Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoiétique (CSH) caractérisées par une prolifération accrue de cellules sanguines. Une mutation activatrice de la protéine JAK2 (JAK2V617F) a été identifiée chez plus de 50% des patients. La survenue de thromboses au niveau artériel et veineux constitue une des principales complications au cours de ces maladies. Au cours d’un premier axe de travail, nous avons souhaité étudier les conséquences sur la physiopathologie de la thrombose de la présence de la mutation JAK2V617F dans les cellules endothéliales (CE). Utilisant deux approches complémentaires, in vitro avec l’utilisation de cellules endothéliales veineuses, et in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin permettant la présence de la mutation JAK2V617F dans le compartiment endothélial, nous avons démontré que la présence de CE JAKV617F favorisait la survenue de thrombose. Cette augmentation de la survenue de thrombose était médiée par une augmentation de l’adhésion des leucocytes au niveau des CE JAK2V617F, secondaire à une augmentation d’expression de P-Sélectine à leur surface. Ce travail a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de la physiopathologie de la thrombose au cours des NMP JAK2V617F. Au cours d’un second axe de travail, nous avons étudié les polynucléaires neutrophiles (PNN) et le phénomène de NETose (formation de neutrophil extracellular traps ou NET) au cours des NMP. Nous avons démontré que la formation de NET était augmentée dans une cohorte de patients avec NMP, tout comme des marqueurs indirects de NETose (ADN plasmatique, MPO-ADN plasmatique). Nous avons mis en évidence que les taux de MPO-ADN plasmatique étaient plus élevés chez les patients avec antécédents de thrombose par rapport aux patients sans. Nous avons confirmé ces résultats à l’aide de deux modèles murins différents dans lesquels nous avons également retrouvé une formation de NET augmentée. Nous avons mis en évidence que cette formation de NET participait à la physiopathologie de la thrombose, l’administration de DNAse entraînant une réduction de la survenue de thrombose. Enfin, nous avons démontré que les plaquettes JAK2V617F stimulaient la production de NET par les PNN JAK2V617F, suggérant une collaboration de ces deux types cellulaires au cours de la physiopathologie de la thrombose des NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are acquired hematologic diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by blood cell proliferation. An activating mutation of the protein JAK2 (JAK2V617F) has been identified in more than 50% of patients. The occurrence of arterial and venous thrombosis is one of the main complications during these diseases. We first studied the consequences of the presence of the JAK2V617F mutation in endothelial cells (EC) on the physiopathology of thrombosis. We used two complementary approaches, in vitro with the use of human venous endothelial cells, and in vivo with the use of a mouse model allowing the presence of the JAK2V617F mutation only in the endothelial compartment: the PDGFb-iCreERT2;JAK2V617F/WT model. We first observed that PDGFbiCreERT2; JAK2V617F/WT mice displayed a higher propensity for thrombosis. This increased thrombus formation was mediated by an increased leukocyte adhesion in presence of JAK2V617F EC, secondary to an increase in P-Selectin expression at their surface. This work made it possible to highlight a new mechanism of the physiopathology of thrombosis during JAK2V617F MPN. Then we studied neutrophils and the phenomenon of NETosis (formation of neutrophil extracellular traps or NET) during MPN. We demonstrated that NET formation was increased in a cohort of patients with MPN, such as indirect markers of NETosis (plasmatic DNA and MPO-DNA). We found that plasma MPO-DNA levels were higher in patients with a history of thrombosis compared to patients without. We confirmed these results using two different mouse models in which we also found increased NET formation. We found that NET formation was involved in the physiopathology of thrombosis, as DNAse administration resulted in a reduction of thrombosis occurrence. Finally, we demonstrated that JAK2V617F platelets stimulated NET formation by JAK2V617F neutrophils, suggesting collaboration of these two cell types during the physiopathology of thrombosis during MPN.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des hémopathies myéloïdes clonales, chroniques et prolifératives. Les plus fréquentes sont la polyglobulie de Vaquez et la thrombocytémie essentielle. Elles s’accompagnent de risques importants de thrombose (artérielles et veineuses) et de transformation en pathologies plus agressives (myélofibrose secondaire et leucémie aigüe). Les thromboses peuvent être la situation diagnostique de ces maladies, ou survenir au cours de la prise en charge. Le sujet de cette thèse est d’étudier la relation clinique entre NMP et thrombose. Dans un contexte de survenue de thrombose veineuse idiopathique, sans antécédent NMP, nous nous sommes intéressés à la recherche de mutation clonale chez les patients comme moyen diagnostique d’une NMP. Nous avons ainsi exploité la cohorte EDITH du CIC en prenant les patients ayant expérimentés un puis une récurrence thrombotique. A l’inverse, nous avons constitué une base de données (OBENE) des patients pris en charge pour une NMP au CHRU de Brest.Nous avons ensuite exploité cette base, en analysant la fréquence et l’impact des arythmies cardiaques auriculaires, la balance bénéfice-risque à l’utilisation des NACO, l’impact des statines sur la réduction du risque de thrombose ainsi que la fréquence et l’impact de la nonadhérence aux traitements dans les PV et TE.NMP et thromboses sont liées, il est donc nécessaire d’approfondir les connaissances de leur physiopathologie spécifique pour améliorer la prévention et le traitement des épisodes. Cette thèse amène quelques réponses àcertaines questions mais elle est surtout le point de départ de réflexion commune entre les praticiens et biologistes intéressés par ces domaines. / The myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal myeloid, chronic and proliferative disorders. The most frequent are polycythemia vera and essential thrombocythemia. The more frequent complications are thromboses (arterial and venous) and phenotypic evolutions (secondary myelofibrosis and acute leukemia). Thromboses can be a situation of diagnosis or observed during the followup of a MPN. This thesis is focused on the clinical link between MPN and thromboses.In a context of idiopathic venous thromboses (first event or recurrence), without medical history of MPN, we have tested patients for the most frequent MPN clonal mutations. So, we have used the informations and patients of the dedicated EDITH cohort.On the other hand, we have constituted a MPN database (OBENE) of the patients diagnosed for MPN in our Hospitalcentre. By this way, we have analysed the frequency and impact of atrial arrhythmias, the benefit-risk balance of the use of DOAC, the impact of statins to reduce the thrombotic risk and the frequency and impact of the treatment nonadherence in this population.MPN and thromboses are linked, so it is necessary to increase our knowledge of their physiopathology to improve prevention and treatment of the events. This thesis brings some answers to some questions but, she is almost the starting point of common reflexion between clinicians and biologists interested in these domains.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoïétique. Une mutation activatrice de la protéine de signalisation JAK2, JAK2V617F, a été identifiée chez la moitié des patients atteints de NMP Philadelphie négatives. Il a été rapporté que les patients avec des NMP avaient une augmentation du risque thrombotique et de la densité microvasculaire dans la rate et la moelle osseuse, sans explication physiopathologique claire. Des travaux récents ont mis en évidence la présence de la mutation JAK2V617F non seulement dans les cellules sanguines mais également dans les cellules endothéliales (CE) de ces patients. Nous faisons l’hypothèse que la présence de JAK2V617F dans les CE pourrait modifier leurs propriétés expliquant l’augmentation de l’angiogenèse dans les NMP. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons voulu étudier le phénotype angiogénique des cellules endothéliales portant la mutation JAK2V617F. In vitro, nous disposons des particules lentivirales permettant d’obtenir des CE JAK2V617F par transduction lentivirale. In vivo, nous disposons des souris transgéniques exprimant la mutation JAK2V617F de manière conditionnelle (JAK2V617F/WT) grâce à la stratégie Cre-lox. Pour répondre à notre hypothèse, il été nécessaire de travailler avec des modèles murins exprimant la mutation JAK2V617F spécifiquement dans les CE sans atteinte concomitante de la lignée hématopoïétique. Dans un premier temps, nous avons voulu caractériser deux modèles endothéliaux inductibles couramment utilisés, Cdh5(PAC)-CreERT2 et Pdgfb-iCreERT2, en termes d’efficacité et de spécificité de recombinaison dans les cellules endothéliales vis-à-vis du compartiment hématopoïétique. Nous avons démontré que les souris adultes Cdh5(PAC)-CreERT2 pouvaient être utilisées comme modèles endothéliaux spécifiques, avec toutefois la mise en garde que la recombinaison est très variable entre les souris. Nous avons constaté que les souris PDGFB-iCreERT2 sont appropriées pour cibler les cellules endothéliales dans une large gamme d’organes à l'exception du foie, et devraient être utilisées dans les quatre premières semaines qui suivent l'induction, pour cibler un gène d’intérêt au niveau des cellules endothéliales, sans qu’il ait une atteinte concomitante dans la lignée hématopoïétique. Nous avons ensuite étudié les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales JAK2V617F, in vitro en utilisant des HUVEC transduites avec un lentivirus permettant l’expression de JAK2V617F, et in vivo avec les souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. Nous avons démontré que les HUVEC JAK2V617F avaient un profil proangiogénique lié à une capacité proliférative élevée, résultant de l’activation de la voie JAK2/STAT3/PI3K. L’avantage hyperprolifératif que confère la mutation JAK2V617F aux cellules endothéliales a été confirmé in vivo avec le modèle de la vascularisation post-natale de la rétine, avec toutefois une diminution de la densité du réseau vasculaire due à une augmentation de la régression vasculaire au niveau de la rétine des souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are acquired hematopoietic stem cell disorders. An activating mutation in the JAK2 signaling protein, JAK2V617F, was identified in half of the patients with Philadelphia chromosome-negative MPNs. It has been reported that patients with MPN had an increased risk of thrombosis but also an increased microvessel density in the spleen and bone marrow with no clear pathophysiological explanation. Several recent studies have demonstrated the presence of JAK2V617F mutation not only in blood cells but also in endothelial cells (EC) in MPN patients. We hypothesized that the presence of JAK2V617F in EC could change their properties leading to an increased angiogenesis process in MPNs. To address this question, our aim was to study the angiogenic phenotype of endothelial cells carrying the JAK2V617F mutation. For the in vitro experiments, we used lentiviral transduction of human JAK2V617F in EC. For the in vivo approach, we used transgenic mice (JAK2V617F/WT) that conditionally express JAK2V617F through Cre-lox strategy. To investigate our hypothesis, it was necessary to work with mice that express JAK2V617F specifically in EC without concomitant expression in hematopoietic cells. We first characterized two commonly-used inducible endothelial models, Cdh5(PAC)-CreERT2 and Pdgfb-iCreERT2, in terms of efficiency and specificity of recombination in endothelial cells. We showed that adult Cdh5(PAC)-CreERT2 mice can be used as specific endothelial model with however the wariness that recombination is highly variable among mice. We found that Pdgfb-iCreERT2 mice are appropriate to target endothelial cells in a wide range of organs except liver, and should be used within the four weeks after induction of Cre-mediated recombination to target a gene of interest in endothelial cells, without having a concomitant expression in hematopoietic lineage. We then studied the angiogenic properties of JAK2V617F endothelial cells, in vitro using JAK2V617F transduced HUVECs, and in vivo using Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice. We observed that JAK2V617F HUVECs had a proangiogenic profile that was related to a highly proliferative potency, and that this phenotype results from a constitutive activation of JAK2/STAT3/PI3K pathway. The hyperproliferative advantage conferred by JAK2V617F to endothelial cells was confirmed in vivo using the postnatal vascularization model of the retina, with however a decrease in the density of the vascular network due to an increased vascular regression in Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice’s retinas.