La génération de plasmocytes (PC) à longue durée de vie sécrétant des anticorps hautement affins spécifiques de l’antigène, caractéristique de la réponse immune adaptative, est l’étape ultime de la différenciation des lymphocytes B au sein des centres germinatifs des organes lymphoïdes secondaires. La transition d’un lymphocyte B naïf vers un PC est associée au passage d’un programme transciptionnel des gènes de l’identité B vers l’expression des gènes de l’indentité plasmocytaire. Ce travail de thèse s’est concentré sur la caractérisation de cette étape terminale de la différenciation lymphocytaire B humaine tant au niveau transcriptomique qu’épigénétique. A l’aide d’un modèle de différenciation in vitro à partir de lymphocytes B naïfs humains, nous avons identifié les cellules engagées dans ce processus. Ces précurseurs des plasmablates sont notamment caractérisés par une répression de la voie de signalisation de l’IL-4 aboutissant à la perte du marqueur CD23, le récepteur de faible affinité à l’IgE mais aussi à l’apposition de 5hmC, l’hydroxyméthylcytosine, au niveau des gènes de l’identité PC. L’étude de cette marque épigénétique dans un contexte pathologique, le myélome multiple, a fait l’objet du second axe de recherche de notre projet et a révélé le rôle du gène FAM72D dans la prolifération cellulaire. / The generation of long-lived plasma cells (PCs) secreting protective, antigen-specific, high-affinity antibodies as a part of adaptative immunity, is the ultimate step of the terminal differentiation of B cells within germinal centers of secondary lymphoid organs. The transition of a naïve B cell into a PC is associated with the switch from a B cell identity programm to PC identity programm. The focus of this thesis project was to characterise the transcriptomic and épigenetic profile of cells commited to this ultimate step of the B cell differentiation. Thanks to an in vitro model of human naïve B cell differentiation into PCs, we identify cells commited to this process. These plasmablasts founder cells are caracterised by a downregulation of the IL-4 pathway leading to the loss of CD23, the low-affinity receptor for IgE, but also to the hydroxymethylation (5hmC apposition) of PC identity genes. The study of 5hmC in multiple myeloma samples was the subject of the second research axis of our project and revealed the role of FAM72D gene as a marker of cell proliferation.

Le plasmocyte représente le stade final de la différenciation lymphocytaire B. Il s’agit de la cellule productrice des immunoglobulines (Ig), ce qui en fait l’acteur majeur de la réponse immunitaire humorale. Toutefois, lors d’une prolifération plasmocytaire anormale, l’Ig produite en excès peut devenir pathogène pour l’organisme, s’agréger et conduire à une maladie de dépôt d’Ig monoclonales. Il existe une grande variété de ces maladies de dépôts dont la classification repose sur la nature des dépôts. Nous avons développé dans notre laboratoire un modèle murin pour l’une d’entre elle, la LCDD « Light Chain Deposition Disease », qui reproduit parfaitement les lésions rénales observées chez les patients. Nous montrons grâce à ce modèle qu’en supprimant la production de l’Ig pathogène, nous préservons la fonction rénale de nos souris. Nous montrons aussi grâce à des traitements réalisés avec des inhibiteurs du protéasome (IP) et par l’étude du transcriptome des PCs que ces cellules sont sensibilisées par l’Ig pathogène aux IP via une activation de la voie de réponse au stress du réticulum endoplasmique. Nous nous sommes également intéressés à un patient atteint d’une HCDD « Heavy Chain Deposition disease ». Les études moléculaires et les expériences in-vitro que nous avons réalisées à partir des prélèvements de ce patient nous ont permis de proposer un scénario expliquant la production d’une chaîne lourde tronquée par le clone plasmocytaire : l’apparition d’une mutation au niveau de la chaîne légère aurait conduit à la mutation de la chaîne lourde afin de surmonter un stress du réticulum endoplasmique et ainsi permettre la survie cellulaire. / The plasma cell represents the final stage of B-lymphocytes differentiation. It is the immunoglobulin (Ig) producing cell, making it the major player in the humoral immune response. However, during abnormal plasma cell proliferation, the Ig produced in excess can become pathogenic for the organism, aggregate and lead to a monoclonal Ig deposition disease. There is a wide variety of these deposition diseases whose classification is based on the nature of the deposits. In our laboratory, we have developed a mouse model for one of them, the Light Chain Deposition Disease (LCDD), perfectly reproducing the renal lesions observed in patients. We show by this model that by suppressing the production of the pathogenic Ig the renal function of our mice is preserved. Additionally, thanks to proteasome inhibitors (PI) treatment and plasma cell transcriptome studies, we prove that these cells are sensitized by the pathogen Ig to PI via the activation of the endoplasmic reticulum stress response pathway. We also studied a patient with Heavy Chain Deposition disease (HCDD). The molecular studies and in-vitro experiments carried out with the sample from this patient allowed us to propose a new scenario explaining the production of a truncated heavy chain by the plasma cell clone: the appearance of a mutation at the light chain level would led to the mutation of the heavy chain, in order to overcome the endoplasmic reticulum stress and thus allowing cell survival.

La différenciation terminale des lymphocytes B qui se déroule dans les centres germinatifs des organes lymphoïdes secondaires est l’étape ultime de la réponse T dépendante et aboutit à la production de plasmocytes (PC) à longue durée de vie qui sécrètent des anticorps hautement affins spécifiques de l’antigène et caractéristiques de la réponse immune adaptative. La transition d’une cellule B naïve vers un PC est gouvernée par un réseau de régulation génique bien décrit et est largement influencée par l’intégration de stimuli externes qui contrôlent le devenir des cellules B tels que l’interaction BCR-antigène et les cytokines produites par les cellules T. La stimulation précoce des lymphocytes B humains activés par IL-2, induit la différenciation en PC via une signalisation ERK prolongée entraînant la baisse d’expression de BACH2, un facteur de transcription clef des cellules B. La répression transitoire de BACH2 est suffisante pour déclencher la différenciation en plasmablastes en l’absence d’IL-2, suggérant ainsi qu’il joue un rôle de « verrou moléculaire » de la différenciation en PC. Il est à noter que cette répression forcée de BACH2 aboutit à la production de plasmablastes caractérisés par un phénotype lymphoplasmocytaire. Ce travail de recherche s’est focalisé sur la caractérisation des mécanismes moléculaires régulant l’expression de BACH2 via la voie de signalisation ERK induite par IL-2. Nous avons identifié ELK-1 comme un médiateur de la répression de BACH2 par la voie IL-2/ERK, comme l’atteste sa capacité à se lier avec un élément de régulation d’un enhancer localisé dans l’intron 1 de BACH2, induisant ainsi la répression de l’enhancer et déverrouillant la différenciation en PC. La caractérisation de cet enhancer de BACH2 a confirmé qu’il est régulé de manière dynamique au cours de la différenciation terminale B et qu’il est localisé dans une région sujette aux mutations suggérant qu’il pourrait être impliqué dans la lymphomagenèse. / The terminal differentiation of B cells, which takes places within germinal centres of secondary lymphoid organs, is the ultimate step of a T cell dependent response and results in the generation of long-lived plasma cells (PCs) that secrete protective, antigen-specific, high-affinity antibodies as part of adaptive immunity. The transition of a naive B cell into a PC is governed by a well-characterised gene regulatory network and is heavily influenced by the integration of externally received signals, including BCR-antigen binding and T cell help, such as cytokines which guide B cell fate. The early IL-2 priming of human primary activated B cells triggers PC differentiation through sustained ERK signalling resulting in the down regulation of B cell transcription factor BACH2. Transient BACH2 repression is sufficient to trigger plasmablast differentiation in the absence of IL-2 suggesting that it acts as a key lock of PC differentiation. Importantly, this enforced BACH2 repression results in the generation of plasmablasts with a lymphoplasmacytic phenotype. The focus of this thesis was to characterise the molecular mechanisms regulating BACH2 expression via the IL-2 ERK transduction pathway. We identify ELK-1 as the mediator of IL-2 ERK induced BACH2 downregulation as it binds to a regulatory enhancer element located within intron 1 of BACH2 instigating its repression and unlocking the PC programme triggering differentiation. The characterisation of this BACH2 enhancer confirms that it is dynamically regulated during PC differentiation and is located within a region targeted for mutation suggesting that it may have a potential role in lymphomagenesis.

Le myélome multiple (MM) est une néoplasie hématopoïétique chimiosensible. Si une chimiothérapie intensive associée à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques permet de doubler la médiane de survie, la rechute reste cependant inéluctable et ce cancer est incurable à l'heure actuelle.<br />Plusieurs exemples ont montré récemment qu'une connaissance précise de la physiopathologie d'un cancer pouvait conduire à l'élaboration de traitements spécifiques. Ces nouveaux traitements anti-cancéreux ciblant un sous-groupe de tumeurs caractérisées par une altération moléculaire commune sont une voie de développement thérapeutique prometteuse.<br />Mon travail de thèse a consisté à étudier la biologie du MM dans une perspective de ciblage pharmacologique de la cellule plasmocytaire maligne. L'utilisation d'anticorps anti-gp130 agonistes a permis de montrer que l'activation de la signalisation par la chaîne gp130 du récepteur de l'interleukine-6 (IL-6) est indispensable à la survie et la prolifération des cellules de MM. En corollaire, l'interruption de cette voie de signalisation par la tyrphostin AG490, inhibiteur de la kinase JAK2, bloque la croissance et induit une apoptose dans les plasmocytes tumoraux. Des membranes comportant les ADNc de 268 gènes nous ont permis de rechercher l'expression des gènes d'autres cytokines et récepteurs de cytokines pouvant jouer un rôle dans la physiopathologie du MM. Nous avons mis en évidence dans des lignées de MM une boucle autocrine, cruciale pour la survie du plasmocyte tumoral, qui implique la cytokine HB-EGF et son récepteur ErbB1. Le développement d'un modèle de génération in vitro de plasmocytes normaux purifiés a permis ensuite la comparaison du transcriptome de plasmocytes tumoraux avec leur contrepartie normale par des puces à ADN analysant l'expression de 6800 gènes différents. De nombreux gènes sont différentiellement exprimés entre ces deux populations cellulaires et certains gènes surexprimés dans les cellules myélomateuses codent pour des protéines qui sont des cibles thérapeutiques potentielles, telles que ABL, CBS, RAR? ou RhoC.<br />La possibilité de comparer pour chaque malade le transcriptome des cellules tumorales par rapport à leur équivalent normal va permettre de progresser rapidement dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l'émergence du clone tumoral et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait aboutir sur la mise en place d'un traitement « à la carte » du MM basé sur l'examen du transcriptome du clone tumoral de chaque patient.

Le plasmocyte (PC), stade terminal de la différenciation du lymphocyte B induite par l'antigène, est la cellule effectrice de l'immunité humorale responsable de la production des anticorps. La population plasmocytaire se divise en deux grands sous-types différant par leur durée de vie et par leur localisation anatomique. On distingue ainsi les PC à durée de vie courte ou PC effecteurs (dans les tissus lymphoïdes secondaires) et les PC à longue durée de vi (LLPC ou PC à mémoire) localisés principalement dans la moelle osseuse. Ces derniers contribuent à la mémoire humorale en continuant à sécréter des anticorps protecteurs après résolution de l'infection. Nos résultats expérimentaux montrent que les Ags thymo-dépendants (TD) et les Ag thymo-indépendants (TI) induisent des PC médullaires exprimant des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles différentes. Ainsi, l'expression d'une forme membranaire fonctionnelle du récepteur antigénique (BCR) persiste sur les LLPC TI alors qu'elle est perdue sur les LLPC TD. Cette fonctionnalité nouvelle portée par les PC médullaires TI n'est pas dépendante de la sous population lymphocytaire B recrutée ni de la nature de l'Ag, mais de l'isotype IgM. Nos résultats montrent également que cette population de PC médullaires a les caractéristiques des LLPC : ces PC sont quiescents, ils demeurent dans la moelle osseuse jusqu'à 180 jours et sont phénotypiquement semblables aux LLPC. Nos travaux ont permis de montrer que les LLPC à IgM sont capables de reconnaître l'Ag et que l'engagement de leur BCR par l'Ag conduit à la production d'IL10 / Plasma cells (PC) represent the terminal differentiation stage of B lymphocytes. Their canonical function is to secrete antibodies (Abs). PC differentiation is driven by remodeling of the B cell transcriptional program, highlighted by the induction of the transcriptional repressor Blimp-1 and repression of Pax5, considered as the guardian of B cell identity. The dogma holds that PC, as opposed to B cells, have lost the Ag recognition capacity because they have switched from expression of a membrane-bound Ag receptor (mBCR) to production of the secreted form of the BCR (Abs). Here, we have compared the phenotypical and functional attributes of memory PC generated by the T cell-dependent (TD) and T-cell independent (TI) forms of the hapten NP. Our data show that TI NP-specific bone marrow (BM) PC generated by NP-dextran retain an Ag-binding capacity comparable to that of B cells long after immunization while TD NP-specific BM PC do not. We found that this difference is not imputable to the structure of the immunogen but is a specific feature of IgM-expressing PC, which are prominent in response to TI Ag. Upon Ag recognition in vitro, the mBCR of IgM+ BM PC promotes: i) Ca++ mobilization, ii) phosphorylation of Syk and Blnk, iii) Ag internalization and phosphorylation of the late endosomal kinase Erk. Finally, we demonstrate that Ag recall in vivo induces significant changes in the gene expression profile of NP-specific IgM+ BM PC with evidence for activation of a cytokine production program characterized in particular by up-regulation of the CCL5 and IL10 transcripts. In conclusion, our data show that IgM-expressing BM PC can sense Ag and may be driven to express a regulatory function upon Ag recall

La réponse immunitaire de type humorale se déclenche suivant certaines infections virales et bactériennes de même que suivant une immunisation. Au niveau cellulaire, ce type de réponse favorise la formation de petites structures, nommées centres germinatifs (CG), qui se développeront dans les organes lymphoïdes secondaires (OLS) tels que la rate et les ganglions. Ces CG sont orchestrés par la présentation des antigènes étrangers par les cellules dendritiques et les cellules dendritiques folliculaires (FDC), aux cellules T et B respectivement, ainsi que par des interactions complexes survenant entre ces lymphocytes T et B. Suivant ce processus, les lymphocytes B quittant les CG se différencieront soient en plasmocytes sécréteurs d’anticorps de fortes affinités ou en cellules B mémoires qui assureront une protection lors d’une seconde exposition face à un antigène étranger ayant précédemment été rencontré. Plusieurs évidences suggèrent que la qualité de la réponse humorale est influencée par des variants génétiques. Par exemple, des études quantifiant les titres d’anticorps suivant la vaccination ont observé que ces titres variaient en fonction de différents groupes ethniques. Toutefois, malgré ces évidences, la contribution de la génétique quant à la variation des aspects cellulaires de la réponse humorale demeure incomplète. En utilisant douze lignées de souris génétiquement éloignées, nous avons donc évalué l'impact de la variabilité génétique sur les aspects cellulaires de cette réponse humorale, et ce, à l'état d'équilibre et suivant l’immunisation avec un antigène étranger. Pour ces deux conditions, nous avons quantifié, par cytométrie en flux, le nombre ainsi que la composition cellulaire (cellules B, plasmocytes et cellules T auxiliaires folliculaires) des CG contenus dans plusieurs OLS ainsi que dans la moelle osseuse des différentes lignées de souris. Après immunisation, le positionnement cellulaire au sein des CG de la rate a également été évalué par immunofluorescence. Nos résultats indiquent que le nombre et la taille des CG après immunisation ainsi que la composition cellulaire de ces CG à l’état d’équilibre et suivant l’immunisation varient entre les différentes lignées de souris à l’étude. Comme les douze lignées de souris ont été soumises aux mêmes conditions, ces résultats suggèrent que les variants génétiques, étant différents d’une lignée de souris à une autre, sont responsables des variations que nous avons observées au niveau des aspects cellulaires de la réponse humorale. Ce projet permettant de mieux comprendre l’impact de la variabilité génétique sur certains aspects de la réponse humorale pourrait ultimement mener à une amélioration des approches vaccinales chez les individus répondant moins bien à un certain type de vaccination. / The humoral immune response is triggered following certain viral and bacterial infections as well as following immunization. At the cellular level, this type of response promotes the formation of small structures, called germinal centers (GC), which develop into secondary lymphoid organs such as the spleen and lymph nodes. These GC are orchestrated by the presentation of foreign antigens by dendritic cells and follicular dendritic cells (FDC), to T and B cells respectively, and by subsequent interactions between these T and B lymphocytes. Following this process, B cells leaving the GC will differentiate into high-affinity antibody-secreting plasma cells or memory B cells that will provide protection upon a second exposure to a previously encountered foreign antigen. There is some evidence to suggest that the quality of the humoral response is influenced by genetic variants. For example, studies quantifying antibody titers following vaccination have observed that these titers vary across different ethnic groups. However, despite this evidence, the contribution of genetics to the variation of the cellular aspects of the humoral responses remains incomplete. Using twelve genetically divergent mouse strains, we therefore evaluated the impact of genetic variability on the cellular aspects of this humoral response at steady state and following immunization with a foreign antigen. For these two conditions, we quantified, by flow cytometry, the number as well as the cellular composition (B cells, plasma cells and T follicular helper cells) of the GC contained in several SLO and in the bone marrow of the different mouse strains. After immunization, cell positioning within the GC of the spleen was also assessed by immunofluorescence. Our results indicate that the number and size of GC after immunization as well as the cellular composition of these GC at steady state and following immunization vary between the different mouse strains studied. As the twelve mouse strains were subjected to the same conditions, these results suggest that the genetic variants, being different from one mouse strain to another, are responsible for the variations that we observed in the cellular aspects of the humoral response. This project, which allows us to better understand the impact of genetic variability on some aspects of the humoral response, could ultimately lead to an improvement in vaccine approaches in individuals who respond less well to a certain type of vaccination.