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Les récoltes de céréales sont souvent contaminées par des moisissures qui se développent pendant la récolte et l’entreposage et produisent des métabolites secondaires appelés mycotoxines. Le porc est reconnu pour être sensible au déoxynivalénol (DON). L’infection virale la plus importante chez le porc est causée par le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP). Celui-ci provoque un syndrome grippal et des troubles de reproduction. L’objectif du présent projet était de déterminer l'effet in vitro de DON sur la réplication du VSRRP dans de lignées cellulaires permissives, MARC-145 et PAM, et déterminer in vivo l'impact de DON dans des aliments naturellement contaminés sur l’infection au VSRRP chez le porcelet. Tout d’abord, les cellules ont été incubées avec des doses croissantes de DON et ont été infectées avec du VSRRP pour évaluer la viabilité et la mortalité cellulaire, la réplication virale et l’expression de cytokines. Les résultats ont montré que les concentrations de DON de 560ng/ml et plus affectaient significativement la survie des cellules MARC-145 et PAM infectées par le VSRRP. En revanche, il y avait une augmentation significative de la viabilité et une réduction de la mortalité cellulaire à des concentrations de DON de 140 à 280 ng/ml pour les cellules PAM et de 70 à 280 ng/ml pour les cellules MARC-145 avec une réduction de l'effet cytopathique provoqué parle VSRRP. Au niveau in vivo, 30 porcelets divisés en 3 groupes de 10 porcelets et nourris pendant 2 semaines avec 3 différentes diètes naturellement ont été contaminées avec DON (0; 2,5 et 3,5 mg/kg). Les porcelets ont été subdivisés en 6 groupes, 3 groupes de 6 porcelets et ont été exposés au DON pendant 2 semaines et infectés par voie intratrachéale et intramusculaire avec le virus. Les 3 autres groupes de 4 porcelets servaient de contrôle non infectés. Les signes cliniques ont été enregistrés pendant 21 jours. La virémie a été évaluée par PCR. À la fin de l’expérimentation, les porcelets ont été euthanasiés et les lésions pulmonaires ont été évaluées. Les résultats ont montré que l’ingestion de DON à 3,5 mg/kg a augmenté l’effet du VSRRP sur la sévérité des signes cliniques, les lésions pulmonaires et la mortalité. L’ingestion de DON à 2,5 mg/kg a entrainé une augmentation de la virémie au jour 3 après l’infection mais sans impact sur les signes cliniques et les lésions pulmonaires. Mot clés: DON, VSRRP, MARC-145, PAM, effet cytopathique, cytokines, PCR / Cereal crops are often contaminated with moulds that grow during harvest and storage and produce secondary metabolites called mycotoxins. Pig is known to be sensitive to deoxynivalenol (DON). On the other hand, infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) causes a flu-like syndrome and reproductive disorders. The objectives of this project were to determine the in vitro effect of DON on the replication of PRRSV in permissive cell lines, MARC-145 and PAM and the in vivo impact of DON-naturally contaminated feed on PRRSV infection in piglets. Firstly, cells were incubated with gradually increasing doses of DON and were infected with PRRSV to evaluate cytopathic effect and to assess cell viability, virus replication and cytokine mRNA expression on infected and uninfected cells. Results showed that DON concentrations of 560 ng/ml and higher were significantly detrimental to the survival of MARC-145 cells infected with PRRSV. In contrast, there was a significant increase of cell viability and decreased of cell mortality at DON concentrations within 140 to 280 ng/ml for PAM cells and 70 to 280 ng/ml ranges for MARC-145 showing a reduced cytopathic effect (CPE) caused by PRRSV. In vivo study was carried out on 30 piglets divided into 3 groups of 10 piglets fed naturally contaminated diets with different levels of DON; 0, 2.5 and 3.5 mg/kg. After 2 weeks, pigs were further divided into 6 subgroups, 3 subgroups of 6 piglets were infected intra tracheally and intramuscularly with PRRSV. The other 3 subgroups of 4 piglets were used as uninfected controls. Clinical signs were recorded for 21 days post-infection (p.i.). Sera were evaluated for viremia by PCR. At the end of the experiment, piglets were euthanized and pulmonary lesions were evaluated. Results showed that ingestion of diet highly contaminated with DON at 3.5 mg/kg increased the effect of PRRSV infection on the severity of clinical signs, weight loss, lung lesions and mortality. Diet with DON at 2.5 mg/kg showed an increase of viremia at day 3 but had not significant impact on clinical signs and lung lesions. Keywords: DON, PRRSV, MARC-145, PAM, cytopathic effect, cytokines, PCR

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Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une des maladies les plus dévastatrices économiquement pour l'industrie mondiale du porc. L'agent étiologique du SRRP est le virus du SRRP (VSRRP) lequel est connu pour avoir une spécificité d'hôte très restreinte et pour sa transmission par voie aerosol. Les antigènes et les ARN du VSRRP ont été trouvés dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire de porcs infectés par le virus. L’interaction entre les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et le VSRRP a été démontrée comme jouant un rôle important dans l’infection causée par le virus. Malgré cela, l’interaction prenant place entre les cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin et le virus ne devrait pas être négligée. Jusqu’à présent, la réplication du VSRRP in vitro dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin n’a pas été conduite avec succès et les tentatives pour le faire ont échoué. Une nouvelle lignée de cellules épithéliales de poumon de porc (SJPL) est maintenant disponible et sera utilisée dans cette étude afin de déterminer si elle est permissive à la réplication du VSRRP et si elle peut être un modèle approprié pour l’étude de la pathogénèse virale du VSRRP. L’expérimentation a démontré que cette nouvelle lignée cellulaire était permissive à l’infection et à la réplication du VSRRP. Afin de corroborer ces résultats, la cinétique de réplication du virus à été effectuée avec les cellules MARC-145 et SJPL. Aucune différence significative dans la production virale totale n’a été trouvée entre les deux lignées cellulaires. Les cellules SJPL ont permis la réplication de plusieurs souches Nord-Américaines du VSRRP, quoiqu’elles sont légèrement moins efficaces que les cellules MARC-145 pour l’isolement du virus. De plus, les cellules SJPL sont phénotypiquement différentes des cellules MARC-145. Plus précisément, les cellules SJPL sont plus sensibles à l’activation par le VSRRP des pro-caspases 3/7 et plusieurs inducteurs apoptotiques. Elles ont également montré de 8 à 16 fois plus de sensibilité à l’effet antiviral causé par l’IFN-α sur la réplication du virus contrairement aux cellules MARC-145. Ces résultats démontrent que les cellules SJPL pourraient représenter un substitut intéressant aux cellules MARC-145 pour la production d’antigènes pour un vaccin anti-VSRRP. Également, dû à leurs origines (poumon de l’hôte naturel), elles pourraient s’avérer être un modèle in vitro plus approprié pour l’étude de la pathogénèse du VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most economically devastating diseases for the pig industry worldwide. The etiological agent of PRRS is the PRRS virus (PRRSV), which is known to have a very restricted host specifity and to be airborne transmitted. PRRSV RNAs and antigens were found in epithelial cells of the respiratory tract of swine in PRRSV-infected pigs. Even if the interaction between porcine alveolar macrophages (PAMs) and PRRSV plays an important role in the PRRSV infection, the role of the interaction between epithelial cells of the swine respiratory tract and PRRSV should not been neglected. However, no epithelial cells of the swine respiratory tract have been demonstrated to allow PRRSV replication in vitro and attempts to generate such a cell line have failed. The goal of this study is to determine whether epithelial cells of the swine respiratory tract are permissive to PRRSV replication and are a suitable model for studying the viral pathogenesis of PRRSV. We have discovered that the SJPL cell line, an epithelial cell line of the respiratory tract of swine, is permissive to PRRSV infection and replication. To corroborate these results, PRRSV replication kinetics were evaluated in a subclone of the African green monkey kidney MA104 cells (MARC-145), which has been known to be fully permissive to PRRSV infection and replication, and in SJPL cells. No significant difference was found between the two cell lines for overall viral production. Moreover, the SJPL cells were able to permit the replication of several PRRSV North-American strains but they were slightly less efficient for virus isolation than MARC-145 cells. In addition, SJPL is phenotypically different from MARC-145. Specifically, the SJPL cells were more sensitive to procaspases 3/7 activation by PRRSV and several apoptotic inducers compared to MARC-145 cells. In addition, the SJPL cells showed 8 to 16 times more sensitivity to the antiviral effect of IFN-α against PRRSV replication than MARC-145 cells. Altogether, the SJPL cells could be an interesting substitute to MARC-145 cells for PRRSV vaccine antigen production, and could be a more relevant in vitro model, because of their origin (lung of the natural host), to study the pathogenesis of PRRSV.

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV. / Porcine circovirus (PCV) type 2 (PCV2) is a major pathogen in the swine industry and has been described as the causative agent of a long list of conditions under the designation of porcine circovirus-associated diseases (PCVAD). Attempts to replicate PCVAD initially failed, as it was discovered that an immune trigger could facilitate the reproduction of clinical signs, either by co-infecting with other swine pathogens or using immune stimulants. Of these, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most frequently co-isolated agent in the field. Most effort has been made to understand this interaction in vivo since most in vitro cellular models lack the ability to efficiently replicate both viruses. To answer the lack of an in vitro model, we developed a cell line that allows the replication of both PRRSV and PCV. A neonate porcine tracheal cell line (NPTr) was genetically modified to stably express CD163 (NPTr-CD163), a major PRRSV receptor. NPTr-CD163 cells were able to replicate all PCV genotypes (PCV1, PCV1/2a, PCV2a and PCV2b) and PRRSV. A significant effect of PRRSV on PCV replication was found to be genotype dependent, as PCV1 replication was down regulated in the presence of PRRSV and PCV2b replication was up regulated in the same conditions. Neither cell mortality assays nor cytokine expression analysis were able to provide an explanation for these results. The effect of PRRSV on PCV1 and PCV2b replication is suggestive of a more specific, yet still unknown, mechanism. Furthermore, this effect is PCV-genotype dependant.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most important pathogen in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it exist. It was recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. The objectives of this project were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae, and (ii) to characterize the active molecules present in the culture supernatant. Proteomic analyses were first conducted and demonstrated the culture supernatant ability to induce modulations of the cell cycle regulation. In order to determine the SJPL cell cycle, flow cytometry analyses were performed and demonstrated that the culture supernatant induced a G2/M-phase cell cycle arrest. Two G2/M-phase cell cycle inhibitors were then used and their ability to inhibit PRRSV infection in SJPL cells was demonstrated. Finally, in order to characterize the active molecules present in the A. pleuropneumoniae culture supernatant, mass spectrometry was used and two molecules were identified. This is the first study demonstrating the A. pleuropneumoniae ability to disrupt cell cycle and the cell cycle importance to the inhibitory activity against PRRSV.

Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une des maladies les plus dévastatrices économiquement pour l'industrie mondiale du porc. L'agent étiologique du SRRP est le virus du SRRP (VSRRP) lequel est connu pour avoir une spécificité d'hôte très restreinte et pour sa transmission par voie aerosol. Les antigènes et les ARN du VSRRP ont été trouvés dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire de porcs infectés par le virus. L’interaction entre les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et le VSRRP a été démontrée comme jouant un rôle important dans l’infection causée par le virus. Malgré cela, l’interaction prenant place entre les cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin et le virus ne devrait pas être négligée. Jusqu’à présent, la réplication du VSRRP in vitro dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin n’a pas été conduite avec succès et les tentatives pour le faire ont échoué. Une nouvelle lignée de cellules épithéliales de poumon de porc (SJPL) est maintenant disponible et sera utilisée dans cette étude afin de déterminer si elle est permissive à la réplication du VSRRP et si elle peut être un modèle approprié pour l’étude de la pathogénèse virale du VSRRP. L’expérimentation a démontré que cette nouvelle lignée cellulaire était permissive à l’infection et à la réplication du VSRRP. Afin de corroborer ces résultats, la cinétique de réplication du virus à été effectuée avec les cellules MARC-145 et SJPL. Aucune différence significative dans la production virale totale n’a été trouvée entre les deux lignées cellulaires. Les cellules SJPL ont permis la réplication de plusieurs souches Nord-Américaines du VSRRP, quoiqu’elles sont légèrement moins efficaces que les cellules MARC-145 pour l’isolement du virus. De plus, les cellules SJPL sont phénotypiquement différentes des cellules MARC-145. Plus précisément, les cellules SJPL sont plus sensibles à l’activation par le VSRRP des pro-caspases 3/7 et plusieurs inducteurs apoptotiques. Elles ont également montré de 8 à 16 fois plus de sensibilité à l’effet antiviral causé par l’IFN-α sur la réplication du virus contrairement aux cellules MARC-145. Ces résultats démontrent que les cellules SJPL pourraient représenter un substitut intéressant aux cellules MARC-145 pour la production d’antigènes pour un vaccin anti-VSRRP. Également, dû à leurs origines (poumon de l’hôte naturel), elles pourraient s’avérer être un modèle in vitro plus approprié pour l’étude de la pathogénèse du VSRRP. / Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most economically devastating diseases for the pig industry worldwide. The etiological agent of PRRS is the PRRS virus (PRRSV), which is known to have a very restricted host specifity and to be airborne transmitted. PRRSV RNAs and antigens were found in epithelial cells of the respiratory tract of swine in PRRSV-infected pigs. Even if the interaction between porcine alveolar macrophages (PAMs) and PRRSV plays an important role in the PRRSV infection, the role of the interaction between epithelial cells of the swine respiratory tract and PRRSV should not been neglected. However, no epithelial cells of the swine respiratory tract have been demonstrated to allow PRRSV replication in vitro and attempts to generate such a cell line have failed. The goal of this study is to determine whether epithelial cells of the swine respiratory tract are permissive to PRRSV replication and are a suitable model for studying the viral pathogenesis of PRRSV. We have discovered that the SJPL cell line, an epithelial cell line of the respiratory tract of swine, is permissive to PRRSV infection and replication. To corroborate these results, PRRSV replication kinetics were evaluated in a subclone of the African green monkey kidney MA104 cells (MARC-145), which has been known to be fully permissive to PRRSV infection and replication, and in SJPL cells. No significant difference was found between the two cell lines for overall viral production. Moreover, the SJPL cells were able to permit the replication of several PRRSV North-American strains but they were slightly less efficient for virus isolation than MARC-145 cells. In addition, SJPL is phenotypically different from MARC-145. Specifically, the SJPL cells were more sensitive to procaspases 3/7 activation by PRRSV and several apoptotic inducers compared to MARC-145 cells. In addition, the SJPL cells showed 8 to 16 times more sensitivity to the antiviral effect of IFN-α against PRRSV replication than MARC-145 cells. Altogether, the SJPL cells could be an interesting substitute to MARC-145 cells for PRRSV vaccine antigen production, and could be a more relevant in vitro model, because of their origin (lung of the natural host), to study the pathogenesis of PRRSV.

Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV. / Porcine circovirus (PCV) type 2 (PCV2) is a major pathogen in the swine industry and has been described as the causative agent of a long list of conditions under the designation of porcine circovirus-associated diseases (PCVAD). Attempts to replicate PCVAD initially failed, as it was discovered that an immune trigger could facilitate the reproduction of clinical signs, either by co-infecting with other swine pathogens or using immune stimulants. Of these, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most frequently co-isolated agent in the field. Most effort has been made to understand this interaction in vivo since most in vitro cellular models lack the ability to efficiently replicate both viruses. To answer the lack of an in vitro model, we developed a cell line that allows the replication of both PRRSV and PCV. A neonate porcine tracheal cell line (NPTr) was genetically modified to stably express CD163 (NPTr-CD163), a major PRRSV receptor. NPTr-CD163 cells were able to replicate all PCV genotypes (PCV1, PCV1/2a, PCV2a and PCV2b) and PRRSV. A significant effect of PRRSV on PCV replication was found to be genotype dependent, as PCV1 replication was down regulated in the presence of PRRSV and PCV2b replication was up regulated in the same conditions. Neither cell mortality assays nor cytokine expression analysis were able to provide an explanation for these results. The effect of PRRSV on PCV1 and PCV2b replication is suggestive of a more specific, yet still unknown, mechanism. Furthermore, this effect is PCV-genotype dependant.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène de grande importance dans l'industrie porcine car il peut entraîner des pertes économiques. L'une des lignées cellulaires couramment utilisée pour la recherche et la production de vaccins est MARC-145 (cellules rénales de singe vert africain). Les interactions moléculaires entre les cellules hôtes et le virus sont essentielles pour comprendre le mécanisme par lequel le virus utilise la machinerie cellulaire pour se répliquer et infecter les cellules voisines. Notre objectif était d'analyser les changements protéomiques produits lors de l'infection par le VSRRP chez les cellules MARC-145, y compris la composition des virions et des exosomes produits par les cellules infectées. Les surnageants des cellules infectées et non infectées ont été purifiés pour obtenir les virions et exosomes des cellules hôtes. Par la suite, les protéines extraites ont été analysées par spectrométrie de masse à haute résolution quadripolaire-hybride-Orbitrap, et classées selon la fonction moléculaire et la localisation subcellulaire. Le besoin d'obtenir des données protéomiques fiables a conduit au prochain objectif : optimiser l'infection des cellules MARC-145 par le VSRRP. Pour évaluer l'efficacité de l'infection, nous avons synchronisé l'infection en utilisant un virus marqué avec une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et en ajoutant des polycations à différentes concentrations pour stimuler la liaison des particules virales à la cellule. Pour vérifier le pourcentage de cellules infectées, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux. Nos résultats suggèrent que les protéines cellulaires affectées au cours de l'infection par le VSRRP pourraient jouer un rôle important dans la réponse immunitaire de l'hôte et / ou le cycle de vie viral. L’efficacité de l'utilisation de polycations pour augmenter l'infection par le VSRRP a été démontrée. / Porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) is a pathogen of high importance in the porcine industry because it can lead to significant economic losses. One of the cell lines routinely used for research and vaccine production is MARC-145 (African green monkey kidney cells). Molecular interactions between the host cells and the virus are essential to understand how the virus uses the cell machinery to replicate and infect neighbouring cells. Our goal was to analyze the proteomic changes involved during the PRRSV infection in MARC-145 cells, including the composition of the infected cells' virions and exosomes. The infected and non-infected cells' supernatants were purified to obtain the host cells' virions and exosomes. Extracted proteins were further analyzed by High-Resolution-Quadrupole-Hybrid-Orbitrap mass spectrometry and classified according to molecular function and subcellular localization. The need for obtaining reliable proteomics data led to the next goal of optimizing the infection of MARC-145 cells with PRRSV. To assess the efficiency of the infection, we synchronized the infection, used a virus tagged with an enhanced green fluorescent protein (EGFP) and added polycations at different concentrations to stimulate the binding of the viral particles to the cell. To verify the percentage of infected cells, we used fluorescence microscopy and flow cytometry. Our findings suggest the cellular proteins affected during the PRRSV infection could play important roles in host immune response and/or the viral life cycle. The efficiency of the use of polycations was demonstrated to be effective in increasing PRRSV infection.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène ayant d’énormes conséquences pour les producteurs porcins. Il est la cause d’une des maladies les plus coûteuses à l’industrie au Québec et, à ce jour, il n’y a aucun traitement efficace commercialement disponible contre le virus. Il a été précédemment démontré que le surnageant de culture de bactéries Actinobacillus pleuropneumoniae (App) - l’agent causant la pleuropneumonie porcine - possède une activité antivirale in vitro contre le VSRRP. Ces études ont déterminé que cette activité était en fait médiée par des métabolites excrétés par les bactéries d’App, résistants à la chaleur et de faible poids moléculaire. Cependant, l’identité de ces métabolites demeurait inconnue, menant ainsi aux objectifs de ce projet : (I) produire un surnageant actif d’App; (II) caractériser et identifier les métabolites actifs utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS); (III) tester et évaluer l’activité antivirale des composés purifiés. De nombreux métabolites de nucléotides de l’adénosine en haute concentration dans le surnageant d’App ont ainsi été identifiés par HRMS. Pour confirmer l’effet antiviral du surnageant et des métabolites actifs identifiés, un modèle d’infection de cellules SJPL permissives au VSRRP et de l’imagerie à immunofluorescence ont été employés. Les métabolites ont en effet montré une inhibition de la réplication du VSRRP dans les cellules et leurs mécanismes d’actions sont déjà bien répertoriés; soit l’inhibition des polymérases d’ARN cellulaire et virale par la forme de triphosphate de nucléoside, ainsi que l’arrêt de synthèse des acides nucléiques lors de la réplication virale. Cette étude propose donc de nouvelles ouvertures, basé sur les mécanismes d’actions cellulaires responsables de l’effet antiviral, pour développer des traitements préventifs contre le VSRRP / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most devastating viruses in the swine industry. It causes major economic losses worldwide on an annual basis. To date, there has not been an effective treatment for this virus. Previous studies conducted in our group have shown that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae (App), the causative agent of porcine pleuropneumonia, possesses an antiviral activity in vitro against PRRSV. These studies have shown that the antiviral activity was mediated by small molecular weight, heat resistant metabolites present in the App supernatant ultrafiltrates. However, the identity of those metabolites remained unknown, which led us to the objectives of this study: (I)generate an active supernatant; (II)characterize and identify the active metabolites using high resolution mass spectrometry; (III)evaluate the antiviral activity of the purified compounds following identification. In this study we utilized a virus infection model using SJPL cells and immunofluorescence imagery to confirm the antiviral activity of the App supernatant as our first approach. Subsequently, using high resolution mass spectrometry we identified several adenosine nucleotide metabolites present in App supernatants in high concentrations. Following testing, we revealed that several adenosine nucleotide metabolites inhibit PRRSV replication in SJPL cells. Interestingly, the antiviral mechanism of action of adenosine nucleotide analogs is already known. The nucleoside triphosphate form functions by inhibiting cellular and viral RNA polymerases and during viral RNA replication, incorporates nucleoside analogs into nascent RNA chains resulting in termination of nucleic acid synthesis. This study may suggest new approaches to develop prophylactic treatment for PRRSV