La drépanocytose est une maladie génétique du globule rouge, due à une mutation ponctuelle du gène β de la chaine de l’hémoglobine. Néanmoins, la physiopathologie de la maladie va bien au-delà des anomalies érythrocytaires, avec notamment un dysfonctionnement vasculaire et leucocytaire qui font toute la complexité de la maladie. Au cours de ce travail, nous avons étudié le rôle de l’endothéline-1, peptide vaso-constricteur impliqué de nombreuses pathologies notamment vasculaires, sur l’activation et l’adhérence des polynucléaires neutrophiles dans la drépanocytose. Nous avons travaillé à la fois sur un modèle murin de drépanocytose (les souris SAD) et sur des échantillons sanguins de patients. Sur le modèle animal, nous avons réalisé des expériences de microscopie intravitale, permettant de tester in vivo l’effet des antagonistes des récepteurs ETA et ETB à l’endothéline sur le recrutement des polynucléaires neutrophiles. Sur les échantillons de sang de patients drépanocytaires, nous avons testé in vitro l’adhérence en flux des neutrophiles à l’endothélium vasculaire en réponse au blocage des récepteurs ETA et ETB. Nous avons enfin étudié l’expression des récepteurs ETA et ETB à la surface des neutrophiles et les voies de signalisations découlant de leur activation.Sur le modèle de souris drépanocytaire, l’inhibition des récepteurs ETA, mais surtout ETB permet de limiter le recrutement leucocytaire important provoqué par un stimulus inflammatoire. Ces résultats confirment le rôle d’ETA et celui, plus inattendu, d’ETB dans toutes les étapes d’adhérence des polynucléaires neutrophiles et dans leur transmigration tissulaire en contexte drépanocytaire.Sur des échantillons humains, nous avons confirmé le rôle crucial d’ETB dans l’adhérence des polynucléaires neutrophiles. Nous avons également confirmé la présence de récepteurs ETA et ETB à la surface des neutrophiles. Le récepteur ETB active une voie de signalisation responsable d’une mobilisation du calcium intra cytoplasmique, mais indépendante de l’activation de la phospho-inositide 3-kinase. Enfin, nous avons montré la capacité de ces cellules à synthétiser et excréter elles-mêmes de l’endothéline-1, pérennisant ainsi probablement la réponse inflammatoire et le recrutement leucocytaire. En conclusion, notre travail a permis de mettre en évidence le rôle important du récepteur ETB dans le recrutement des polynucléaires neutrophiles dans la drépanocytose. Ces données suggèrent que les antagonistes des récepteurs à l’endothéline pourraient être bénéfiques en prévention des phénomènes vaso-occlusifs chez les patients drépanocytaires. / Sickle cell disease is a genetic disorder affecting red blood cells, due to a point mutation in the β chain of the hemoglobin gene. However, the pathophysiology of the disease goes well beyond the erythrocyte abnormalities, including vascular and white blood cell dysfunctions that contribute to the complexity of the disease. In this project, we investigated the role of endothelin-1, a powerful vasoconstrictor peptide involved in many vascular diseases, on activation and adhesion of neutrophil in sickle cell disease.We worked on both a mouse model of sickle cell disease (SAD mice) and blood samples from patients. In mice, we performed intravital microscopy experiments, to test the in vivo effect of endothelin receptor antagonists ETA and ETB on neutrophils recruitment. On blood samples from patients with sickle cell disease, we tested in vitro adhesion of neutrophils to vascular endothelium in response to the blocking of ETA and ETB receptors. Finally, we studied the expression of ETA and ETB receptors on neutrophils and the signaling pathways resulting in their activation.In our mouse model of sickle cell disease, the inhibition of both endothelin receptors ETA and ETB limits the major leukocyte recruitment caused by an inflammatory stimulus. These results confirm the role of ETA and the more unexpected important role of ETB in all stages of neutrophil adhesion and transmigration in sickle cell context.On human samples, we demonstrated the crucial role of ETB in neutrophils adhesion. We also confirmed the expression of ETA and ETB receptors on neutrophils. ETB receptor activates a signaling pathway responsible for intracytoplasmic calcium mobilization, but not involving the activation of phosphoinositide 3-kinase. Finally, we have shown the ability of neutrophils to synthesize and secrete endothelin-1, which can contribute to sustain the inflammatory stimulation and increased leukocyte recruitment.In conclusion, our work has highlighted the important role of ETB receptor in the recruitment of neutrophils in sickle cell disease. These data suggest that the antagonists of endothelin could be beneficial in prevention of vaso-occlusive events in sickle cell patients.

La calpaïne 1 est une protéase à cystéine activée par le calcium, qui peut être partiellement externalisée. Les calpaines extracellulaires favorisent la résolution de l'inflammation et la réparation des tissus, à travers la prolifération et la migration cellulaire. Le récepteur Toll like (TLR) 2 a été identifié comme une cible des calpaïnes extracellulaires dans les lymphocytes. L'objectif est d'étudier le rôle de la calpaïne extracellulaire 1 dans la progression tumorale de l'adénocarcinome pulmonaire lepidique (ADL). La calpaïne extracellulaire, le fragment soluble de TLR2, le versican et les cytokines étaient analysés par ELISA dans des surnageants de lavage bronchoalvéolaire (LBA) de patients atteints d'ADL (n = 68). La source de calpaïne était analysée par immunohistochimie. TLR2, cible de la calpaïne extracellulaire était étudiée par cytométrie de flux sur les polynucléaires neutrophiles (PNN) et des lignées humaines de cancer bronchiques. Calpain 1 extracellulaire, sécrété par les cellules tumorales, était associée à la progression tumorale, l'inflammation à neutrophiles, avec un facteur de mauvais pronostic de survie (p = 0,003). TLR2 était exprimé sur les cellules tumorales ou les PNN avec une diminution d¿expression après traitement par calpaïne. Le fragment soluble de TLR2 était corrélée à la concentration extracellulaire de calpaïne 1 dans les surnageants de LBA (r = 0,624; p <0,001). Le fragment soluble de TLR2 élevé était associé à la progression tumorale et un environnement pro-inflammatoire La calpain extracellulaire sécrétée par la cellule tumorale, favorise un microenvironnement inflammatoire et la progression tumorale médiée par TLR2 dans ADL. / Calpain 1 is pro inflammatory calcium-activated cysteine proteases, which can be partly externalized. Extracellular calpains limit inflammatory processes and promote tissue repair, through cell proliferation and migration. Toll like receptor (TLR) 2 has been identified as a target of extracellular calpains in lymphocytes. The aim was to investigate the role of extracellular calpain 1 in tumor progression of lepidic pulmonary adenocarcinoma (LPA). Extracellular calpain 1, soluble fragment of TLR2 and cytokines were analyzed by ELISA in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) supernatants from patients with LPA (n=68). Source of calpain was analyzed by immunohistochemistry. TLR2 as target of extracellular calpain was studied by flow cytometry on polymorphonuclear neutrophils (PMN) and human lung cancer cell lines. Extracellular Calpain 1, secreted by tumor cells, was associated to tumor progression, neutrophilic inflammation, with a poor prognostic factor on survival (p=0,003). TLR2 was expressed on PMN or tumor cells and decreased after calpain treatment. The soluble fragment of TLR2 was correlated to the extracellular calpain 1 concentration in the BALF supernatants (r=0.624; p<0.001). High soluble fragment of TLR2 was associated with tumor progression and a pro-inflammatory environment. Extracellular Calpain 1 secreted by tumor cell, promotes inflammatory microenvironment and tumor progression through TLR2 in LPA.

Les polynucléaires neutrophiles ont longtemps été considérés comme des cellules n’intervenant que dans la réponse immune innée. Cependant, au cours de ces dernières années, de nombreuses publications suggèrent que ces cellules, retrouvées au sein du microenvironnement de nombreux cancers, pourraient également jouer un rôle dans la tumorigénèse et la progression tumorale. Ces études mettent en évidence leur fréquence comme marqueur pronostique dans différents cancers solides, mais peu de travaux se sont intéressés à la caractérisation fonctionnelle de ces cellules dans la progression tumorale. Dans de nombreux cancers dont les lymphomes B issus du centre germinatif, les cellules tumorales, qui sont incapables de proliférer et de survivre seules, sont dépendantes de leur microenvironnement de soutien. Dans cette étude, nous avons évalué la fonctionnalité des polynucléaires neutrophiles dans la croissance des lymphomes B. Ainsi, nous avons démontré pour la première fois que les polynucléaires neutrophiles soutiennent directement la croissance et la survie des cellules tumorales de lymphomes B. De plus, un dialogue bidirectionnel existe entre les polynucléaires neutrophiles et les cellules stromales. D’une part, les cellules stromales soutiennent la survie des polynucléaires neutrophiles, qui en retour induisent les caractéristiques d’un stroma lymphoïde. L’induction de ce phénotype permet aux cellules stromales d’acquérir de meilleures capacités de soutien envers les cellules tumorales. Cette étude confirme donc que les polynucléaires neutrophiles sont une composante importante du microenvironnement tumoral, et pourraient devenir une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement des lymphomes B issus du centre germinatif. / For long time, neutrophils have only been considered as cells involved in the innate immune response. More recently, in descriptive publications, neutrophils were found in the microenvironment of many solid cancers, hypothesizing that they could also play a role in tumorigenesis and cancer progression. These studies highlighted the prognostic value of their frequency, but few of them focused on the functional characterization of these cells in tumor growth. In many cancers, including germinal centre-derived B-cell lymphomas, tumor cells are dependent on their microenvironment to proliferate and survive. In this study, we focused on the role of neutrophils in the progression of B-cell lymphomas, and for the first time we demonstrated that neutrophils directly support the growth and survival of tumor Bcells. In addition, we highlighted the existence of bidirectional cooperation between neutrophils and stromal cells. In one hand stromal cells support the survival of neutrophils. On the other hand, neutrophils induce a lymphoid stroma phenotype which is well known to enhance their supportive effect on tumor cells. This study demonstrates that neutrophils are a significant component of the tumor microenvironment and may be considered as a potential therapeutic target for the treatment of B-cell lymphomas.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoiétique (CSH) caractérisées par une prolifération accrue de cellules sanguines. Une mutation activatrice de la protéine JAK2 (JAK2V617F) a été identifiée chez plus de 50% des patients. La survenue de thromboses au niveau artériel et veineux constitue une des principales complications au cours de ces maladies. Au cours d’un premier axe de travail, nous avons souhaité étudier les conséquences sur la physiopathologie de la thrombose de la présence de la mutation JAK2V617F dans les cellules endothéliales (CE). Utilisant deux approches complémentaires, in vitro avec l’utilisation de cellules endothéliales veineuses, et in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin permettant la présence de la mutation JAK2V617F dans le compartiment endothélial, nous avons démontré que la présence de CE JAKV617F favorisait la survenue de thrombose. Cette augmentation de la survenue de thrombose était médiée par une augmentation de l’adhésion des leucocytes au niveau des CE JAK2V617F, secondaire à une augmentation d’expression de P-Sélectine à leur surface. Ce travail a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de la physiopathologie de la thrombose au cours des NMP JAK2V617F. Au cours d’un second axe de travail, nous avons étudié les polynucléaires neutrophiles (PNN) et le phénomène de NETose (formation de neutrophil extracellular traps ou NET) au cours des NMP. Nous avons démontré que la formation de NET était augmentée dans une cohorte de patients avec NMP, tout comme des marqueurs indirects de NETose (ADN plasmatique, MPO-ADN plasmatique). Nous avons mis en évidence que les taux de MPO-ADN plasmatique étaient plus élevés chez les patients avec antécédents de thrombose par rapport aux patients sans. Nous avons confirmé ces résultats à l’aide de deux modèles murins différents dans lesquels nous avons également retrouvé une formation de NET augmentée. Nous avons mis en évidence que cette formation de NET participait à la physiopathologie de la thrombose, l’administration de DNAse entraînant une réduction de la survenue de thrombose. Enfin, nous avons démontré que les plaquettes JAK2V617F stimulaient la production de NET par les PNN JAK2V617F, suggérant une collaboration de ces deux types cellulaires au cours de la physiopathologie de la thrombose des NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are acquired hematologic diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by blood cell proliferation. An activating mutation of the protein JAK2 (JAK2V617F) has been identified in more than 50% of patients. The occurrence of arterial and venous thrombosis is one of the main complications during these diseases. We first studied the consequences of the presence of the JAK2V617F mutation in endothelial cells (EC) on the physiopathology of thrombosis. We used two complementary approaches, in vitro with the use of human venous endothelial cells, and in vivo with the use of a mouse model allowing the presence of the JAK2V617F mutation only in the endothelial compartment: the PDGFb-iCreERT2;JAK2V617F/WT model. We first observed that PDGFbiCreERT2; JAK2V617F/WT mice displayed a higher propensity for thrombosis. This increased thrombus formation was mediated by an increased leukocyte adhesion in presence of JAK2V617F EC, secondary to an increase in P-Selectin expression at their surface. This work made it possible to highlight a new mechanism of the physiopathology of thrombosis during JAK2V617F MPN. Then we studied neutrophils and the phenomenon of NETosis (formation of neutrophil extracellular traps or NET) during MPN. We demonstrated that NET formation was increased in a cohort of patients with MPN, such as indirect markers of NETosis (plasmatic DNA and MPO-DNA). We found that plasma MPO-DNA levels were higher in patients with a history of thrombosis compared to patients without. We confirmed these results using two different mouse models in which we also found increased NET formation. We found that NET formation was involved in the physiopathology of thrombosis, as DNAse administration resulted in a reduction of thrombosis occurrence. Finally, we demonstrated that JAK2V617F platelets stimulated NET formation by JAK2V617F neutrophils, suggesting collaboration of these two cell types during the physiopathology of thrombosis during MPN.

L’immunothérapie en agissant au niveau de la tumeur primitive et en empêchant le développement des métastases constitue une des stratégies du traitement des patients atteints de cancer. Afin d’améliorer l’efficacité de celle-ci, il est nécessaire de comprendre comment est induit la mort des cellules tumorales. Dans le laboratoire, il a été observé la guérison de rats BDIX porteurs de tumeurs PROb par un triacyl lipide A. Il a été montré que cet effet impliquait le système immunitaire en mettant en jeu des interactions avec les TLR présents sur de nombreuses cellules tumorales et de l’immunité innée comme les neutrophiles.Dans ce travail, nous avons étudié l’implication éventuelle des neutrophiles dans l’activité anti tumorale du triacyl lipide A chez l’homme.Dans une étude de phase 1 chez des patients porteurs de tumeurs solides réfractaires, nous avons montré que le triacyl lipide A était bien toléré et qu’il induisait la sécrétion de cytokines impliquées dans la réponse immunitaire et notamment dans le recrutement des neutrophiles. Nous avons ensuite, dans un second temps démontré l’implication éventuelle des neutrophiles dans cette réponse immunitaire en vérifiant leur présence dans des tumeurs coliques humaines et en analysant leur proximité avec les cellules tumorales, ces deux facteurs déterminant leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules tumorales. Nous avons ensuite fait une analyse comparative par rapport au tissu sain pour rechercher si ces neutrophiles étaient activés et comparer l’expression de chimio attractants. / Immunotherapy acting at the primary tumor site and preventing the development of metastases is one of the strategies for treatment of patients with cancer. To improve the efficiency of the latter, it is necessary to understand how it induces tumor cell death. In the laboratory, it was observed the cure of PROb tumors in rats BDIX by the triacyl lipid A. It has been shown that this effect involved the immune system involving interactions with TLRs present in many tumor cells and innate immunity cells such as neutrophils.In this work, we investigated the possible involvement of neutrophils in the antitumor activity of triacyl lipid A in humans.In a Phase 1 study in patients with refractory solid tumors, we showed that the triacyl lipid A was well tolerated and induced the secretion of cytokines involved in the immune response, particularly in the recruitment of neutrophils. Then, in a second part, we demonstrated the prospective involvement of neutrophils in the immune response by checking their presence in human colon cancers and analyzing their proximity to tumor cells, these two factors determining their cytotoxicity to cells tumor. Then we made a comparative analysis with healthy tissue to research whether these neutrophils were activated and compare the expression of chemo attractors.

Le bacille de la peste, Yersinia pestis, a une vie parasitaire au cours de laquelle il oscille le plus souvent d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire des puces, et plus rarement par voie aéroportée. Comme tel, Yersinia pestis doit rapidement ressentir et répondre aux variations brutales de son environnement afin se maintenir dans la nature. C’est pourquoi, nous avons étudié le rôle des systèmes de régulation à deux composants dans la peste compte tenu que ces systèmes sont connus pour avoir un rôle clef dans l’adaptation des bactéries aux changements environnementaux. En plus du système PhoP-PhoQ dont l’importance chez le mammifère et la puce a été précédemment révélée, nous avons découvert que quatre systèmes sont requis pour le cycle de la peste. Plus particulièrement, l'un d'entre eux permet une colonisation optimale du tube digestif de la puce alors que les 3 autres systèmes sont impliqués dans la production de biofilm, un processus indispensable à une transmission optimale du bacille par les puces. Nous avons aussi découvert que le système OmpR-EnvZ est l’unique système, en plus du système PhoP-PhoQ, requis pour la production de la peste bubonique, septicémique et pulmonaire. Nos travaux, menés in vitro, ex-vivo et in vivo suggèrent que le rôle du système OmpR-EnvZ serait de protéger la bactérie contre les effecteurs toxiques sécrétés par les polynucléaires neutrophiles dans les tissus et, ceci tout au long du processus infectieux. / Plague bacillus, Yersinia pestis has a parasitic lifestyle in which it is mainly transmitted between mammilian hosts through the bite of infected fleas, and in rare cases through infected droplets. Thus, Yersinia pestis must rapidly sense and respond to wide and brutal changes of its environment in order to survive. We aimed at decipher the role of two component regulatory systems in plague, as they are known to be key players in bacterial adaptation to the environment. In addition to the already described PhoP-PhoQ system, we found out that four systems are required for plague cycle. We showed that one of these systems is important for an optimal colonization of the flea's digestive tract, while the three others are required for biofilm production, an essential step in the bacillus transmission by the fleas. We also found out that OmpR-EnvZ, in addition to PhoP-PhoQ, is the only one to be important to produce bubonic, septicemic and pulmonary plague. Our in vitro, ex-vivo and in vivo works suggest that the OmpR-EnvZ system would be to protect bacterial against toxic effectors that are produced by polymorphonuclear leukocytes all along the infectious process.

L'immunothérapie en agissant au niveau de la tumeur primitive et en empêchant le développement des métastases constitue une des stratégies du traitement des patients atteints de cancer. Afin d'améliorer l'efficacité de celle-ci, il est nécessaire de comprendre comment est induit la mort des cellules tumorales. Dans le laboratoire, il a été observé la guérison de rats BDIX porteurs de tumeurs PROb par un triacyl lipide A. Il a été montré que cet effet impliquait le système immunitaire en mettant en jeu des interactions avec les TLR présents sur de nombreuses cellules tumorales et de l'immunité innée comme les neutrophiles.Dans ce travail, nous avons étudié l'implication éventuelle des neutrophiles dans l'activité anti tumorale du triacyl lipide A chez l'homme.Dans une étude de phase 1 chez des patients porteurs de tumeurs solides réfractaires, nous avons montré que le triacyl lipide A était bien toléré et qu'il induisait la sécrétion de cytokines impliquées dans la réponse immunitaire et notamment dans le recrutement des neutrophiles. Nous avons ensuite, dans un second temps démontré l'implication éventuelle des neutrophiles dans cette réponse immunitaire en vérifiant leur présence dans des tumeurs coliques humaines et en analysant leur proximité avec les cellules tumorales, ces deux facteurs déterminant leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules tumorales. Nous avons ensuite fait une analyse comparative par rapport au tissu sain pour rechercher si ces neutrophiles étaient activés et comparer l'expression de chimio attractants.

La Polyarthrite Rhumatoïde est caractérisée par une synovite à l'origine de lésions progressives ostéo-articulaires induites par les formes réactives de l'oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN). La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d'un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s'associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). Nous avons étudié la spécificité de l'interaction entre la (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) et la NADPH oxydase des PMN. D'autre part, nous avons caractérisé les domaines de l'hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l'empreinte de l'activation du PMN dans la PR.Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l'affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l'enzyme majeure de la régulation de la glycolyse, voie est essentielle pour la production d'ATP du PMN. L'utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a révélé l'empreinte de l'activation du PMN dans cette pathologie avec une surexpression des protéines S100A8 et S100A9. Une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence.En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l'hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d'activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la PR, l'activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles.

La Polyarthrite Rhumatoïde est caractérisée par une synovite à l’origine de lésions progressives ostéo-articulaires induites par les formes réactives de l’oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN). La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d’un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s’associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). Nous avons étudié la spécificité de l’interaction entre la (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) et la NADPH oxydase des PMN. D’autre part, nous avons caractérisé les domaines de l’hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l’empreinte de l’activation du PMN dans la PR.Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l’affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l’enzyme majeure de la régulation de la glycolyse, voie est essentielle pour la production d’ATP du PMN. L’utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a révélé l’empreinte de l’activation du PMN dans cette pathologie avec une surexpression des protéines S100A8 et S100A9. Une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence.En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l’hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d’activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la PR, l’activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles. / Rheumatoid Arthritis (RA) is caused by an inflammation of the synovial membrane leading to progressive joint destruction and deformation, related to the production NADPH oxidase related-reactive oxygen species (ROS) production. The phagocyte NADPH oxidase is a multi-protein complex formed by a catalytic core, i.e. the transmembrane cytochrome b558 and cytosolic regulators (p67phox, p47phox, p40phox and Rac1/2). We aimed at better analyzing the NADPH oxidase activation through the evaluation of the specificity of the interaction with 6PGDH or PFK2 and through the further analysis of the association with the S100A8/A9 heterocomplex. The RA-specific protein profiling was conducted in order to determine whether a PMN activation fingerprint could be revealed among RA specific proteins.Upon PMA stimulation, both 6PGDH and PFK2 co-imunoprecipitated with cytosolic factors p67phox, p47phox and p40phox. At the plasma membrane level, confocal microscopy experiments suggested a co-localization of either 6PGDH or PFK2 with the phagocyte NADPH oxidase in lipid rafts. 6PGDH enhanced the phagocyte NADPH oxidase activity by both improving the availability of cytosolic NADPH content and by increasing the affinity of the NADPH oxidase for its substrate. PFK2 also augmented the NADPH oxidase activity. PFK2 modulated the ATP concentration available for the phosphorylation of the phagocyte NADPH oxidase components and for the NDP Kinase related-Rac activation. The generation of truncated S100A8/S100A9 heterodimer chimera could reveal that the C-terminal region of S100A8 is involved in both the interaction and the activation of the phagocyte NADPH oxidase.In vivo, synovial fluid of RA patients was remarkably labelled with the PMN activation fingerprint. S100A8 and S100A9 proteins clearly distinguished RA synovial fluid from osteoarthritis and non RA-synovial fluids. An ectopic production of S100A8/S100A9 was shown in RA fibroblast like synoviocyte.In conclusion, 6PGDH, PFK2 and S100A8/A9 proteins are surrogate activating partners of the phagocyte NADPH oxidase. In RA, the activation of PMNs leads to the release of S100A8/A9 proteins which may constitute interesting biomarkers and promising therapeutic targets.

La leishmaniose viscérale est une maladie systémique mortelle en l’absence de traitement. Elle est due aux protozoaires Leishmania donovani et L. infantum, parasites des phagocytes mononucléés, capables d’envahir les organes lymphoïdes et le foie. Le contrôle de l’infection hépatique repose sur la mise en place d’une réponse granulomateuse efficace, promue par une réponse immunitaire Th1, dans un environnement tissulaire Th2. L’objectif de ce travail était l'étude du rôle d’une cytokine Th2 récemment décrite, l’IL-33, dans cette réponse hépatique complexe encore partiellement incomprise. Des dosages d’IL-33 sur des sérums de patients et la détection de cellules IL-33+ dans le foie d’un patient rennais ont placé l’IL-33 comme un biomarqueur possible de la maladie active. L’IL-33 étant exprimée dans les cellules étoilées du foie au cours d’hépatites chroniques, ces cellules ont été exposées à L. donovani. Leur permissivité aux leishmanies sans toxicité apparente ni perturbation de leurs propriétés fonctionnelles, ainsi que la persistance des leishmanies sur une culture de plusieurs semaines, nous ont conduit à proposer les cellules étoilées comme cellules sanctuaires possibles pour les leishmanies viscérotropes, contribuant donc potentiellement au portage asymptomatique. En revanche, elles ne sont pas apparues comme une source majeure d'IL-33 au cours de la leishmaniose viscérale. Chez des souris C57BL/6 et BALB/c infectées par L. donovani, l'IL-33 a été observée dans des cellules ne s'apparentant pas à des cellules étoilées, et principalement localisées dans les granulomes. Des cellules exprimant son récepteur ST2 ayant été également observées dans le foie, un rôle de l’axe IL-33/ST2 a été recherché. Les résultats obtenus chez des souris BALB/c déficientes en ST2 ou traitées par de l'IL-33 recombinante suggèrent que l'IL-33 régule négativement l'expression de cytokines Th1 (IL-12, IFN-γ) et l'infiltrat de neutrophiles et monocytes dans le foie, limitant ainsi le contrôle de la charge parasitaire. Ainsi, l'IL-33 semble être un facteur de susceptibilité pour la leishmaniose viscérale. En parallèle, des travaux entrepris sur des souris C57BL/6 infectées par L. donovani suggèrent de possibles rôles différentiels de l'IL-33 en fonction de l'environnement immunitaire inhérent au fond génétique de l'hôte. / Visceral leishmaniasis is a life-threatening systemic disease caused by Leishmania protozoans, L. donovani and L. infantum, which invade mononuclear phagocytes in the lymphoid organs and the liver. The control of the hepatic parasite burden depends on the granuloma formation, which is favored by a Th1 immune response in a Th2 tissue microenvironment. The aim of this work was to study the role of the recently described Th2 cytokine IL-33 in this complex immune response, which remains partially misunderstood. IL-33 dosages in different patient sera and IL-33+ cells detected in the liver of a patient from Rennes suggested that IL-33 could be a biomarker for active visceral leishmaniasis. As IL-33 was described in hepatic stellate cells during chronic hepatitis, these cells were exposed to L. donovani in primary culture. The cell permissivity to L. donovani and the parasite persistence during a long term culture led us to propose hepatic stellate cells as a new type of sanctuary cells, which could partially explain asymptomatic carriage. However, these cells were apparently not the main source of IL-33 during visceral leishmaniasis. In infected BALB/c and C57BL/6 mice, IL-33 was detected in the liver in non stellate cells preferentially localized in granulomas. The presence of cells expressing its specific receptor ST2 in the liver led us to explore the role of the IL-33/ST2 axis. BALB/c mice deficient in ST2 or treated with recombinant IL-33 and infected with L. donovani revealed that IL-33 downregulates the expression of Th1 key cytokines (IL-12, IFN-γ) and the recruitment of neutrophils and monocytes. Finally, IL-33 acts as a susceptibility factor during visceral leishmaniasis. Besides, the model of L. donovani infected C57BL/6 mice deficient in IL-33 or treated with recombinant IL-33 suggests possible differential roles of IL-33 depending on the immune environment related to the host genetic background.