Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La sélection des meilleurs candidats médicament se base sur des choix multiparamétriques réunissant l’efficacité potentielle, les caractéristiques ADME et le profil de sécurité des nouvelles entités chimiques. En ce sens, la prédiction précoce de la pharmacocinétique est élémentaire pour orienter les prises de décision et donner un cap pertinent aux projets. En raison de son rôle central dans le devenir des médicaments, la clairance métabolique médiée principalement par le foie est l’un des paramètres les plus importants. L’objectif de ce projet était d’améliorer la prédiction de la clairance en se concentrant notamment sur les molécules présentant une bonne stabilité métabolique et qui sont de ce fait encore difficiles à étudier. Les travaux menés dans cette thèse nous ont permis d’étoffer nos connaissances sur les modèles hépatiques in vitro et les méthodes d’extrapolation usuelles mais aussi de découvrir et de développer de nouvelles stratégies de prédiction. Nous nous sommes concentrés en profondeur sur la clairance métabolique et à tout ce qui impacte les prédictions. Le modèle de co-culture microorganisée (MPCC) HepatopacTM qui permet de stabiliser les hépatocytes humains sur plusieurs semaines a ainsi été identifié comme une alternative judicieuse aux modèles de routine lorsque les molécules ne peuvent pas être étudiées en culture 2D classique. L’étude de la fraction libre plasmatique et l’intégration de nouvelles hypothèses physiologiques telles que la théorie de « l’uptake facilité par l’albumine » ont également participé à améliorer les prédictions. Compte tenu des performances du modèle HepatopacTM, nous avons développé une approche innovante basée sur le spotting de précision afin de produire tous types de co-cultures microorganisées. Les co-cultures fabriquées grâce à cette technique démontrent que la méthode est robuste, accessible et simple à mettre en œuvre. Notre méthode de spotting a ensuite été utilisée pour faire évoluer le modèle MPCC et l’ouvrir à de nouvelles applications. / The selection of the best drug candidates is based on multiparametric choices combining the potential efficacy, ADME characteristics and the safety profile of the new chemical entities. In this sense, the early prediction of pharmacokinetic is essential to guide decision-making and provide a relevant course for projects. Because of its central role in drug disposition, metabolic clearance mediated primarily by the liver is one of the most important parameters. The objective of this project was to improve clearance prediction by focusing on low clearance compounds that are still difficult to study. This work allowed us to expand our knowledge on in vitro liver models and usual extrapolation methods but also to discover and develop new prediction strategies. We focused on metabolic clearance and all parameters that impact the predictions. Micropatterned co-cultures (MPCCs) of primary human hepatocytes (HepatopacTM), which stabilizes hepatocytes over several weeks, has been identified as a judicious alternative to routine models when the molecules cannot be studied in conventional monolayer culture. The study of plasma protein binding and the integration of new physiological hypothesis such as the "Albumin-Facilitated Uptake" also contributed to improve the predictions. Given the performance of the HepatopacTM model, we have developed an innovative approach using a digital dispensing system to spot collagen and produce all types of micropatterned co-cultures. Co-cultures manufactured by this technique demonstrate that the method is robust, accessible and easy to use. Our spotting method was used to evolve the MPCC model and explore new applications.

Lors de mes travaux de thèse je me suis intéressée à l’invasion des hépatocytes par Plasmodium. Bien que certains récepteurs cellulaires mis en jeu aient déjà été identifiés tels que CD81 et SR-B1, les facteurs parasitaires restaient à identifier. J’ai testé différents facteurs parasitaires grâce à un protocole de test d’invasion de cellules HepG2 et HepG2/CD81 par des parasites complémentés avec différentes protéines. Suite à l’identification de la protéine P36 comme déterminant du choix de la voie d’entrée dans les hépatocytes, j’ai étudié les déterminants structuraux de cette protéine nécessaires à la détermination de la voie d’entrée. Pour cela j’ai complémenté des parasites délétés pour P36 avec des protéines chimériques exprimant les domaines d’un parasite utilisant à la fois les récepteurs CD81 et SR-B1 et des domaines d’un parasites ne pouvant utiliser que la voie CD81. J’ai identifié le second domaine à 6 cystéine de P36 comme déterminant du choix de la voie d’invasion. Afin d’étudier les interactions de P36 avec d’éventuels récepteurs cellulaires, j’ai produit cette protéine en système bactérien. Les protéines ont été utilisées pour réaliser des tests d’interactions (ELISA et SPR) avec des récepteurs d’intérêt : CD81, SR-B1, CD36, LIMPII et EphA2 qui n’ont malheureusement pas permis d’identifier le ligand de P36. Des anticorps sont également en cours de production, dans le but d’une part de tester s’ils sont capables de bloquer l’invasion des hépatocytes par Plasmodium et d’autre part de localiser la protéine chez le parasite. Enfin, j’ai étudié les polymorphismes des protéines P36 de parasites infectant l’homme. / During my thesis, I was interested in the study of the hepatocyte invasion by Plasmodium. Several cellular receptors are involved, such as CD81 and SRB1, but the parasitic factors required were unknown until now. I tested different parasitic factors thanks to an invasion test of HepG2 or HepG2/CD81 cells with parasites complemented with different proteins. Following the identification of the 6 cystein protein P36 as a determinants of the entry pathway, I studied the structural determinants of this protein which are involved in the hepatocytes’ entry pathway. To this end, I complemented parasites knock-out for P36 with chimeric proteins constituted of domains of a parasite using both CD81 and SRB1, and domains from a parasite using only CD81. I showed that the second 6 cystein domain of P36 is decisive in the entry pathway choice.In order to study the P36 interactions with potential cellular receptors, I developed a production protocol of this protein in bacteria. I used the recombinant protein to test the interactions (ELISA and SPR) with potential receptors: CD81, SRB1, CD36, LIMP2, Epha2. Unfortunately, no interaction has been detected. Antibodies are in production, in order to test whether they are capable to block the hepatocyte invasion by Plasmodium. They will also be used to localize the protein in the parasite. In the end, I studied the polymorphisms of P36 in human parasites.

L'infection des hépatocytes par les sporozoïtes constitue une première étape obligatoire du cycle de Plasmodium chez l'hôte vertébré. Les mécanismes impliqués dans l'invasion des hépatocytes restent mal caractérisés. Nous avons découvert que CD81, une protéine transmembranaire appartenant à la famille des tétraspanines, est nécessaire à l'infection des hépatocytes par les sporozoïtes de Plasmodium falciparum, de Plasmodium yoelii, et dans certains cas de Plasmodium berghei. L'expression de CD81 suffit à rendre les cellules hépatocytaires HepG2 sensibles à l'infection par les sporozoïtes de P. yoelii mais pas P. falciparum, suggérant l'intervention d'autres molécules pour ce parasite. Une caractéristique majeure des tétraspanines est leur capacité de s'associer entre elles et avec d'autres molécules de surface pour former des microdomaines membranaires distincts des radeaux lipidiques classiques (« rafts »). Nos résultats montrent que le cholestérol membranaire contribue non seulement à la localisation de CD81 dans les microdomaines enrichis en tétraspanines mais aussi à l'infection par les sporozoïtes de Plasmodium lorsqu'elle implique une voie dépendante de CD81. Nous n'avons pas pu mettre en évidence d'interaction directe entre CD81 et les sporozoïtes, ce qui suggère que CD81 pourrait ne pas jouer un rôle de récepteur pour le parasite mais intervenir de manière indirecte. EWI-F et EWI-2, deux protéines transmembranaires associées à CD81 dans les hépatocytes, ne sont pas directement impliquées dans l'infection par les sporozoïtes. Au contraire, EWI-F a un effet inhibiteur sur l'infection, peut-être lié à une réorganisation des microdomaines à tétraspanines ou à une compétition avec un autre partenaire de CD81. Une autre molécule associée à CD81 pourrait donc jouer un rôle essentiel dans l'infection par les sporozoïtes, éventuellement comme récepteur, mais sa nature reste à déterminer.

Aujourd'hui, la transplantation est le seul traitement efficace proposé aux patients souffrant d'une insuffisance hépatique aiguë ou fulminante. La pénurie actuelle de greffons se traduit par un taux de mortalité élevé chez les patients en attente urgente d'un organe. La nécessité de disposer d'un système de suppléance hépatique transitoire apparaît donc primordiale. Un organe bioartificiel exploitant les performances potentielles de cellules (hépatocytes dans le cas d'un foie bioartificiel) permettrait de suppléer le large éventail de ses fonctions métaboliques. Notre équipe propose le concept d'un bioréacteur à lit fluidisé contenant des hépatocytes, issus de la lignée cellulaire humaine C3a, immobilisés dans des billes d'alginate. Dans ce travail l'objectif a été d'analyser le fonctionnement du système de suppléance hépatique extracorporel par la mise en place d'un modèle in vitro se rapprochant au mieux de la situation in vivo. La présence de cellules au sein des billes d'alginate n'a pas d'influence sur le comportement global du lit fluidisé alors que l'emploi de plasma, de masse volumique proche des billes, peut engendrer une instabilité. Ensuite, l'organisation, la viabilité et les fonctionnalités (synthèse d'albumine, production d'urée et capacité d'élimination de l'ammoniac) des hépatocytes à l'intérieur des billes d'alginate ont été étudiés en conditions statiques et dynamiques. Dans le bioréacteur, les hépatocytes gardent leurs pleines potentialités. Pour l'urée, l'encapsulation semble améliorer le métabolisme. Il apparaît que la sortie de l'albumine des billes est améliorée par la fluidisation. Enfin, nous avons montré que les contraintes dans le bioréacteur ne provoque qu'une faible altération des propriétés mécaniques des billes après 6 heures d'utilisation. Au vu des fonctions métaboliques assumées par les hépatocytes C3a encapsulés dans des billes d'alginate, l'emploi de ce dispositif en vue d'une suppléance hépatique pourra être envisagé.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Peu de données sont disponibles sur le devenir à long terme après un choc septique. De plus le foie, organe clé dans la réponse de l’hôte à l’agression pourrait jouer un rôle important concernant le devenir à long terme. Dans une cohorte de patients chirurgicaux en choc septique, nous avons observé une mortalité élevée à 6 mois et une altération de la qualité de vie parmi les survivants par rapport à la population générale. Toutefois, celle-ci tend à s’améliorer au cours du temps. Dans un second travail, nous avons observé que la dysfonction hépatique précoce évaluée par le score SOFA dans les 24 heures qui suivait l’introduction des vasopresseurs n’avait pas d’impact sur la mortalité et la qualité de vie à long terme dans une cohorte multicentrique de patients médico-chirurgicaux en choc septique. Au contraire, l’apparition secondaire ou l’aggravation d’une dysfonction hépatique était associée à une surmortalité jusque 6 mois après l’épisode de choc septique. Afin d’approfondir par une approche expérimentale les mécanismes impliqués dans la dysfonction septique hépatique, nous avons mis au point un modèle in vitro de co-cultures hépatocytes-macrophages soumis au LPS. A partir de ce modèle, nous avons montré qu’une catécholamine telle que l’adrénaline, jouait un rôle dans la pérennisation d’une inflammation péri hépatique locale par un mécanisme AMPc dépendant mais epac/PKa indépendant. / Knowledge regarding long-term outcome after septic shock is limited. Additionally, the liver, which plays a key role during the septic illness, could significantly impact the long term outcome. First, in a surgical cohort of septic shock patients, we found that the 6-month mortality rate remained high. Baseline health-related quality of life (HRQOL) was found to be lower than in the general population and although HRQOL improved 6 months after the onset of septic shock, HRQOL remained lower than in the general population. In a second work including a large multicenter cohort of septic patients, we found a significant relationship between the occurrence or the worsening of liver dysfunction during the course of septic shock and mortality at 6 months; however, this relationship was not found in the patients with baseline liver dysfunction. At last, experimentally, we established a hepatocyte-macrophage co-culture model and septic shock was mimicked by lipopolysaccharide (LPS) treatment. We found that a catecholamine frequently used in septic shock such as epinephrine was able to shift the innate immune response toward a pro-inflammatory environment even when a low anti-inflammatory response was observed in macrophages and these effects were cAMP dependent but PKA/epac independent.

Les objectifs de cette thèse sont de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu lors de la co-exposition de cellules hépatiques à l'éthanol, un toxique alimentaire, et au benzo[a]pyrène (B[a]P), un important contaminant de l’environnement émis lors de combustions incomplètes. L’exposition d’hépatocytes primaires de rat pendant 8h favorise leur collaboration via l’induction d’une déplétion membranaire en cholestérol par le B[a]P, ce qui facilite l’action de l’éthanol à déstabiliser les lysosomes via la phospholipase C-1 pour entraîner la mort par apoptose. Lors d’une exposition répétée sur 96h dans les cellules WIF-B9, celles-ci provoquent une mort précoce par nécrose suivie d’une apoptose tardive via leurs métabolismes. Leur toxicité impliquerait un remodelage membranaire et un stress oxydant avec la production d’espèces réactives de l’oxygène et la variation de l’homéostasie du fer. / The aim of this work is to determine cellular and molecular mechanisms implicated in the co-exposure to ethanol, a dietary toxic substance, and benzo[a]pyrene (B[a]P), a major environmental contaminant, found during incomplete combustions. Primary rat hepatocytes exposed during 8h showed a cooperation effect between the two molecules through the depletion of membrane cholesterol by B[a]P, which promote ethanol action to destabilize lysosomes through phospholipase C-1 and facilitate apoptosis cell death. After repeated exposure during 96h of WIF-B9 cells, these two molecules provoke an early cell death by necrosis and a late apoptosis through their metabolisms. Their toxic effects implicate membrane remodeling and oxidative stress with reactive oxygen species production and modifications in iron pool.

Les sporozoïtes de Plasmodium sont injectés par un moustique Anophèle et infectent le foie où le parasite se développe avant l’initiation d'une phase symptomatique érythrocytaire. Le sporozoïte pénètre activement les hépatocytes en formant une vacuole parasitophore où il se multiplie. Des facteurs parasitaires et de l’hôte sont impliqués dans l’invasion des hépatocytes mais les mécanismes restent méconnus. Pour faciliter l’étude de l’infection, nous avons généré des parasites fluorescents grâce à une nouvelle stratégie GOMO. L’utilisation des parasites P. yoelii fluorescents et d’un modèle cellulaire de lignées permissives ou non à l’infection, nous a permis de caractériser les mécanismes moléculaires et les cinétiques d’invasion. Nous avons montré que l’invasion productive est précédée d’une phase de traversée cellulaire où le parasite forme des vacuoles transitoires, distinctes des vacuoles parasitophores. Le parasite se sert d’une perforine PLP1 pour sortir de cette vacuole transitoire et échapper à la dégradation par les lysosomes de la cellule. Nous avons étudié le rôle de différents facteurs de l’hôte lors de l’invasion productive, selon les espèces plasmodiales. Si CD81 est nécessaire pour l’infection par P. falciparum et P. yoelii, les parasites P. berghei et P. vivax peuvent infecter des cellules n’exprimant pas cette protéine. Nous avons identifié deux protéines de la superfamille CD36, SR-BI et CD36, qui jouent un rôle lors de l’invasion CD81-indépendante. Ces résultats contribuent à l’élucidation des mécanismes d’entrée du parasite dans le foie et orientent vers la découverte des ligands parasitaires impliqués qui pourront être des cibles vaccinales. / Plasmodium sporozoites are transmitted by Anopheles mosquitoes and first infect the liver where the parasite replicates as a pre-requisite to the development of the pathogenic blood stage infection. Sporozoites infect hepatocytes by forming a parasitophorous vacuole differentiating into liver stages. Invasion involves parasite and host proteins but the underlying mechanisms remain unknown. To facilitate monitoring of sporozoite invasion, we generated novel transgenic fluorescent parasites, using a new selection strategy termed GOMO (Gene Out Marker Out). Using fluorescent P. yoelii strains and a robust cellular system we further characterized the temporal and molecular mechanisms of sporozoite invasion. We document that sporozoite productive invasion is preceded by a phase of cell traversal, and show that during cell traversal sporozoites enter transient vacuoles, which are distinct from parasitophorous vacuoles. We also uncovered that the perforin-like protein mediates sporozoite egress from transient vacuoles and escape from degradation by the host cell lysosomes. We studied the role of host factors implicated during the productive invasion of rodent and human Plasmodium species. We knew that P. falciparum and P. yoelii sporozoites require CD81 for infection and that P. berghei and P. vivax can infect cells lacking CD81. We identified two members of CD36 superfamily, SR-BI and CD36, as host entry factors defining a CD81-independent entry route. These results pave the way toward the elucidation of the mechanisms of sporozoite invasion and the identification of parasite ligands that mediate host cell entry, which would constitute potential targets for a malaria vaccine.