Plus de 150 années de recherches sur les Microsporidies ont conduit à une connaissance relativement basique de divers aspect de leur biologie. Malgré cela, peut d’informations existent concernant la génétique et les mécanismes moléculaire des interactions hôte-pathogène qui gouvernent les infections aux Microsporidies.Dans un premier temps, je décris comment détecter, traiter et éradiquer les infections microsporidiales avec Tubulinosema ratisbonensis dans des lignées de Drosophila melanogaster. Jusqu’à présent, les connaissances concernant les défenses de l’hôte chez la drosophile contre les parasites intracellulaire obligatoires restent incomplète due au manque d’un bon modèle d’infection. De ce fait, j’ai développé des modèles d’infection de D. melanogaster par la microsporidie T.ratisbonensis, à la fois en culture cellulaire et drosophiles adultes. Mes travaux sur le modèle d’infection cellulaire englobent des approchent en transcriptomique et métabolomique qui analysent les deux cotées de cette relation hôte-pathogène. En fin, je présente les fonctions biologiques des glycosylphosphatidyl inositoles de Toxoplasma gondii. / More than 150 years of Microsporidia research led to a basic understanding of many aspects of microsporidial biology, yet little is known about the genetic basis and molecular mechanisms of the intimate host-parasite relationship that govern Microsporidia infections.Here, I first report on the detection, prophylaxis, and eradication measures against microsporidial infestations with Tubulinosema ratisbonensis, infecting cultures of Drosophila melanogaster. To date,knowledge about Drosophila host defense against obligate intracellular parasites remained incomplete for lack of good infection models.To this end, I have developed infection models of Drosophila by the microsporidian T. ratisbonensis,both in cell lines and in adults. The work on the cellular infection model encompasses transcriptomics and metabolomics approaches, which aim to attempt both sides of the host-pathogen equation. Finally, I report on the biological roles of glycosylphosphatidyl inositols of Toxoplasma gondii.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most important pathogen in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it exist. It was recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. The objectives of this project were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae, and (ii) to characterize the active molecules present in the culture supernatant. Proteomic analyses were first conducted and demonstrated the culture supernatant ability to induce modulations of the cell cycle regulation. In order to determine the SJPL cell cycle, flow cytometry analyses were performed and demonstrated that the culture supernatant induced a G2/M-phase cell cycle arrest. Two G2/M-phase cell cycle inhibitors were then used and their ability to inhibit PRRSV infection in SJPL cells was demonstrated. Finally, in order to characterize the active molecules present in the A. pleuropneumoniae culture supernatant, mass spectrometry was used and two molecules were identified. This is the first study demonstrating the A. pleuropneumoniae ability to disrupt cell cycle and the cell cycle importance to the inhibitory activity against PRRSV.

Mycoplasma hominis est une bactérie opportuniste qui peut être responsable d’infections du tractus urogénital, d’infections néonatales ou d’infections disséminées notamment chez les patients immunodéprimés. La membrane des mycoplasmes constitue l’interface d’interaction directe avec le milieu extérieur en raison de l’absence de paroi. Cette membrane contient de nombreuses lipoprotéines qui ont le pouvoir d’activer des cellules dendritiques humaines (hDCs), d’induire la production de cytokines et de polariser le système immunitaire adaptatif. Nous avons étudié l’interaction de M. hominis PG21 avec les hDCs en nous penchant d’une part sur la fraction du mycoplasme qui active les hDCs et d’autre part sur la réponse immunitaire innée des hDCs. Apres avoir déterminé les lipoprotéines contenues dans un extrait TX-114 de M. hominis PG21, nous avons enrichi en lipoprotéines bioactives une fraction de vésicules membranaires du mycoplasme par une double extraction utilisant deux détergents non dénaturants, le Sarkosyl puis le Triton X-114. Apres séparation par SDS-PAGE, nous avons identifié vingt lipoprotéines qui pourraient entrainer la sécrétion d’IL-23 par les hDCs, notamment la lipoprotéine MHO_4720. Un lipopeptide synthétique correspondant à la fraction N-terminale de MHO_4720 est capable de stimuler les hDCs. En analysant les variations transcriptionnelles des gènes codant pour les 48 lipoprotéines de M. hominis PG21 par qRT-PCR, nous avons également déterminé que 21 lipoprotéines sont surexprimées après 4h ou 24h de contact entre le mycoplasme et les hDCs. Enfin, la réponse cellulaire a été évaluée par PCR array et ELISA. Nous avons observé l’activation d’inflammasome(s) par la mise en évidence de la production d’IL-1β dépendant de la caspase 5. / Mycoplasma hominis is involved in urogenital tract infections, neonatal infections or disseminated infections particularly in immunocompromised patients. Mycoplasmas have no cell wall and their membrane is the main interface mediating the interaction between the mycoplasma and its environment. Lipoproteins that are anchored to the extracellular side of the plasma membrane are known to induce the maturation of human dendritic cells (hDCs), to stimulate the pro-inflammatory cytokine production by hDCs and to polarize the adaptive immune system. We studied the interaction of M. hominis PG21 with hDCs in order to assess the lipoproteins that can induce the stimulation of hDCs, to determine the lipoproteins that are regulated upon interaction of the mycoplasma with the host cell and to evaluate the innate host cell response. Using a double extraction strategy with two non-denaturing detergents, Sarkosyl then Triton X-114, and separation by SDS-PAGE, we found that 20 lipoproteins may induce the secretion of IL-23 by the hDCs, especially the MHO_4720 lipoprotein. We showed that a synthetic lipopeptide corresponding to the N-terminus part of the MHO_4720 lipoprotein can stimulate the hDCs in a dose-dependent manner. Using qRT-PCR for the evaluation of the transcriptional regulation of the 48 lipoprotein-coding genes of M. hominis PG21, we also determined that 21 lipoproteins were upregulated upon 4h and 24h of contact of M. hominis with hDCs. Finally, the hDC innate immune response was evaluated by PCR array and ELISA. We observed a caspase 5-dependent production of IL- 1β corresponding to the activation of an inflammasome.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire responsable de la toxoplasmose. Lors de l’infection aiguë, le parasite se divise dans une vacuole parasitophore (VP), compartiment d’interactions avec la cellule hôte. La VP se modifie pour former un kyste qui persiste au cours de la phase chronique. Le rôle des protéines de granules denses (GRA) dans ce processus est suggéré par leur abondance dans la VP et la paroi kystique. Par des approches de génétique inverse et de protéomique, le but de ce travail visait à préciser au plan moléculaire, le rôle de la protéine GRA5. En utilisant un modèle de différenciation parasitaire in vitro, l’étude des phénotypes d’un mutant invalidé du gène gra5 a permis de découvrir son rôle clé dans la formation des kystes par le maintien 1/ de l’intégrité de la membrane délimitant la VP en cours de différenciation, 2/ de l’accumulation d’autres composants parasitaires dans la VP et 3/ de son interaction avec le reticulum endoplasmique de l’hôte. / Toxoplasmosis, which is caused by the intracellular parasite Toxoplasma gondii is characterized by a life-long chronic infection. The parasites replicate inside a parasitophorous vacuole (PV), which evolves into a persistent cyst. The molecular mechanisms governing the differentiation process are poorly characterized. It is known that the dense granules proteins (GRA) are major components of both the PV and the cyst wall, enabling their interaction with the host cells. Using a Prugniaud cystogenic type II strain in which the gra5 gene was invalidated and a combination of cellular and proteomic approaches, we discovered that GRA5 regulates i) the molecular content of the PV, ii) the PV interaction with the host endoplasmic reticulum and iii) host cell homeostasis,that is necessary to ensure the formation of a stable cyst wall.

Legionella pneumophila est une bactérie aquatique qui prolifère en se répliquant à l’intérieur de cellules amibiennes. Elle peut persister dans ces environnements en vivant en communauté sous forme de biofilms. L’inhalation par l’Homme d’eau contaminée, vaporisée par les réseaux d’eau chaude ou les tours aéro‐réfrigérantes, peut mener à l’infection des macrophages pulmonaires qui se traduit par une grave pneumonie appelée légionellose. Le di‐GMP cyclique (diGMPc) est impliqué, chez diverses espèces bactériennes, dans la transition entre les modes de vie mobiles et sessiles, et chez certains pathogènes, dans la régulation de la virulence. Mon travail de thèse vise à démontrer l’implication des voies de signalisation à diGMPc dans le contrôle de la virulence et de la formation de biofilms par L. pneumophila. Cette implication a été étudiée grâce à l’inactivation systématique de chacun des gènes codant les protéines du métabolisme du diGMPc chez la souche L. pneumophila Lens. Notre étude a révélé que trois de ces protéines, Lpl0780, Lpl0922 et Lpl1118, sont spécifiquement requises pour le contrôle de la virulence et, plus particulièrement, pour la survie précoce lors de l’infection de cellules‐hôtes via l’orchestration de la sécrétion de facteurs de virulence dans la cellule‐hôte. Lpl1118 participerait également à la biogénèse de la vacuole de réplication. Cinq autres de ces protéines sont impliquées dans la régulation de la formation et de l’architecture des biofilms. L’une d’elles est, plus particulièrement, requise pour la formation de biofilms en présence d’oxyde nitrique. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’organisation complexe et spécifique des voies de signalisation à diGMPc chez L. pneumophila et pourraient permettre d’envisager une lutte plus efficace contre ce pathogène / Legionella pneumophila is a bacterium that proliferates in fresh water environments through the replication within amoebas. These bacteria can persist in these environments through biofilm formation. The inhalation of aerosolized contaminated water through hot water systems or cooling towers can induce the infection of human lungs, leading to a severe pneumonia called legionellosis. Cyclic di‐GMP (c‐di‐GMP) in involved, in various bacterial species, in the motility‐to‐sessility transition, and in some pathogens, in virulence control. My work aims to demonstrate the involvement of signaling pathways that use c‐di‐GMP in virulence control and biofilm formation of L. pneumophila. This involvement was investigated by systematically inactivating each gene encoding a c‐di‐GMP‐metabolizing enzyme in L. pneumophila Lens strain. Our work revealed that 3 of these proteins, Lpl0780, Lpl0922 and Lpl1118 are specifically involved in virulence control and, particularly, in the early survival during host cell infection through the orchestration of virulence factors secretion within host cell. Lpl1118 is particularly required for replicative vacuole biogenesis. Five other proteins, participate in the formation and architecture of biofilms. One of them is more specifically involved in biofilm formation in the presence of nitric oxide. These results help to better understand the complexity and the specificity of c‐di‐GMP signaling pathways in L. pneumophila and should allow the exploration of more effective ways to fight this pathogen

La leptospirose est une zoonose causée par les bactéries du genre Leptospira. Elle touche près de 1 million d'individus par an dans le monde entier et sévit à l'état endémique dans les pays au climat tropical tel que La Réunion. Les manifestations habituelles sont variables d'un individu à l'autre et englobent une simple fièvre jusqu'aux défaillances poly-viscérales avec mortalité dans 5 à 10% des cas. Sa physiopathologie est encore mal comprise, en particulier la part que joue une réponse immunitaire inappropriée dans la genèse des manifestations graves qui surviennent en quelques heures, et avant la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative propre à éliminer le microorganisme. Si l'échappement de la bactérie au système du complément est bien documenté, le rôle des acteurs cellulaires du système immunitaire inné reste à étayer. Notre étude avait donc pour objectif d'explorer l'immunopathologie de la leptospirose humaine dans la phase initiale de l’infection. Notre méthodologie s'est appuyée principalement sur des analyses quantitatives et qualitatives des acteurs cellulaires du système immunitaire inné à partir de prélèvements sanguins en phase précoce de la maladie, et comparaison avec la phase de convalescence et des sujets contrôles. Dans un premier temps nous avons montré qu'une population particulière de lymphocytes T impliquée dans la réponse immune innée, les lymphocytes Tγδ, avaient un taux abaissé et que cette baisse était corrélée à la charge bactérienne ainsi qu'à l’intensité de l'atteinte hépatique classiquement retrouvée lors de la leptospirose. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les polynucléaires neutrophiles circulants dont le taux augmente d’autant plus que la maladie est sévère, mais sans pour autant présenter de modification de certains marqueurs d’activation ou de recrutement tissulaire (CD15, CD11b, CD182). Une des principales chimiokines des neutrophiles, l'interleukine 8, était à taux peu élevés. Les derniers travaux concernent les principales formes solubles issues des molécules membranaires impliquées dans le processus de recrutement/diapédèse leucocytaire. Nous retrouvons de manière isolée une forte élévation des formes solubles d'E-sélectine et ICAM-1 qui sont notamment exprimées par les cellules endothéliales. Ces augmentations n'étaient pas corrélées aux marqueurs de gravité de la maladie. La signification biologique de cette élévation n’est pas encore connue lors de la leptospirose. L'ensemble de nos données permet d’apporter des informations nouvelles sur des acteurs du système immunitaire inné présents dans le compartiment vasculaire lors de la leptospirose humaine. Cette réponse immunitaire semble inadaptée pour permettre une clairance du pathogène au stade de dissémination hématogène. / Leptospirosis is a bacterial zoonosis caused by Leptospira and affecting 1 million people each year worldwide and mainly in tropical areas such as Reunion Island. Usual presentations encompass flu-like syndrome to multiorgan failure with mortality rate between 5 to 10%. To date, pathophysiology in humans is poorly understood, notably the capacity of innateimmunity to mount a robust response to clear pathogen or to induce tissue damages and contributing to disease severity. Our study aimed at assessing the role of innate immune cells and molecules within the first days of leptospiral infection.Using blood samples, we performed quantitative and qualitative assessment of circulating innate immune cells from leptospirosis cases and healthy controls. The first study explored the levels of gamma-delta T-cells (γδT-cells), a subset of unconventional T cells with innate immune functions. Gamma-delta T cells were found deeply decreased and levels wereinversely correlated to bacterial burden and liver damage. The second study focused on membrane bound receptors indicative of activation and tissue migration ability of neutrophil polymorphonuclear cells: CD15, CD11b, and CD182. Although neutrophil rates were high in leptospirosis cases, the levels of studied receptors were either lower (CD15) or identical to healthy controls (CD11b, CD182). In addition, only low levels of interleukin-8, a key chemokine for neutrophils, was detected in patients. Lastly, we ascertained the plasmatic levels of several shed cell adhesion molecules notably expressed by endothelial cells. The levels of soluble E-selectin and ICAM-1 were significantly increased compared to controls, while P-selectin level was lower. We did not find any correlation with disease severity or organ failure. This finding indicates that endothelial cell may be activated but further experiments are warranted to explain the functional impact of our findings. Altogether, our results add to the field of knowledge of leptospirosis pathophysiology, and in particular the implication of key innate immune cells at the stage of plasmatic bacterial dissemination. Our findings will support the view that there is an inappropriate immune response to Leptospira.

Legionella pneumophila est une bactérie opportuniste qui émerge de l'environnement après multiplication dans des amibes et peut infecter accidentellement les macrophages alvéolaires humains, provoquant une pneumonie sévère, la légionellose. La capacité de L. pneumophila à survivre dans ses cellules hôtes est strictement dépendante du système de sécrétion de type 4 Dot/Icm, qui sécrète un large répertoire d'effecteurs dans le cytosol de l'hôte. Identifier la contribution individuelle de chaque protéine bactérienne sécrétée par le système Dot/Icm, dans le cycle infectieux de L. pneumophila reste un enjeu majeur pour comprendre les bases moléculaires de la virulence des légionelles. Mes travaux de thèse participent à cet objectif en caractérisant la voie cellulaire ciblée par la protéine kinase LegK2. Des tests d'interaction et de phosphorylation ont identifié le complexe nucléateur d'actine ARP2/3 comme cible de LegK2. Suite à l'adressage de LegK2 à la surface de la vacuole après sa translocation dans le cytosol de l'hôte, l'interaction LegK2-ARP2/3 inhibe la polymérisation d'actine sur le phagosome. Cette inhibition permet à Legionella de diminuer le trafic des endosomes tardifs et/ou des lysosomes vers le phagosome et favorise ainsi l'évasion du phagosome à la voie de dégradation endocytique. L'interaction LegK2-ARP2/3 met en évidence un mécanisme original de virulence dans lequel le remodelage local du cytosquelette d'actine de la cellule hôte permet à la bactérie de manipuler le trafic vésiculaire pour échapper aux défenses de l'hôte / Legionella pneumophila is an opportunistic bacterium that emerges from the environment after multiplication in protozoans and can accidentally infect human alveolar macrophages leading to a severe pneumonia, the legionellosis. The L. pneumophila ability to survive within host-cells is strictly dependent on the Dot/Icm Type 4 Secretion System that translocates a large repertoire of effectors into the host cell cytosol. Deciphering the individual contribution of each bacterial protein translocated by the Dot/Icm system in the L. pneumophila infectious cycle remains a major challenge to understand the molecular basis of Legionella virulence. My works contribute to this objective by characterizing the cellular pathway targeted by the protein kinase LegK2. Interaction and phosphorylation assays identified the actin nucleator ARP2/3 complex as the target of LegK2. Following the LegK2 addressing to the vacuole surface after its translocation into host cytosol, LegK2- ARP2/3 interplay inhibits the actin polymerization on the phagosome. This inhibition allows Legionella to decrease the late endosome/lysosome trafficking towards the phagosome and promotes the phagosome evasion from endocytic degradation pathway. LegK2-ARP2/3 interplay highlights an original mechanism of virulence wherein the local actin cytoskeleton remodeling of host cell allows bacteria to hijack the vesicles trafficking in order to escape host-cell defenses

Le champignon Fusarium graminearum est l'un des principaux agents responsables de la fusariose des épis, une maladie nécrosante des céréales associée à une contamination des grains et des aliments par des mycotoxines. De récentes observations suggèrent une évolution de l’agressivité des populations de ce pathogène, questionnant l’efficacité et la durabilité des moyens de luttes actuels. Mieux anticiper cette évolution nécessite une meilleure caractérisation de la diversité phénotypique et génotypique existante entre souches. Six nouveaux génomes de F. graminearum ont été séquencés et ont permis l’identification et la caractérisation de 243 000 variations génétiques. La majorité de ces variants (77%) est concentrée dans des îlots de polymorphisme, représentant 32% du génome et enrichis en probables effecteurs liés à la pathogénicité de F. graminearum. La construction d’une population recombinante, et son génotypage avec 1 300 marqueurs moléculaires, ont permis le développement de la première carte génétique à haute-densité de l’espèce. La corrélation entre le taux de recombinaison et le polymorphisme a mis en évidence une organisation « à deux-vitesses » du génome de cette espèce. Finalement, l’intégration de ces données dans une approche de génétique quantitative a permis l’identification d’un locus polymorphe, affectant le gène FgVeA, et responsable de 90% de la variation d’agressivité et de la production de mycotoxine observée. Les différents résultats obtenus durant ces travaux font l’objet d’une discussion générale sur le potentiel adaptatif et d’évolution de ce pathogène. / F. graminearum is one of the main causal agents of the fusarium head-blight (FHB), a cereal disease leading to head necrosis, in addition to grain and food/feed contamination by stable and toxic metabolites. Recent observations refer to an increase of pathogenicity, questioning efficiency and durability of current management practices. In order to anticipate this evolution, we must bring a deeper characterization of the currently existing diversity. Six new genomes of F. graminearum were sequenced, and 243,000 genetic variations have been identified and characterized. Seventy seven percent of the total number of the variants was located within 32% of the genome, delineating highly polymorphic islands. These islands are enriched with probable effectors linked to Fusarium’s pathogenicity. The construction and the genotyping on 1,300 molecular markers of a recombinant population have enabled the development of the first high-density genetic map of the species. The remarkable correlation between polymorphism and recombination rate highlighted the 'two-speed' genome organization of this pathogen. Finally, the integration of these data through a quantitative genetic approach allowed the discovery of one quantitative trait locus, likely to affect the gene FgVeA, and responsible for 90% of the observed variation of aggressiveness and mycotoxin production. These results are discussed in the light of F. graminearum’s adaptive potential and evolution.

De nombreuses bacteries pathogènes sont capables d'affecter les programmes transcriptionnels de la cellule hôte pendant l'infection. Cependant, les mécanismes contrôlant ce processus restent largement méconnus. En investigant les effets de la Listerai monocytogenes sur les modifications des histones de l'hôte, nous avons mis en évidence un nouveau mecanisme de régulation de transcription nécessaire pour la répression de certains gènes, pendant l'infection. Lors de l'infection par L. monocytogenes, le facteur de virulence sécrété, InlB, se lie au récepteur c-Met et active la signalisation par les intermédiaires PI3K et Akt. cette plateforme de signalisation est nécessaire pour la relocalisation de la deacetylase d'histone, SIRT2, au noyau et l'association à la chromatine.En caractérisant me mécanisme gouvernant la relocalisation nucléaire de SIRT2 lors de l'infection, nous avons démontrés que SIRT2 subit une modification post-traductionnelle. SIRT2 est déphosphorylée à un nouveau site de phosphorylation localisé à la partie terminale de la protéine. SIRT2 est recrutée au site de démarrage de la transcription des gènes réprimés lors de l'infection menant à la deacetylation de H3K18 et la répression transcriptionnelle. Nous avons mis en évidence que SIRT2 est détournée par L. monocytogenes et provoque une croissance des bactéries intracellulaires. Ces résultats démontrent un clef de SIRT2 en provoquant la deacetylation de H3K18 mors de l'infection et dévoilent un nouveau mécanisme imposée par les bactéries pathogènes dans le but de reprogrammer la cellule hôte. / Bacterial pathogens dramatically affect host cell transcription programs for their own profit, however the underlying mechanism in most cases remain elusive. While investigating the effects of listeria monocytogenes on histone modifications, we discovered a new transcription regulatory machanism by which the expression of genes is repressed, during infection. Upon infection by L. monocytogenes, the secret virulence factor, InlB, binds the c-Met receptor and activates signaling through PI3K/Akt. This signaling platform is necessary for causing the relocalization of the histone deacetylase, SIRT2, to the nucleus and associating to chromatin.In characterizing the mechanism governing SIRT2 nuclear relocazing during infection, our results have demonstrated that SIRT2 undergoes a post-translational modification. SIRT2 undergoes dephosphorylation at a novel N-terminal phospho-site. SIRT2 is recruiter to the transcription star sites of genes repressed during inection leading to H3K18 deacetylation and transcriptional repression.finnaly, my results demonstrate that SIRT2 is hijacked by L monocytogenes and promotes an increase in intracellular bacteria. Together, these data uncover a key role for SIRT2 mediated H3K18 deacetylation during infection and characterize a novel mechanisme imposed by a pathogenic bacteriomto reprogram the host cell.