Orientador: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, prevalente na América Latina, que tem por agentes etiológicos diferentes espécies de Paracoccidioides. Entre eles encontra-se o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), espécie composta por um complexo de agrupamentos geneticamente isolados, classificados como espécies filogenéticas: S1, PS2, PS3 e PS4. O P. brasiliensis possui distribuído pela parede fúngica e dentro de vesículas citoplasmáticas uma glicoproteína de 43KDa, a gp43. Esta molécula é considerada como o principal componente antigênico produzido e secretado pelo fungo, a qual é encontrada no soro de pacientes acometidos pela PCM e, está associada aos fatores de virulência e escape do patógeno. Sabendo disso, tornou-se extremamente importante a avaliação da interação dessa proteína com as células do sistema imune inato e sua consequente atuação sobre os mecanismos moduladores celulares. Assim, nosso estudo avaliou os neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) que estão presentes em abundância desde o início e durante a infecção pelo Paracoccidioides, e que apresentam além de suas ações efetoras diretas contra o fungo, uma importante ação moduladora da resposta imune. Estas ações envolvem o reconhecimento do fungo por Receptores de Reconhecimento de Padrão (PRRs) que culminam em ativação celular com consequente produção e liberação de diferentes mediadores inflamatórios. Dessa maneira, o presente trabalho avaliou o envolvimento dos receptores cel... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease, prevalent in Latin America and has as etiological agents Paracoccidioides spp. One of them is Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) composed by a complex of genetically isolated clusters, classified as phylogenetic species: S1, PS2, PS3 and PS4. P. brasiliensis present along the cell wall and inside cytoplasmic vesicles a 43 KDa glycoprotein, known as gp43. This molecule is recognized as the main antigenic component produced and secreted by the fungus into sera of PCM patients and is associated with the escape and virulence factors of the pathogen. Thereby, becomes extremely important to evaluate the interaction mechanisms of this protein with cells from the innate immune system and their consequent action on cellular functions. Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) has prominent participation in PCM, once these cells are present in a great amount at the beginning and during Paracoccidioides infection. PMNs perform effector actions directly against the fungi as well as an important immune modulatory function. Such actions involve the recognition of fungal components by pattern recognition receptors (PRRs) that leads to cell activation and consequent production of inflammatory mediators. So, the present study evaluated the involvement of TLR2 and TLR4 on cytokines and eicosanoids release by PMNs from healthy human stimulated with gp43. Cells were initially incubated in the presence or absence of monoclo... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

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La Polyarthrite Rhumatoïde est caractérisée par une synovite à l’origine de lésions progressives ostéo-articulaires induites par les formes réactives de l’oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN). La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d’un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s’associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). Nous avons étudié la spécificité de l’interaction entre la (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) et la NADPH oxydase des PMN. D’autre part, nous avons caractérisé les domaines de l’hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l’empreinte de l’activation du PMN dans la PR.Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l’affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l’enzyme majeure de la régulation de la glycolyse, voie est essentielle pour la production d’ATP du PMN. L’utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a révélé l’empreinte de l’activation du PMN dans cette pathologie avec une surexpression des protéines S100A8 et S100A9. Une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence.En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l’hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d’activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la PR, l’activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles. / Rheumatoid Arthritis (RA) is caused by an inflammation of the synovial membrane leading to progressive joint destruction and deformation, related to the production NADPH oxidase related-reactive oxygen species (ROS) production. The phagocyte NADPH oxidase is a multi-protein complex formed by a catalytic core, i.e. the transmembrane cytochrome b558 and cytosolic regulators (p67phox, p47phox, p40phox and Rac1/2). We aimed at better analyzing the NADPH oxidase activation through the evaluation of the specificity of the interaction with 6PGDH or PFK2 and through the further analysis of the association with the S100A8/A9 heterocomplex. The RA-specific protein profiling was conducted in order to determine whether a PMN activation fingerprint could be revealed among RA specific proteins.Upon PMA stimulation, both 6PGDH and PFK2 co-imunoprecipitated with cytosolic factors p67phox, p47phox and p40phox. At the plasma membrane level, confocal microscopy experiments suggested a co-localization of either 6PGDH or PFK2 with the phagocyte NADPH oxidase in lipid rafts. 6PGDH enhanced the phagocyte NADPH oxidase activity by both improving the availability of cytosolic NADPH content and by increasing the affinity of the NADPH oxidase for its substrate. PFK2 also augmented the NADPH oxidase activity. PFK2 modulated the ATP concentration available for the phosphorylation of the phagocyte NADPH oxidase components and for the NDP Kinase related-Rac activation. The generation of truncated S100A8/S100A9 heterodimer chimera could reveal that the C-terminal region of S100A8 is involved in both the interaction and the activation of the phagocyte NADPH oxidase.In vivo, synovial fluid of RA patients was remarkably labelled with the PMN activation fingerprint. S100A8 and S100A9 proteins clearly distinguished RA synovial fluid from osteoarthritis and non RA-synovial fluids. An ectopic production of S100A8/S100A9 was shown in RA fibroblast like synoviocyte.In conclusion, 6PGDH, PFK2 and S100A8/A9 proteins are surrogate activating partners of the phagocyte NADPH oxidase. In RA, the activation of PMNs leads to the release of S100A8/A9 proteins which may constitute interesting biomarkers and promising therapeutic targets.

Les médiateurs lipidiques de l’inflammation dont le leucotriène B4 (LTB4) et le facteur d’activation plaquettaire (PAF) permettent la régulation de la migration des neutrophiles polymorphonucléaires (PMNs) et l’extravasation plasmatique au site inflammatoire. Afin de déterminer leurs rôles dans la régulation de la migration des PMNs au site inflammatoire, nous avons étudié leur effet potentiellement coopératif en utilisant une approche pharmacologique à l’aide d’antagonistes sélectifs des récepteurs du LTB4 et du PAF dans un modèle d’inflammation dermique chez le lapin. Les résultats montrent un effet inhibiteur additif des antagonistes des deux médiateurs lipidiques, lorsque utilisés de façon concomitante, sur la migration des neutrophiles induite par le LTB4, le PAF et aussi sur des médiateurs non-chimiquement apparentés comme le facteur nécrosant des tumeurs (TNFα), ainsi que sur l'inhibition de l’extravasation plasmatique induite par le leucotriène D4, suggérant un rôle régulateur des récepteurs du LTB4 et du PAF dans la migration des PMNs au site inflammatoire. Nous avons déterminé le rôle de ces médiateurs dans la régulation de la migration des PMNs en réponse à une ischémie-reperfusion des membres inferieurs chez le lapin. Les résultats appuient l’hypothèse selon laquelle le LTB4 et le PAF exercent un rôle important dans l’accumulation des PMNs au site inflammatoire. En effet l’administration concomitante des antagonistes des récepteurs de ces deux médiateurs lipidiques a réduit de façon significative la migration des PMNs aux poumons, intestins et foie. Nos résultats contribuent à élucider le rôle du LTB4 et du PAF dans la régulation de l’extravasation des PMNs et du plasma au site inflammatoire. / Inflammatory lipid mediators including leucotriene B4 (LTB4) and platelet activating factor (PAF) regulate the trafficking of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and plasma extravasation at inflammatory sites. To delineate their role in regulating PMNs extravasation, we studied the effect of PAF and/or LTB4 selective receptor antagonists in dermal inflammation induced by a variety of agonists in a rabbit bioassay model. The results show that there is an additive inhibitory effect when the two antagonists are used concomitantly on PMNs dermal accumulation induced by LTB4 and PAF, as well by chemically unrelated agonists including TNFα, in addition to inhibiting plasma extravasation induced by LTD4. These results support a regulatory role of LTB4 and PAF in regulating PMNs trafficking and plasma extravasation at inflammatory sites. Next, we studied the regulatory role of lipid mediators in regulating PMNs trafficking in response to hind limb ischemia-reperfusion. The results show that the administration of both PAF and LTB4 receptor antagonists reduced significantly PMNs migration to the lung, the liver and the intestine. Our results contributed to elucidate the role of LTB4 and PAF in the regulation of PMNs migration and oedema formation at inflammatory sites.

La leishmaniose viscérale est une maladie systémique mortelle en l’absence de traitement. Elle est due aux protozoaires Leishmania donovani et L. infantum, parasites des phagocytes mononucléés, capables d’envahir les organes lymphoïdes et le foie. Le contrôle de l’infection hépatique repose sur la mise en place d’une réponse granulomateuse efficace, promue par une réponse immunitaire Th1, dans un environnement tissulaire Th2. L’objectif de ce travail était l'étude du rôle d’une cytokine Th2 récemment décrite, l’IL-33, dans cette réponse hépatique complexe encore partiellement incomprise. Des dosages d’IL-33 sur des sérums de patients et la détection de cellules IL-33+ dans le foie d’un patient rennais ont placé l’IL-33 comme un biomarqueur possible de la maladie active. L’IL-33 étant exprimée dans les cellules étoilées du foie au cours d’hépatites chroniques, ces cellules ont été exposées à L. donovani. Leur permissivité aux leishmanies sans toxicité apparente ni perturbation de leurs propriétés fonctionnelles, ainsi que la persistance des leishmanies sur une culture de plusieurs semaines, nous ont conduit à proposer les cellules étoilées comme cellules sanctuaires possibles pour les leishmanies viscérotropes, contribuant donc potentiellement au portage asymptomatique. En revanche, elles ne sont pas apparues comme une source majeure d'IL-33 au cours de la leishmaniose viscérale. Chez des souris C57BL/6 et BALB/c infectées par L. donovani, l'IL-33 a été observée dans des cellules ne s'apparentant pas à des cellules étoilées, et principalement localisées dans les granulomes. Des cellules exprimant son récepteur ST2 ayant été également observées dans le foie, un rôle de l’axe IL-33/ST2 a été recherché. Les résultats obtenus chez des souris BALB/c déficientes en ST2 ou traitées par de l'IL-33 recombinante suggèrent que l'IL-33 régule négativement l'expression de cytokines Th1 (IL-12, IFN-γ) et l'infiltrat de neutrophiles et monocytes dans le foie, limitant ainsi le contrôle de la charge parasitaire. Ainsi, l'IL-33 semble être un facteur de susceptibilité pour la leishmaniose viscérale. En parallèle, des travaux entrepris sur des souris C57BL/6 infectées par L. donovani suggèrent de possibles rôles différentiels de l'IL-33 en fonction de l'environnement immunitaire inhérent au fond génétique de l'hôte. / Visceral leishmaniasis is a life-threatening systemic disease caused by Leishmania protozoans, L. donovani and L. infantum, which invade mononuclear phagocytes in the lymphoid organs and the liver. The control of the hepatic parasite burden depends on the granuloma formation, which is favored by a Th1 immune response in a Th2 tissue microenvironment. The aim of this work was to study the role of the recently described Th2 cytokine IL-33 in this complex immune response, which remains partially misunderstood. IL-33 dosages in different patient sera and IL-33+ cells detected in the liver of a patient from Rennes suggested that IL-33 could be a biomarker for active visceral leishmaniasis. As IL-33 was described in hepatic stellate cells during chronic hepatitis, these cells were exposed to L. donovani in primary culture. The cell permissivity to L. donovani and the parasite persistence during a long term culture led us to propose hepatic stellate cells as a new type of sanctuary cells, which could partially explain asymptomatic carriage. However, these cells were apparently not the main source of IL-33 during visceral leishmaniasis. In infected BALB/c and C57BL/6 mice, IL-33 was detected in the liver in non stellate cells preferentially localized in granulomas. The presence of cells expressing its specific receptor ST2 in the liver led us to explore the role of the IL-33/ST2 axis. BALB/c mice deficient in ST2 or treated with recombinant IL-33 and infected with L. donovani revealed that IL-33 downregulates the expression of Th1 key cytokines (IL-12, IFN-γ) and the recruitment of neutrophils and monocytes. Finally, IL-33 acts as a susceptibility factor during visceral leishmaniasis. Besides, the model of L. donovani infected C57BL/6 mice deficient in IL-33 or treated with recombinant IL-33 suggests possible differential roles of IL-33 depending on the immune environment related to the host genetic background.

Les médiateurs lipidiques de l’inflammation dont le leucotriène B4 (LTB4) et le facteur d’activation plaquettaire (PAF) permettent la régulation de la migration des neutrophiles polymorphonucléaires (PMNs) et l’extravasation plasmatique au site inflammatoire. Afin de déterminer leurs rôles dans la régulation de la migration des PMNs au site inflammatoire, nous avons étudié leur effet potentiellement coopératif en utilisant une approche pharmacologique à l’aide d’antagonistes sélectifs des récepteurs du LTB4 et du PAF dans un modèle d’inflammation dermique chez le lapin. Les résultats montrent un effet inhibiteur additif des antagonistes des deux médiateurs lipidiques, lorsque utilisés de façon concomitante, sur la migration des neutrophiles induite par le LTB4, le PAF et aussi sur des médiateurs non-chimiquement apparentés comme le facteur nécrosant des tumeurs (TNFα), ainsi que sur l'inhibition de l’extravasation plasmatique induite par le leucotriène D4, suggérant un rôle régulateur des récepteurs du LTB4 et du PAF dans la migration des PMNs au site inflammatoire. Nous avons déterminé le rôle de ces médiateurs dans la régulation de la migration des PMNs en réponse à une ischémie-reperfusion des membres inferieurs chez le lapin. Les résultats appuient l’hypothèse selon laquelle le LTB4 et le PAF exercent un rôle important dans l’accumulation des PMNs au site inflammatoire. En effet l’administration concomitante des antagonistes des récepteurs de ces deux médiateurs lipidiques a réduit de façon significative la migration des PMNs aux poumons, intestins et foie. Nos résultats contribuent à élucider le rôle du LTB4 et du PAF dans la régulation de l’extravasation des PMNs et du plasma au site inflammatoire. / Inflammatory lipid mediators including leucotriene B4 (LTB4) and platelet activating factor (PAF) regulate the trafficking of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and plasma extravasation at inflammatory sites. To delineate their role in regulating PMNs extravasation, we studied the effect of PAF and/or LTB4 selective receptor antagonists in dermal inflammation induced by a variety of agonists in a rabbit bioassay model. The results show that there is an additive inhibitory effect when the two antagonists are used concomitantly on PMNs dermal accumulation induced by LTB4 and PAF, as well by chemically unrelated agonists including TNFα, in addition to inhibiting plasma extravasation induced by LTD4. These results support a regulatory role of LTB4 and PAF in regulating PMNs trafficking and plasma extravasation at inflammatory sites. Next, we studied the regulatory role of lipid mediators in regulating PMNs trafficking in response to hind limb ischemia-reperfusion. The results show that the administration of both PAF and LTB4 receptor antagonists reduced significantly PMNs migration to the lung, the liver and the intestine. Our results contributed to elucidate the role of LTB4 and PAF in the regulation of PMNs migration and oedema formation at inflammatory sites.

La leptospirose est une zoonose causée par les bactéries du genre Leptospira. Elle touche près de 1 million d'individus par an dans le monde entier et sévit à l'état endémique dans les pays au climat tropical tel que La Réunion. Les manifestations habituelles sont variables d'un individu à l'autre et englobent une simple fièvre jusqu'aux défaillances poly-viscérales avec mortalité dans 5 à 10% des cas. Sa physiopathologie est encore mal comprise, en particulier la part que joue une réponse immunitaire inappropriée dans la genèse des manifestations graves qui surviennent en quelques heures, et avant la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative propre à éliminer le microorganisme. Si l'échappement de la bactérie au système du complément est bien documenté, le rôle des acteurs cellulaires du système immunitaire inné reste à étayer. Notre étude avait donc pour objectif d'explorer l'immunopathologie de la leptospirose humaine dans la phase initiale de l’infection. Notre méthodologie s'est appuyée principalement sur des analyses quantitatives et qualitatives des acteurs cellulaires du système immunitaire inné à partir de prélèvements sanguins en phase précoce de la maladie, et comparaison avec la phase de convalescence et des sujets contrôles. Dans un premier temps nous avons montré qu'une population particulière de lymphocytes T impliquée dans la réponse immune innée, les lymphocytes Tγδ, avaient un taux abaissé et que cette baisse était corrélée à la charge bactérienne ainsi qu'à l’intensité de l'atteinte hépatique classiquement retrouvée lors de la leptospirose. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les polynucléaires neutrophiles circulants dont le taux augmente d’autant plus que la maladie est sévère, mais sans pour autant présenter de modification de certains marqueurs d’activation ou de recrutement tissulaire (CD15, CD11b, CD182). Une des principales chimiokines des neutrophiles, l'interleukine 8, était à taux peu élevés. Les derniers travaux concernent les principales formes solubles issues des molécules membranaires impliquées dans le processus de recrutement/diapédèse leucocytaire. Nous retrouvons de manière isolée une forte élévation des formes solubles d'E-sélectine et ICAM-1 qui sont notamment exprimées par les cellules endothéliales. Ces augmentations n'étaient pas corrélées aux marqueurs de gravité de la maladie. La signification biologique de cette élévation n’est pas encore connue lors de la leptospirose. L'ensemble de nos données permet d’apporter des informations nouvelles sur des acteurs du système immunitaire inné présents dans le compartiment vasculaire lors de la leptospirose humaine. Cette réponse immunitaire semble inadaptée pour permettre une clairance du pathogène au stade de dissémination hématogène. / Leptospirosis is a bacterial zoonosis caused by Leptospira and affecting 1 million people each year worldwide and mainly in tropical areas such as Reunion Island. Usual presentations encompass flu-like syndrome to multiorgan failure with mortality rate between 5 to 10%. To date, pathophysiology in humans is poorly understood, notably the capacity of innateimmunity to mount a robust response to clear pathogen or to induce tissue damages and contributing to disease severity. Our study aimed at assessing the role of innate immune cells and molecules within the first days of leptospiral infection.Using blood samples, we performed quantitative and qualitative assessment of circulating innate immune cells from leptospirosis cases and healthy controls. The first study explored the levels of gamma-delta T-cells (γδT-cells), a subset of unconventional T cells with innate immune functions. Gamma-delta T cells were found deeply decreased and levels wereinversely correlated to bacterial burden and liver damage. The second study focused on membrane bound receptors indicative of activation and tissue migration ability of neutrophil polymorphonuclear cells: CD15, CD11b, and CD182. Although neutrophil rates were high in leptospirosis cases, the levels of studied receptors were either lower (CD15) or identical to healthy controls (CD11b, CD182). In addition, only low levels of interleukin-8, a key chemokine for neutrophils, was detected in patients. Lastly, we ascertained the plasmatic levels of several shed cell adhesion molecules notably expressed by endothelial cells. The levels of soluble E-selectin and ICAM-1 were significantly increased compared to controls, while P-selectin level was lower. We did not find any correlation with disease severity or organ failure. This finding indicates that endothelial cell may be activated but further experiments are warranted to explain the functional impact of our findings. Altogether, our results add to the field of knowledge of leptospirosis pathophysiology, and in particular the implication of key innate immune cells at the stage of plasmatic bacterial dissemination. Our findings will support the view that there is an inappropriate immune response to Leptospira.