L'activation constitutive de la voie RAS/RAF/MEK/ERK est observée dans environ 65% des mélanomes cutanés. Des mutations dans les gènes NRAS et BRAF sont présentes dans les cellules ˆ l'origine du mélanome qui partagent des similitudes avec les cellules souches mélanocytaires (MSCs). Alors que la voie RAF/MEK/ERK fait l’objet de nombreuses études dans le mélanome, peu de choses sont connues sur son rôle dans le développement du lignage mélanocytaire.Nous avons généré des souris invalidées pour les gènes raf spécifiquement dans le lignage mélanocytaire. Ces animaux n'ont pas de défaut de pigmentation ˆ la naissance, indiquant que B-RAF et C-RAF ne sont pas nécessaires pour la mise en place de ce lignage. En revanche, à partir de la première mue, les animaux mutés développent un phénotype de « hair graying », caractérisé par le remplacement des poils noirs par des poils blancs. Ce phénotype résulte de la disparition des MSCs des follicules pileux, indiquant un rôle des protéines RAF dans leur auto-renouvellement.Afin d’identifier les mécanismes impliqués dans le contrôle de l’auto-renouvellement des MSCs par la voie RAF/MEK/ERK, nous avons réalisé une étude transcriptomique. Celle-ci a mis en évidence une diminution chez les souris mutées de la transcription du gène c-met, codant pour un récepteur tyrosine kinase activant la voie RAF/MEK/ERK. Nous avons montré que la prolifération des MSCs était dépendante du ligand du récepteur c-MET (HGF). A l'inverse, le traitement des MSCs contrôles avec un inhibiteur de c-MET provoque leur mort. Ces données suggèrent que c-met est une cible transcriptionnelle de la voie RAF/MEK/ERK jouant un rôle primordial dans l’homéostasie des MSCs. / The constitutive activation of the RAS/RAF/MEK/ERK signaling pathway is observed in about 65% of cutaneous melanoma. NRAS and BRAF mutations are found in cells of origin of melanoma which have common characteristics with melanocyte stem cells (MSCs). Despite the large number of study about the role of the RAF/MEK/ERK in melanoma, little is known about its role in the melanocyte lineage in vivo. We generated mice deleted for B-raf and C-raf genes specifically in the melanocyte lineage. These animals displayed normal pigmentation at birth, revealing that raf genes are not required for the development of the melanocyte lineage. However, following the first hair molting, the double knockout animals unveiled a hair graying phenotype, which is characterized by the substitution of black hairs by white ones. This phenotype is the consequence of the depletion of the hair follicles in melanocyte stem cells (MSCs). Therefore, RAF proteins play a key role in the MSCs self-renewal process. We performed a transcriptomic analysis in order to identify target genes of the RAF/MEK/ERK signaling pathway which might be involved in MSCs self-renewal regulation. This analysis showed a downregulation of the transcription of the c-met gene in MSCs from animals lacking raf genes. The c-met gene encodes a tyrosine kinase receptor which is responsible for the RAF/MEK/ERK signaling pathway activation. We demonstrated that MSCs proliferation is controlled via c-MET receptor activation by its ligand HGF. Moreover, MSCs wild-type treated with a c-MET inhibitor are unable to survive in vitro. Taken together, our results show that RAF and MET kinases are required for proper MSCs maintenance.

La dérégulation de la signalisation du récepteur tyrosine kinase Met et de son ligand l'HGF/SF est associée à la progression tumorale et à la métastase dans de nombreux types de cancers. En condition de stress et en absence de ligand, Met est clivé par des caspases dans le domaine juxta-membranaire et libère un fragment proapoptotique dans le cytoplasme, p40 Met. J'ai pu montrer qu'un clivage C-terminal de Met créée une séquentialité dans ces clivages. Le clivage C-terminal du récepteur Met est important dans la formation du fragment apoptotique mais n'affecte pas les réponses biologiques induites par l’HGF/SF. D'autre part, Met est une cible de la « presenilin-dependent regulated intramembrane proteolysis » (ou PS-RIP). Ce processus de dégradation implique un double clivage séquentiel par des métalloprotéases membranaires puis par le complexe g-secrétase. Ces clivages régulent la demi-vie du récepteur Met et préviennent son activation en absence de ligand. Suite au clivage par les métalloprotéases, Met peut également échapper au complexe g-secrétase par son internalisation préalable. Les fragments générés sont alors dégradés par le lysosome. Les fragments de ces deux voies de dégradation ont la capacité de transformer des fibroblastes. De façon intéressante, l’analyse de xénogreffes de tumeurs humaines chez des souris a montré une accumulation de ces fragments. Nous proposons donc que les voies de dégradation PS-RIP et lysosomale préviennent l’accumulation de fragments délétères de Met. Les différents clivages du récepteur Met permettent de réguler son action en absence d'HGF/SF et pourraient donc jouer un rôle important dans les réponses physiologiques. / Signalling dysregulation of receptor tyrosine kinase Met and its ligand the HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factors) is associated with tumor growth and metastasis in numerous cancer. Iin stress condition and without its ligand, Met is cleaved by caspases in the juxtamembrane domain which liberates a proapoptotic fragment in cytoplasm, p40 Met. I have shown that a C-terminal cleavage of Met creates a hierarchical organization of these cleavages. The C-terminal cleavage of Met receptor is important to generate apoptotic fragment but does not affect the biological responses induced by the HGF/SF. On the other hand, Met is targeted by PreSenilin-dependent Regulated Intramembrane Proteolysis (called PS-RIP). This proteolytic process of degradation involves two sequential cleavages by membranous metalloproteases and by g-secretase complex. These cleavages regulate half-life of Met receptor and prevent its activation without ligand.Following the cleavage by metalloproteases, Met can escape from g-secretase complex through its prior internalization. Generated fragments are then degraded by the lysosome. Fragments of both degradation patways are able to transform fibroblasts. Interestingly, human tumor xenografts in mice display accumulation of these fragments, suggesting these PS-RIP and lysosomal degradations pathways prevent accumulation of deleterious fragments of Met.Different cleavages of Met receptor can regulate its action without HGF/SF and could have an important role in physiological responses.

L’un des challenges dans la délivrance intracellulaire de macromolécules biologiques est le développement de vecteurs adaptés et efficaces. Des études précédentes ont identifiés les dérivés lipidiques d’aminoglycosides comme étant d’excellents candidats pour la délivrance d’acides nucléiques et récemment de protéines. La délivrance intracellulaire de protéines thérapeutiques représente une approche originale pour le traitement de pathologies car elles ont la capacité d’agir sur des voies de signalisation intracellulaire. Dans cette étude, nous avons identifié les relations entre les caractéristiques physico-chimiques des vecteurs et leur capacité à délivrer efficacement les molécules biologiques au sein des cellules. Pour y parvenir nous avons mis en oeuvre une stratégie originale en étudiant les corrélations existantes par microscopie de fluorescence et électronique. Nous avons ainsi identifié un système micellaire à base d’aminoglycoside permettant la délivrance d’une protéine thérapeutique (anticorps K8-FITC) au sein de cellules vivantes. Les complexes lipide/anticorps sont internalisés par la voie macropinocytose et cavéoledépendant (CvME) dont cette dernière est majoritaire. Ensuite, les complexes concentriques et multilamellaires (25 nm et 1 μm de diamètre) se retrouvent dans des vésicules intracellulaires et sont libérés par un mécanisme de « flipflop ». La formation du couple lipides anioniques/cationiques permet le détachement de l’anticorps et sa libération dans le cytoplasme. Par microscopie corrélative et tomographie, il a été démontré que l’anticorps se distribuait dans l’ensemble de la cellule et restait fonctionnel, attesté par la fixation sur des filaments intermédiaires de cytokératine 8. / One of the challenges in the intracellular delivery of biological macromolecules is the development of suitable and efficient vectors. Previous studies have identified lipid derivatives of aminoglycosides as excellent candidates to the delivery of nucleic acids and recently proteins. The intracellular delivery of therapeutic proteins represents an original approach for the treatment of pathologies because they have the capacity to act on intracellular signaling pathways. In this study, we identified the relationships between physico-chemical characteristics of vectors and their ability to efficiently deliver biological molecules within cells. To achieve this, we have implemented an original strategy by studying the existing correlations by fluorescence and electron microscopy. We have thus identified an aminoglycoside-based micellar system allowing the delivery of a therapeutic protein (K8- FITC antibody) within living cells. The lipid/antibody complexes are internalized by the macropinocytosis and caveolae-dependent pathway (CvME), of which the latter is the majority. Then, the concentric and multilamellar complexes (25 nm and 1 μm in diameter) are found in intracellular vesicles and are released by a "flip-flop" mechanism. The formation of the anionic/cationic lipid couple allows detachment of the antibody and its release into the cytoplasm. By correlative microscopy and tomography, it was demonstrated that the antibody was distributed throughout the cell and remained functional, ascertained by the fixation on intermediate filaments of cytokeratin 8.

Methionine (Met) is an essential amino acid for animals and also the first limiting amino acid in a broiler diet. The dietary supplemental Met sources include the natural isoform L-methionine (L-Met), the synthetic form DL-methionine (DL-Met) and the synthetic Met precursor DL-2-hydroxy-4 (methylthio)-butanoic acid (DL-HMTBA). The objective of this dissertation was to determine the effect of different dietary Met source supplementation and Met deficiency on a series of physiological and biochemical aspects, including growth performance, global DNA methylation and methyltransferase activity, blood antioxidant profile (e.g., acute phase protein, leukocyte count), intestinal nutrient transporter gene expression, Met converting enzyme gene expression and activity, oxidative stress markers, and a potential pathway related to amino acid signaling. To achieve this goal, male Cobb-500 broilers were raised from day of hatch (d0) to d35 post-hatch and fed a diet deficient in methionine and cysteine (Met + Cys) (control) or the same diet supplemented with 0.22% DL-Met, 0.22% L-Met or 0.31% DL-HMTBA (to provide 0.22% DL-Met equivalent) to meet Met + Cys requirements. Tissues (liver, breast muscle, duodenum, jejunum and ileum) and blood samples were collected at various ages from d0 to d35 for analysis. Met supplementation significantly improved body weight gain and feed efficiency compared to the Met deficient group, but no differences were observed among DL-Met, L-Met and DL-HMTBA for growth performance parameters (P > 0.05). Met supplementation had no effect on red blood cell packed cell volume, white blood cell differential count, hepatic total DNA methylation, DNA methyltransferase and Met oxidase activity, and had limited effects on activation of p70S6K, a key amino acid signaling protein (P > 0.05). Although dietary Met sources did not change oxidative status of the treated chickens, both L-Met and DL-Met but not DL-HMTBA supplementation decreased the level of acute phase protein serum amyloid A compared to the control group (P > 0.05). The effect of Met supplementation on gene expression of nutrient transporters and Met converting enzymes were complex and dynamic. Most of the target genes demonstrated tissue- and development-dependent expression patterns, with few significant treatment effects observed. L-Met and DL-Met but not DL-HMTBA supplementation enhanced the neutral amino acid transporters ATB0,+ and B0AT gene expression in various small intestinal segments. All three Met sources increased monocarboxylic acid transporter (MCT1) gene expression in the jejunum. DL-HMTBA and L-Met fed chickens showed greater hepatic L-HMTBA oxidase (HAO1) gene expression. DL-Met increased glutamic-oxaloacetic transaminase 2 (GOT2) gene expression in the duodenum. An in vitro study with tissue explants, however, did not demonstrate a similar gene expression pattern as that in the in vivo study. Lastly, RNA sequencing results illustrated that Met deficiency could lead to many differentially expressed genes but different supplemental Met sources had no influence on hepatic gene expression profiles. In conclusion, as common dietary supplemental Met sources, L-Met, DL-Met and DL-HMTBA exhibited similarity in impacting intestinal amino acid/peptide/monocarboxylic acid transporter gene expression and Met converting enzyme activity. The regulatory roles of Met as an antioxidant and nutrient signaling in cell metabolism were not affected by different dietary supplemental Met sources. / Ph. D.

Colorectal cancer (CRC) is the third leading cause of death from cancer in North America. The KRAS gene is mutated in approximately 40-50% of all CRC, and this mutation precludes treatment with promising targeted therapeutics. c-MET is a receptor tyrosine kinase that is overexpressed in ~70% of CRCs, and expression is correlated with disease progression. We hypothesized that high c-MET plus mutant KRAS would result poor survival of CRC patients, by activating unique signalling pathways that may be targeted for therapeutic purposes. To this end, we used phosphoproteomics in a KRAS mutant cell line, and identified proteins phosphorylated on tyrosine in response to HGF stimulation, including a subset of those that contain SRC family kinase consensus motifs. Small molecule inhibitors of either SRC or c-MET reduced tyrosine phosphorylation of both proteins, indicating reciprocal signalling. We chose the c-MET target p190RhoGAP for future study, as it is often ubiquitously bound to p120RasGAP via phosphorylated tyrosine. We found that RasGAP expression is mediated in part by KRAS signalling, and that expression of RasGAP could partly rescue tumourigenicity of a CRC cell line where the mutant KRAS allele has been inactivated, indicating the requirement of both mutant KRAS and RasGAP expression in this model. We then conclude by looking at CRC patient samples to determine the role of KRAS mutation in the progression and survival of CRC. We found that both KRAS and c-MET copy number are correlated to KRAS mutation status, and that c-MET polysomy plus KRAS mutation leads to worse overall survival than KRAS mutation alone. Overall, we identified novel targets of c-MET and KRAS oncogenic signaling, and identify a population which may derive the most benefit from treatments targeting both of these lesions.

Colorectal cancer (CRC) is the third leading cause of death from cancer in North America. The KRAS gene is mutated in approximately 40-50% of all CRC, and this mutation precludes treatment with promising targeted therapeutics. c-MET is a receptor tyrosine kinase that is overexpressed in ~70% of CRCs, and expression is correlated with disease progression. We hypothesized that high c-MET plus mutant KRAS would result poor survival of CRC patients, by activating unique signalling pathways that may be targeted for therapeutic purposes. To this end, we used phosphoproteomics in a KRAS mutant cell line, and identified proteins phosphorylated on tyrosine in response to HGF stimulation, including a subset of those that contain SRC family kinase consensus motifs. Small molecule inhibitors of either SRC or c-MET reduced tyrosine phosphorylation of both proteins, indicating reciprocal signalling. We chose the c-MET target p190RhoGAP for future study, as it is often ubiquitously bound to p120RasGAP via phosphorylated tyrosine. We found that RasGAP expression is mediated in part by KRAS signalling, and that expression of RasGAP could partly rescue tumourigenicity of a CRC cell line where the mutant KRAS allele has been inactivated, indicating the requirement of both mutant KRAS and RasGAP expression in this model. We then conclude by looking at CRC patient samples to determine the role of KRAS mutation in the progression and survival of CRC. We found that both KRAS and c-MET copy number are correlated to KRAS mutation status, and that c-MET polysomy plus KRAS mutation leads to worse overall survival than KRAS mutation alone. Overall, we identified novel targets of c-MET and KRAS oncogenic signaling, and identify a population which may derive the most benefit from treatments targeting both of these lesions.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

La pollution de l'environnement et l'insuffisance des ressources énergétiques dans le monde constituent deux défis majeurs auxquels l'humanité est confrontée aujourd'hui. La photocatalyse hétérogène de semiconducteur est considérée comme une stratégie prometteuse pour la collecte de l'énergie solaire et la décomposition de contaminants organique dans l'eau et l'air. TiO2 est aujourd'hui le photocatalyseur le plus largement utilisé. Cependant, TiO2 est un semi-conducteur avec une bande interdite d'environ 3.1eV. Donc, il n'absorbe pas la lumière visible. L'oxyde de fer est un bon candidat potentiel pour la photocatalyse : ce matériau est stable, moins cher, respecte l'environnement et il a une bande interdite suffisamment petite (2.1 eV) pour absorber 45% de la radiation solaire incidente. Afin de développer un photocatalyseur efficace de l'oxyde de fer, nous avons préparé des nanoparticules d'oxyde de fer de formes différentes et étudié l'influence des différents paramètres expérimentaux. L'objectif cette thèse est de développer et de caractériser un photocatalyseur à base d'oxyde de fer et hautement photoréactive capable de décomposer les molécules des polluants organiques. Des nanoparticules d'oxydes et d'oxyhydroxyde de fer avec différentes morphologies ont été conçues et synthétisées par la méthode hydrothermale. Dans le système de réaction, des agents de surface avec différents groupes fonctionnels ont été utilisés pour la contrôle de la morphologie. Les effets ont été attribués à l'interaction entre les groupes fonctionnels des agents de surface et des surfaces d'oxyde de fer. Pour élucider les mécanismes de croissance de nanoparticules d'oxyde de fer, une technique en MET basée sur une méthode de trace a été proposée afin de caractériser les plans cristallins et l'orientation de nanoparticules facettées, et donc leurs formes. Les indices de Miller de plans de surface peuvent être déterminé par la transformation de coordonnées après la détermination du vecteur des bords dans les systèmes de coordonnées de l'écran du MET. Dans ce travail, l'orange de méthyl, un représentant colorant azoïque de l'industrie textile, a été pris comme molécule modèle pour les contaminants organiques pour évaluer les capacités photocatalytiques des poudres obtenues. Une étude systématique, y compris l'influence des conditions de réaction et la cinétique, a été effectuée pour étudier le mécanisme de la dégradation photocatalytique de méthylorange à l'oxyde de fer sous irradiation de lumière visible. Il a été constaté que la photodégradation de l'orange de méthyle à l'oxyde de fer est un procédé de photocatalyse de semiconducteur. De plus, les activités photocatalytiques des IV lumières visibles d'oxyde de fer peuvent être harmonisées par le contrôle des morphologies, surtout les indices des facettes des nanoparticules d'oxyde de fer. Les techniques de traitement postérieur ont été utilisées à améliorer la capacité photocatalytique de l’oxyde de fer pour décomposer les molécules des contaminants organiques. Les nanopoudres d’oxyde de fer ont été modifiées par intégration de métaux nobles, par exemple les nanoparticules d'Ag et d'Au. Les résultats des expérimentations photocatalytiques montrent que la capacité des particules métalliques intégrées d'inhiber la recombinaison de la paire de trou électrique dépendent de la position relative entre fonctions travail et la position de la bande de conduction de l'oxyde de fer. Pour surmonter ce problème causé par la courte distance libre des charge dans l'oxyde de fer, des nanobâtonnets ont été préparés. Les résultats indiquent que l'activité photocatalytique de l'oxyde de fer peut être améliorée par l'optimisation microstructurale et la modification surfacique / Global environmental pollution and energy issue are considered as two greatest challenges that human society is facing now. Semiconductor photocatalysis is expected as a highly promising strategy for both harvesting solar energy and decomposing unwanted organics in water and air by solar light irradiation. The main problem of TiO2, the most widely studied photocatalyst material by now, is that its band gap is as wide as 3.1 eV, making it absorb only the UV part of the incident solar irradiation. Iron oxide has a proper band gap of about 2.1 eV which lies in the visible region of solar spectrum and allows utilization of 45% of the solar radiation. Together with the environmental compatibility and low cost, iron oxide is considered as a good candidate for visible light photocatalyst. For the purpose of exploiting iron oxide as effective photocatalyst, we have prepared iron oxide nanoparticles of various shapes and investigated their photocatalytic activities. The objective of the present dissertation is to develop and characterize iron oxide photocatalyst which is highly responsive to visible light. Nanostructured iron oxide and oxyhydroxide nanoparticles with various morphologies were designed and synthesized via hydrothermal route. Stabilizer molecules with different capping groups were applied in the reaction system to control the morphology of the final products. The effects attributed to the interaction between capping groups of stabilizer molecules and iron oxide surfaces. To elucidate the growth mechanism of iron oxide particles, a TEM based trace method was proposed to characterize the crystalline planes and directions of a faceted nanoparticle, and therefore its shape. The Miller indices of surface planes can be determined through coordinate transformation after the determination of the edge vectors in the TEM screen coordinate system. Methyl orange, a representative azo dye pollutant in textile industry, was chosen as the model contaminant molecule to evaluate the photocatalytic performance of the obtained powders. A systematic study, including the influence of the reaction conditions, the kinetics and the route of the oxidation of the methyl orange molecules, was carried out to explore the mechanism of photocatalytic degradation of organic molecules over iron oxide under visible light irradiation. It was found that the photodegradation of methyl orange over iron oxide was more like a semiconductor photocatalysis process, rather than a surface reaction process of ligands to metal charge transfer. Moreover, the visible light photocatalytic activities of iron oxide can be tuned by controlling the morphologies, especially the crystallographic facet of the iron oxide nanoparticles. II Post-treatment techniques were adopted to enhance the ability of iron oxide photocatalyst to decompose organic pollutant molecules. The iron oxide nanopowders were modified by loading noble metals, such as Ag and Au nanoparticles. Photocatalytic experimental results showed that the abilities of loaded metal particles to inhibit the electron-hole pair recombination depend on the relative positions between their work functions and conductive band position of the iron oxide. To overcome the problem caused by the short free distance of charge carriers inside iron oxide, nanorod arrays of iron oxide were prepared. The results show that the photocatalytic activity of iron oxides can be improved by microstructure optimization and surface modification

Lors de son irradiation en réacteur, le dioxyde d'uranium subit d'importantes modifications physico-chimiques (génération de bulles de gaz de fission, création de dislocations...). Le relâchement des gaz de fission est un critère important du point de vue de la sureté nucléaire, limitant le temps de vie du combustible en réacteur. Or, la croissance préférentielle des bulles localisées sur les défauts étendus a été mise en évidence expérimentalement. Le but de ce travail est donc d'étudier les dislocations induites par irradiation, afin d'améliorer la compréhension du comportement du combustible. Les objectifs sont de déterminer les caractéristiques des défauts étendus (vecteur de Burgers, plan d'habitat, nature interstitielle ou lacunaire), leurs mécanismes d'évolution (nucléation, grossissement), ainsi que l'influence de différents paramètres d'irradiation, tels que la fluence, la température et la présence d'atomes exogènes sur leur cinétique d'évolution. Pour ce faire, des études à effets séparés basées sur la réalisation d'irradiations aux ions (plateformes JANNuS d'Orsay et de Saclay) et de caractérisations in situ à différentes échelles comme des observations au Microscope Electronique en Transmission (CEMES, JANNuS Orsay), des mesures de Diffraction des Rayons X et de spectroscopie Raman, ont été mises en place. Enfin, la caractérisation du combustible irradié en réacteur réalisée à JRC-ITU, a révélé des défauts étendus très semblables à ceux induits par des irradiations aux ions, en termes de densité et de caractéristiques. / During in-reactor irradiation, several phenomena take place in the uranium dioxide fuel: fission gas bubbles and extended defects (dislocation loops and lines) generation, doping by fission products, etc. Fission gas release is an important nuclear safety issue and represent, among others, a limiting factor for the fuel lifetime in reactors. It has been shown experimentally that the extended defects are preferential growth sites for fission gas bubbles. Hence, the study of extended defects created under irradiation is a significant step to better understand the fuel behavior. The aims of this study are to determine the extended defect characteristics (Burgers vectors, habit planes, interstitial or vacancy nature), their evolution mechanisms and the effect of the different irradiation parameters, such as fluence, temperature and exogenous atoms, on the evolution kinetics. To do that, separated-effects studies have been performed using ion irradiations/implantations (JANNuS facilities in Orsay and in Saclay) followed by in situ TEM characterizations (CEMES, JANNuS Orsay), XRD and Raman spectroscopy measurements. Finally, the characterization of fuel irradiated in reactor performed at JRC-ITU, revealed that extended defects are very much closed to those induced by ion irradiations, in terms of density and characteristics.