L’un des challenges dans la délivrance intracellulaire de macromolécules biologiques est le développement de vecteurs adaptés et efficaces. Des études précédentes ont identifiés les dérivés lipidiques d’aminoglycosides comme étant d’excellents candidats pour la délivrance d’acides nucléiques et récemment de protéines. La délivrance intracellulaire de protéines thérapeutiques représente une approche originale pour le traitement de pathologies car elles ont la capacité d’agir sur des voies de signalisation intracellulaire. Dans cette étude, nous avons identifié les relations entre les caractéristiques physico-chimiques des vecteurs et leur capacité à délivrer efficacement les molécules biologiques au sein des cellules. Pour y parvenir nous avons mis en oeuvre une stratégie originale en étudiant les corrélations existantes par microscopie de fluorescence et électronique. Nous avons ainsi identifié un système micellaire à base d’aminoglycoside permettant la délivrance d’une protéine thérapeutique (anticorps K8-FITC) au sein de cellules vivantes. Les complexes lipide/anticorps sont internalisés par la voie macropinocytose et cavéoledépendant (CvME) dont cette dernière est majoritaire. Ensuite, les complexes concentriques et multilamellaires (25 nm et 1 μm de diamètre) se retrouvent dans des vésicules intracellulaires et sont libérés par un mécanisme de « flipflop ». La formation du couple lipides anioniques/cationiques permet le détachement de l’anticorps et sa libération dans le cytoplasme. Par microscopie corrélative et tomographie, il a été démontré que l’anticorps se distribuait dans l’ensemble de la cellule et restait fonctionnel, attesté par la fixation sur des filaments intermédiaires de cytokératine 8. / One of the challenges in the intracellular delivery of biological macromolecules is the development of suitable and efficient vectors. Previous studies have identified lipid derivatives of aminoglycosides as excellent candidates to the delivery of nucleic acids and recently proteins. The intracellular delivery of therapeutic proteins represents an original approach for the treatment of pathologies because they have the capacity to act on intracellular signaling pathways. In this study, we identified the relationships between physico-chemical characteristics of vectors and their ability to efficiently deliver biological molecules within cells. To achieve this, we have implemented an original strategy by studying the existing correlations by fluorescence and electron microscopy. We have thus identified an aminoglycoside-based micellar system allowing the delivery of a therapeutic protein (K8- FITC antibody) within living cells. The lipid/antibody complexes are internalized by the macropinocytosis and caveolae-dependent pathway (CvME), of which the latter is the majority. Then, the concentric and multilamellar complexes (25 nm and 1 μm in diameter) are found in intracellular vesicles and are released by a "flip-flop" mechanism. The formation of the anionic/cationic lipid couple allows detachment of the antibody and its release into the cytoplasm. By correlative microscopy and tomography, it was demonstrated that the antibody was distributed throughout the cell and remained functional, ascertained by the fixation on intermediate filaments of cytokeratin 8.

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliqués dans la synthèse protéique bactérienne. Dans un premier chapitre, les origines de la synthèse protéique au temps du monde ARN sont traitées en guise d'introduction. Ce travail théorique se poursuit par la présentation d'une structure à haute résolution du facteur d'élongation G (EF-G) en complexe avec le ribosome par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET). Grâce aux avancées techniques de la cryo-MET, nous avons observé pour la première fois EF-G lié au ribosome en l'absence de tout inhibiteur. Cet état particulièr d'EF-G permet de visualiser une flexibilité de son doamine III. Cette étude permet aussi de rationaliser le fonctionnement de l'antibiotique acide fusidique. Nous nous sommes ensuite intéressés aux voies de sauvetage de la synthèse protéique et plus particulièrement de la trans-traduction. Ce mécanisme fascinant permet le recyclage des ribosomes bloqués sur un ARN messager défectueux. Cette voie de sauvetage est généralement vitale ou alors indispensable pour la virulence bactérienne. Nous avons réalisé une étude structurale préliminaire de la dégradation de l'ARNm défectueux durant ce processus. Après une revue traitant du sujet, nous présentons une étude de la trans-traduction comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. Pour cela, nous avons mis au point un système rapporteur avec contrôle interne de l'activité trans-traductionnelle bactérienne. Après avoir mis au point ce système et validé son utilisation, nous l'avons exploité en testant des molécules ciblant la trans-traduction. / The current PhD work brings together various studies linked to bacterial protein synthesis. The first chapter is about the origins of protein synthesis at the time of the RNA world. This theoretical work continues with the presentation of a high-resolution structure of the elongation factor G (EF-G) in complex with the ribosome by cryo-electron transmission microscopy (cryo-TEM). We describe for the first time EF-G bound to the ribosome in the absence of any inhibitor. This particular structure of EF-G displays a yet unseen positioning of its third domain, which becomes very flexible. This study helps to understand the way the antibiotic fusidic acid blocks translation. The work then switches to a study of trans-translation, the main rescuing system of stalled ribosomes in bacteria. Trans-translation is generally vital or at least necessary for bacterial virulence. We conducted a preliminary structural study on the way faulty mRNAs are degraded during this process. This is why we present a study of trans-translation as a target for the development of new antibiotics. For this we developed and validated a reporter system for trans-translation, which is used to screen molecules targeting trans-translation.