitue la défense antivirale majeure chez les plantes,les nématodes et les insectes. Le génome de l’organisme modèle Drosophila melanogaster code pour trois protéines, Dcr-­‐2, AGO2 et R2D2, indispensables à cette voie. Les mouches mutantes pour une de ces trois protéines sont plus susceptibles et succombent plus rapidement aux infections virales comparées aux mouches sauvages. Beaucoup d’études biochimiques ont permis d’obtenir une image assez précise de la fonction moléculaire de ces trois protéines in vitro. Cependant, plusieurs études in vivo ont révélé une réalité plus complexe, probablement liée à l’association de ces molécules avec des cofacteurs. Ce manuscrit décrit les approches adoptées afin d’identifier les partenaires protéiques de la voie des siRNA et d’étudier leurs rôles, notamment dans un contexte infectieux. Dcr-­‐2, AGO2 et R2D2 ont été étiquetés par génie génétique avec un tag de 16 acides aminés, reconnu par la biotin-­‐ligase BirA, qui permet leur biotinylation après leurs transfections dans les cellules S2. Les cellules transfectées ont été ensuite soumises à différentes infections virales,notamment avec le virus C de la Drosophile (DCV) (Dicistroviridae), le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) (Rhabdoviridae) ou le Flock House virus (FHV) (Nodaviridae). Les cellules ont été ensuite lysées au pic de l’infection et les complexes protéiques purifiés et analysés par spectrométrie de masse.[...] / Fighting viral infections is hampered by the scarcity of viral targets and their variability resulting in development of resistance. Viruses depend on cellular molecules for their life cycle, which are attractive alternative targets, provided that they are dispensable for normal cell fonctions. Using the mode! organism Drosophila melanogaster, we identify the ribosomal protein RACK1 as a cellular factor required for infection by the internai ribosome entry site (IRES) containing virus Drosophila C virus (DCV). We further demonstrate that inhibition of RACK1 in human liver cells impairs hepatitis C virus (HCV) IRES-mediated translation and infection. Inhibition of RACK1 in Drosophila and hurnan cells does not affect cell viability and proliferation, and RACK1-silenced adult flies are viable, indicating that this protein is not essential for general translation. Our findings demonstrate a specific function for ribosomal protein RACK 1 in selective mRNA translation and uncover a promising targe! for the development of broad antiviral intervention.

L'ostréiculture, dominée par l'élevage de l'huître creuse Crassostrea gigas, représente plus de 70% du chiffre d'affaire réalisé par l'aquaculture française. Au sein des écosystèmes aquatiques, les bactéries appartenant au genre Vibrio forment l'un des groupes bactériens les plus abondamment représentés. Deux espèces, Vibrio splendidus et Vibrio aestuarianus, sont fréquemment associées et de façon récurrente, à des mortalités sévissant dans les élevages d'huître creuse Crassostrea gigas, le plus souvent en période estivale. Ce travail de thèse avait pour objectifs d'étudier des interactions Vibrio-huître et leurs modulations en fonction de la virulence des pathogènes et des paramètres génétiques et physiologiques de l'hôte. Le développement d'outils de détection et de quantification sensibles et spécifiques et la maîtrise de protocoles d'infection expérimentale à Vibrio ont permis d'explorer des mécanismes de virulence, d'étudier la variabilité de la sensibilité des huîtres à ces Vibrio et de caractériser la pathogenèse. L'étude de la diversité spécifique des souches bactériennes isolées dans un contexte de mortalité estivale sur une large échelle de temps et d'espace a permis de montrer la prédominance épidémiologique du groupe V. splendidus et de l'espèce V. aestuarianus associée aux épisodes de mortalité estivale de C. gigas en France. Une corrélation ayant été observée entre pouvoir pathogène et activité métalloprotéasique, un test phénotypique prédictif de la virulence des souches a été proposé. L'exploration du phénomène de synergie dans la pathogénicité des deux souches observé en co-injection expérimentale a conduit à la mise en évidence de l'existence d'un système de quorum sensing régulant aux niveaux intraspécifique (V. splendidus) et interspécifique (V. splendidus/V. aestuarianus) la production et l'expression au niveau transcriptionnel des gènes codant les métalloprotéases Vsm et Vam des deux souches étudiées. L'analyse statistique des cinétiques de mortalité obtenues chez des familles de demi-frères diploïdes et triploïdes soumises à un protocole de co-infection standardisée révèle une sensibilité accrue des huîtres à cette vibriose expérimentale, en période de gamétogenèse active. Les huîtres triploïdes soumises à cette même infection expérimentale n'ont présenté aucun avantage significatif. L'existence d'une base génétique de la sensibilité des huîtres aux vibrioses expérimentales a été illustrée par l'évaluation des sensibilités de quatorze familles de la cinquième génération (G5) issue du programme de sélection divergente réalisée dans le cadre de MOREST. Cette étude a également permis la description de co-infections à herpès virus OsHV-1 et V. aestuarianus suggérant une multi-étiologie des phénomènes de mortalité estivale. Une étude de pathogenèse à V. splendidus et V. aestuarianus réalisée par cohabitation a visé l'exploration des interactions liant l'huître creuse C. gigas et les Vibrio virulents, V. splendidus et V. aestuarianus, ou non virulents présents naturellement dans la flore endogène de l'hémolymphe ou dans l'eau des aquariums. Cette nouvelle approche a permis de mettre en évidence la rapidité de transmission des Vibrio virulents des huîtres infectées aux huîtres sentinelles en moins de deux heures, accompagnée d'une perturbation significative, précoce et transitoire de la réponse immunitaire de l'hôte au niveau transcriptionnel au cours des six premières heures de cohabitation. La prise en charge différentielle des Vibrio pathogènes et des Vibrio commensaux par l'huître suggère l'existence de mécanismes conduisant à une spécificité des réponses de l'huître visant l'élimination des Vibrio pathogènes et le maintien d'une flore vibrionacée endogène probablement bénéfique pour C. gigas.

La multi-résistance aux drogues des bactéries est un problème majeur en clinique. L'un des mécanismes de résistance consiste à effluer les composés toxiques hors de la cellule grâce à des protéines de la membrane interne nommées pompes d'efflux. Ces protéines appartiennent à cinq familles (MFS, RND, MATE, SMR et ABC) et peuvent fonctionner en association avec deux autres types de protéines (protéine du périplasme et protéine de la membrane externe) pour former un canal. Dans le cadre d'une thématique de recherche basée sur l'étude des mécanismes de résistance auxdrogues de la bactérie pathogène Legionella pneumophila, une approche bioinformatique menée sur lesgénomes de trois souches séquencés (souches Lens, Paris et Philadelphia) a permis d'identifier des protéinespouvant participer à l'efflux. Notre but a été de vérifier l'implication de ces protéines dans la résistance auxdrogues et dans la virulence de Legionella en ciblant un ou plusieurs gènes codant pour des composants desystèmes d'efflux. Pour inactiver les gènes, nous avons choisi une stratégie de recombinaison homologue. Lesrecombinants ont été testés pour leur sensibilité à des composés toxiques afin de voir si les gènes ciblés jouentun rôle dans l'efflux d'E. coli. Un de ces mutants, le mutant MF201, altéré pour le gène codant pour une protéinehomologue à TolC chez E. coli s'est avéré être 2 à 16 fois plus sensible aux drogues testées comparé à lasouche sauvage. De plus, ce mutant présente un défaut important de virulence dans Acanthamoeba castellanii,Dictyostelium discoideum et les macrophages U937. Ce premier résultat implique que la protéine TolC-like deLegionella aurait un rôle clef dans la relation hôte pathogène et sous-tend un lien entre multi-résistance auxdrogues et virulence. Par ailleurs une étude de l'expression des gènes codant pour des pompes à efflux a étéinitiée afin de comprendre leur rôle au cours du cycle infectieux de Legionella.

Les sporozoïtes de Plasmodium sont injectés par un moustique Anophèle et infectent le foie où le parasite se développe avant l’initiation d'une phase symptomatique érythrocytaire. Le sporozoïte pénètre activement les hépatocytes en formant une vacuole parasitophore où il se multiplie. Des facteurs parasitaires et de l’hôte sont impliqués dans l’invasion des hépatocytes mais les mécanismes restent méconnus. Pour faciliter l’étude de l’infection, nous avons généré des parasites fluorescents grâce à une nouvelle stratégie GOMO. L’utilisation des parasites P. yoelii fluorescents et d’un modèle cellulaire de lignées permissives ou non à l’infection, nous a permis de caractériser les mécanismes moléculaires et les cinétiques d’invasion. Nous avons montré que l’invasion productive est précédée d’une phase de traversée cellulaire où le parasite forme des vacuoles transitoires, distinctes des vacuoles parasitophores. Le parasite se sert d’une perforine PLP1 pour sortir de cette vacuole transitoire et échapper à la dégradation par les lysosomes de la cellule. Nous avons étudié le rôle de différents facteurs de l’hôte lors de l’invasion productive, selon les espèces plasmodiales. Si CD81 est nécessaire pour l’infection par P. falciparum et P. yoelii, les parasites P. berghei et P. vivax peuvent infecter des cellules n’exprimant pas cette protéine. Nous avons identifié deux protéines de la superfamille CD36, SR-BI et CD36, qui jouent un rôle lors de l’invasion CD81-indépendante. Ces résultats contribuent à l’élucidation des mécanismes d’entrée du parasite dans le foie et orientent vers la découverte des ligands parasitaires impliqués qui pourront être des cibles vaccinales. / Plasmodium sporozoites are transmitted by Anopheles mosquitoes and first infect the liver where the parasite replicates as a pre-requisite to the development of the pathogenic blood stage infection. Sporozoites infect hepatocytes by forming a parasitophorous vacuole differentiating into liver stages. Invasion involves parasite and host proteins but the underlying mechanisms remain unknown. To facilitate monitoring of sporozoite invasion, we generated novel transgenic fluorescent parasites, using a new selection strategy termed GOMO (Gene Out Marker Out). Using fluorescent P. yoelii strains and a robust cellular system we further characterized the temporal and molecular mechanisms of sporozoite invasion. We document that sporozoite productive invasion is preceded by a phase of cell traversal, and show that during cell traversal sporozoites enter transient vacuoles, which are distinct from parasitophorous vacuoles. We also uncovered that the perforin-like protein mediates sporozoite egress from transient vacuoles and escape from degradation by the host cell lysosomes. We studied the role of host factors implicated during the productive invasion of rodent and human Plasmodium species. We knew that P. falciparum and P. yoelii sporozoites require CD81 for infection and that P. berghei and P. vivax can infect cells lacking CD81. We identified two members of CD36 superfamily, SR-BI and CD36, as host entry factors defining a CD81-independent entry route. These results pave the way toward the elucidation of the mechanisms of sporozoite invasion and the identification of parasite ligands that mediate host cell entry, which would constitute potential targets for a malaria vaccine.

Les lymphocytes T (LT) CD8 jouent un rôle majeur dans la protection de l'hôte contre les parasites intracellulaires. Les LT CD8 reconnaissent des antigènes (ag) présentés par les molécules du CMH I à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). En fonction de l'origine des ag, deux voies d'apprêtement et de présentation sont connues et caractérisées : la voie 'classique' pour les ag endogènes et viraux, et la voie 'croisée' pour les ag exogènes internalisés. Néanmoins, il existe des situations physiologiques de présentation d'ag exogènes par les molécules du CMH I qui ne correspondent à aucune de ces deux voies. C'est le cas lors de l'infection par Toxoplasma gondii (T. gondii). Les mécanismes d'apprêtement dans ce contexte infectieux sont encore mal connus. T. gondii est un parasite intracellulaire obligatoire résidant dans une vacuole qui est un compartiment distinct d'un phagosome. L'infection des cellules se fait par un mécanisme d'entrée actif qui induit la formation et la maturation de la vacuole parasitophore (PV). Les protéines de granules denses (GRA) sont une large famille de protéines du parasite, essentielles à la maturation de la PV. Les protéines GRA sont sécrétées sous forme soluble dans la vacuole, puis certaines sont adressées vers différentes structures membranaires, tel que le réseau membranaire intravacuolaire (IVN : intravacuolar network) et la membrane limitante de la PV (PVM), auxquels elles s'associent de manière périphérique ou transmembranaire. L'une de ces protéines GRA, GRA6, est l'ag source de l'épitope immunodominant HF10. Des travaux ont mis en évidence, dans une lignée de cellules dendritiques (DC), le rôle de la protéine SNARE Sec22b dans la fusion membranaire entre des vésicules du réticulum endoplasmique (RE) et la PV, et dans la présentation de l'ag soluble Ova sécrété par T. gondii. Nous avons étudié le rôle de Sec22b sur la présentation d'ag fortement associés aux membranes (GRA6) dans des DC primaires et des macrophages par le CMH I en utilisant un protocole de déplétion par transduction lentivirale de shRNA. Nos résultats ont confirmé le rôle de Sec22b sur la présentation de l'ag soluble dans les DC, ce qui n'est pas le cas dans les macrophages. Enfin, dans les DC et les macrophages, nous avons montré que Sec22b n'impacte pas la présentation d'ag fortement associés aux membranes tel que GRA6. En parallèle, notre équipe a mis en évidence que GRA6 est insérée dans la PVM, avec le Cter exposé du côté du cytosol de la cellule hôte. Auparavant, notre équipe a publié que la présentation efficace d'épitope dérivé de GRA6 requiert sa localisation au Cter de la protéine. Ces données nous ont incitées à étudier l'impact de la topologie d'ag transmembranaires, sur leur accessibilité à la voie d'apprêtement et de présentation CMH I. Nous avons développé un modèle d'étude pour comparer l'apprêtement et la présentation par le CMH I de l'épitope HF10 en fonction de son exposition : côté cytosol de la cellule hôte, ou, côté lumière de la vacuole. Les mesures de présentation antigénique par des macrophages et des DC primaires infectés ont révélé une diminution de la présentation de HF10 lorsqu'il est exposé du côté lumière de la vacuole. Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence de nouveaux éléments dans la compréhension de la régulation de l'immunogénicité des ag de T. gondii aux niveaux cellulaire et moléculaire. / CD8 T lymphocytes play a major role for host protective immunity against intracellular parasites. CD8 T cells recognize antigens (Ag) presented by MHC I on the surface of antigen-presenting cells (APCs). Depending on the origin of Ag, two different processing and presentation pathways have been described: the classic one for endogenous and viral Ag, and the cross-presentation pathway for internalized exogenous Ag. Nevertheless, there are physiological conditions of exogenous Ag presentation by MHC I which do not fit any of these two pathways. It is the case for Toxoplasma gondii (T. gondii) infection. The mechanisms of processing in this infectious context are still unclear. T. gondii is an obligate intracellular parasite residing in a vacuole, a distinct compartment of a phagosome. Infection occurs via an active mechanism that induces the formation and maturation of parasitophorous vacuole (PV). Dense granule proteins (GRA) are a large parasite protein family, essential for the maturation of PV. GRA proteins are secreted as soluble proteins in the vacuole, and some are addressed to different membrane structures, such as the membrane intravacuolar network (IVN) and the vacuole limiting membrane (PVM). One of these GRA proteins (GRA6) is the source of an immunodominant epitope (HF10). Previous work highlighted in one dendritic cell line (DC), the role of SNARE Sec22b protein in membrane fusion between vesicles of the endoplasmic reticulum (ER) and the PV, and in the presentation of soluble Ova Ag, secreted by T. gondii. We have studied the role of Sec22b on Ag presentation of membrane-bound Ag (GRA6) in primary DC and macrophages by MHC I, using lentiviral transduction of shRNA. Our results confirmed the role of Sec22b on soluble Ag presentation in DC, which is not the case in macrophages. Finally, in DC and macrophages, we have shown that Sec22b does not impact on Ag presentation of membrane-bound Ags, such as GRA6. Besides this, our team highlighted that GRA6 is inserted in the PVM, with Cter exposed towards the host cell cytosol. Previously, our team published that effective presentation of the epitope derived from GRA6 requires its location at Cter of the protein. The association of these data prompted us to study the impact of Ag transmembrane topology on accessibility to MHC I processing and presentation. We developed a model to compare MHC I presentation of the HF10 epitope based on its exposition: at host cell cytosol, or, at vacuole lumen. Antigen presentation measurements by infected primary macrophages showed a decrease in HF10 presentation when exposed to the vacuole lumen side. My PhD work shed new light on the regulation of immunogenicity of T. gondii Ag at the cellular and molecular levels.

Les bactéries pathogènes intracellulaires manipulent les fonctions de la cellule hôte en sécrétant des facteurs de virulence (qu'on appelle effecteurs) dans le cytoplasme de la cellule infectée. Ce processus permet au pathogène de proliférer dans un environnement autrement hostile. L'identification et la caractérisation des effecteurs spécifiques des divers agents pathogènes est donc d'une importance cruciale pour contrer les infections bactériennes. Coxiella burnetii est un agent pathogène à Gram négatif de classe 3, responsable de la Fièvre Q, une zoonose qui entraîne des épidémies majeures, avec un fort impact sur l'économie et la santé. Les réservoirs naturels de Coxiella sont principalement les animaux d’élevage qui peuvent contaminer l’environnement en excrétant la bactérie principalement dans les produits de parturition, le mucus vaginal et les fèces. L’Homme s’infecte ensuite par inhalation de pseudo-spores disséminées dans l’environnement. La nature intracellulaire obligatoire de Coxiella a jusqu'ici sévèrement limité son étude et par conséquent, les facteurs de virulence bactériens impliqués dans le développement et la progression de l'infection restent encore largement inconnus. Coxiella se réplique à l'intérieur des cellules hôtes dans une grande vacuole présentant des caractéristiques autolysosomales. Le développement de la vacuole et la survie de Coxiella dans la cellule hôte sont dépendants de la translocation des effecteurs bactériens par un système de sécrétion de type 4 (SST4) Dot/Icm et de la manipulation de nombreuses voies de trafic et de signalisation de la cellule hôte par ces derniers. Notre équipe a généré et criblé la première banque de mutants par transposition de Coxiella, menant ainsi à l'identification d'un nombre important de potentiels déterminants de virulence et de protéines effectrices. Mon projet de thèse est basé sur la caractérisation de deux effecteurs de Coxiella, CvpF et AnkA, provenant de la banque de mutants générée par l’équipe. Les mutants de ces effecteurs présentent des phénotypes de défaut de réplication intracellulaire et de développement de vacuole. Ici, nous démontrons que l’effecteur CvpF est un substrat du système de sécrétion de type 4 Dot/Icm qui localise aux vacuoles contenant Coxiella (CCV). CvpF est également capable d'interagir avec Rab26, conduisant au recrutement du marqueur autophagosomal LC3B aux CCV. Les mutants de cvpF présentent un défaut de réplication in vitro et in vivo, suggérant que le détournement de l'autophagie par cet effecteur est crucial pour la virulence de Coxiella. Comme pour les mutants de cvpF, les mutants ankA présentent le même défaut de réplication in vitro et la protéine AnkA est un substrat du SST4. L'effecteur AnkA contient des motifs de répétition Ankyrin localisés sur son domaine N-terminal. La bactérie induit une hyperfusion des mitochondries de manière dépendante du SST4 et spécifique de l’effecteur AnkA. Nos résultats montrent que AnkA interagit avec Drp1, une protéine motrice impliquée dans la fission mitochondriale et que cette interaction ainsi que l’hyperfusion des mitochondries seraient dépendant du domaine contenant les répétitions Ankyrine. Le mécanisme par lequel AnkA agit sur Drp1 reste à déterminer. Cependant, les effets observés sur la mitochondrie suggèrent que la manipulation de l’organelle par la bactérie promeut le développement de la vacuole et la réplication intracellulaire du pathogène. En conclusion, notre recherche suggère fortement que de nombreux effecteurs de Coxiella manipulent les voies des cellules hôtes pour assurer le développement intracellulaire efficace de ce pathogène. / Intracellular pathogenic bacteria manipulate host cell functions by secreting virulence factors (known as effectors) into the cytoplasm of the infected cell. This process allows the pathogen to proliferate in an otherwise hostile environment. The identification and characterization of the specific effectors of the various pathogens is therefore of crucial importance to counteract bacterial infections. Coxiella burnetii is a Class 3 gram-negative pathogen that causes Q fever, a zoonosis that causes major epidemics with a high impact on the economy and health. The natural reservoirs of Coxiella are mainly farm animals that can contaminate the environment by excreting the bacteria mainly in parturition products, vaginal mucus and feces. Human is then infected by inhalation of pseudo-spores disseminated in the environment. The obligate intracellular nature of Coxiella has so far severely limited its study, and as result, bacterial virulence factors involved in the development and progression of infection remain largely unknown. Coxiella replicates within host cells in a large vacuole with autolysosomal characteristics. The development of vacuole and survival of Coxiella in the host cell depend on the translocation of bacterial effectors by the type 4 Dot / Icm secretion system (SST4B) and the manipulation of many trafficking and signaling pathways of the host cell. Our team has generated and screened the first library of Coxiella transposon mutants, leading to the identification of a significant number of candidate virulence determinants and effector proteins. My thesis project is based on the characterization of two effectors of Coxiella, CvpF and AnkA, from the mutant library generated by the team. Mutants of these effectors exhibit defect in intracellular replication and vacuole development phenotypes. Here, we demonstrate that the effector CvpF is a substrate of the SST4B that localizes to vacuoles containing Coxiella (CCV). CvpF is also able to interact with Rab26, leading to the recruitment of the LC3B autophagosomal marker to CCV. cvpF mutants exhibit in vitro and in vivo replication deficiencies, suggesting that diversion of autophagy by this effector is crucial for Coxiella virulence. As for cvpF mutants, ankA mutants show the same in vitro defect of replication and the protein AnkA is a substrate of the SST4. AnkA contains Ankyrin repetition patterns located on its N-terminal domain. The bacterium induces an AnkA-dependent hyperfusion of mitochondria. Our results show that AnkA interacts with Drp1, a motor protein involved in mitochondrial fission, and that this interaction as well as mitochondrial hyperfusion is dependent on the domain containing Ankyrin-repeat motifs. The mechanism by which AnkA acts on Drp1 remains to be determined. However, the observed effects on mitochondria suggest that the organelle's manipulation by the bacterium promotes the development of the vacuole and the intracellular replication of the pathogen. To conclude, our research strongly suggests that multiple Coxiella effectors manipulate host cell pathways to ensure the efficient intracellular development of this pathogen.

Le mildiou de la vigne, causé par le pathogène Plasmopara viticola, est une maladie cryptogamique pouvant causer de sérieux dégâts sur les récoltes. Pour éviter ces pertes, il est nécessaire de recourir à des produits phytosanitaires. Outre leur coût financier, les questions sur la santé des viticulteurs et des populations vivant à proximité des vignobles, ainsi que la protection de l’environnement ne peuvent être ignorées. Cependant, toutes les variétés de vigne ne présentent pas la même sensibilité au pathogène. En effet, bien qu’elles soient moins appréciées pour leurs qualités organoleptiques, les variétés américaines sont résistantes à cette maladie. Les combiner par croisement variétal avec des espèces européennes peut constituer une alternative viable aux traitements antifongiques. Cependant, pour piloter effacement ces problèmes de sélection variétal, il est nécessaire de mieux appréhender la relation « hôte-pathogène ». C’est dans ce but que l’analyse par spectrométrie de masse a été employée sous différents aspects / Downy mildew, caused by the Plasmopara viticola pathogen, is a fungal disease which can induce serious harvest damages. To avoid these losses, it is necessary to use phytosanitary treatments. In addition to their financial cost, winegrower’s health issues and the environment protection cannot be ignored. However, all grapevine varieties do not present the same sensitivity to the pathogen. Indeed, despite of poor organoleptic qualities, American varieties are resistant to this disease. Combining them with European species by varietal crossing may be a viable alternative to these treatments. However, to lead efficiently these cross breeding programs, it is necessary to know more about the relationship "host-pathogen". In this context, analysis by mass spectrometry has been used under different aspects

Legionella pneumophila est la bactérie responsable de la légionellose, une pneumonie atypique dans les pays industrialisés. Les souches pathogènes sont issues de notre environnement après multiplication à l’intérieur d’amibes, sont disséminées par la technologie humaine, puis peuvent infecter les macrophages alvéolaires humains. Ce travail vise à caractériser une famille d’effecteurs du système de sécrétion de type IV Dot/Icm transloqués dans le cytoplasme de la cellule hôte, des protéine kinases, et en particulier à établir le rôle de la protéine kinase LegK2 dans la virulence. L’analyse in silico et des tests de phosphorylation in vitro ont permis d’identifier 5 protéine kinases fonctionnelles, LegK1-LegK5, codées par la souche épidémique L. pneumophila Lens. Des tests de translocation ont montré qu’à l’exception de LegK5, les protéine kinases de Legionella sont transloquées dans la cellule hôte de façon Icm/Dot dépendante. LegK2 joue un rôle clé dans la virulence, comme démontré par inactivation de gène. Les vacuoles contenant le mutant legK2 présentent un recrutement moins efficace de reticulum endoplasmique, ce qui entraine une réplication intracellulaire retardée. Un mutant de substitution déficient pour l’activité kinase présente les mêmes défauts de virulence, ce qui démontre le rôle central de la phosphorylation dans le contrôle de ce processus. Les mécanismes moléculaires contrôlés par LegK2 sont actuellement recherchés par identification de partenaires et/ou substrats protéiques / Legionella pneumophila is the most common causative agent of the severe pneumony legionellosis. Legionella pathogenic strains are emerging from the environment after intracellular multiplication in amoeba, are dissiminated by water aerosols technologies, and are able to infect alveolar macrophages of human lungs. This work aims to characterize one family of effectors translocated into the host cytoplasm, namely the protein kinase family, and particularly the role of LegK2 protein kinase in virulence. In silico analysis and in vitro phosphorylation assays allowed the identification of 5 functional protein kinases LegK1-LegK5 encoded by the epidemic L. pneumophila Lens strain. Translocation assays showed that except LegK5, the Legionella protein kinases are translocated. LegK2 plays a key role in bacterial virulence, as demonstrated by gene inactivation. The legK2 mutant containing vacuoles display less efficient recruitment of endoplasmic reticulum markers, which results in delayed intracellular replication. A kinase-dead substitution mutant of legK2 exhibits the same virulence defects. Molecular mechanisms controled by LegK2 have been investigated by searching LegK2 partner and substrate proteins