Le myélome multiple est un cancer incurable caractérisé par une accumulation de plasmocytes malins dans la moelle osseuse. Récemment, nous avons découvert que l'expression forcée du facteur de transcription PAX5 (paired box protein 5) dans des lignées cellulaires humaines de myélome multiple induisait une forte diminution de la viabilité cellulaire. Des viabilités de près de 50% ont été observées dans les lignées cellulaires de myélome multiple RPMI-8226 et U266 aux jours quatre et sept respectivement après l'infection de ces cellules par un vecteur adenoviral codant pour PAX5. Nous avons constaté que la mortalité était due à l'apoptose induite par une baisse de MCL-1 (myeloid cell leukemia-1). La spécificité de cet effet a été démontrée grâce à des lignées cellulaires de leucémie à plasmocytes, lignées cellulaires dont la viabilité ne variait pas suite à l'expression forcée de PAX5, suggérant ainsi une nouvelle avenue de traitement du myélome multiple.

Le myélome multiple est une néoplasie plasmocytaire caractérisée par une prolifération clonale de plasmocytes malins au niveau de la moelle osseuse. Il correspond à environ 13% des cancers hématologiques et la survie médiane à 10 ans est d’environ 30%. Le CD146 est une molécule d’adhésion (CAM) qui est surtout exprimée au niveau des jonctions des cellules endothéliales. A l’origine, le CD146 a été identifié comme un marqueur tumoral du mélanome (MCAM) et, par la suite, il a été étudié dans de nombreux cancers tels que les cancers du rein, du sein, du poumon, les cancers gastriques et les ostéosarcomes. Son expression est le plus souvent associée à un mauvais pronostic. Nous avons montré pour la première fois, que cette molécule s’exprimait aussi à la surface des plasmocytes normaux, cette expression apparaissant tardivement au cours de la différenciation B. Nous avons montré que cette expression était modulée sur des plasmocytes tumoraux de gammapathie monoclonale avec une forte diminution voire le plus souvent une disparition sur les plasmocytes malins de Myélome Multiple (MM). De plus, nous avons montré que CD146 constituait un facteur de bon pronostic indépendant dans cette maladie et qu’il était un des mécanismes permettant à la cellule tumorale d’avoir un avantage en termes de survie. Un second axe de recherche a consisté à la mise en place d’une technique de détection des cellules endothéliales circulantes dans le sang et in situ dans la moelle osseuse dans le myélome multiple afin de disposer d’un outil permettant l’étude de l’angiogenèse dans cette pathologie ainsi que son suivi en clinique. / Multiple Myeloma is a neoplastic plasma-cell disorder that is characterized by clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow microenvironment. It accounts for approximately 13% of hematologic cancer and the ten year survival rate is approximately 30%. CD 146 is an adhesion molecule (CAM) that is essentially expressed at endothelial junctions. At first, CD 146 was identified as a tumor marker of melanoma. It subsequently was studied in conjunction with cancer of the kidney, the breast, the lung, as well as gastric cancers and osteosarcomas. Its expression is most often associated with a bad prognosis. For the first time we have shown that this molecule is expressed at the surface of normal plasma cells, this expression appearing during the late stages of B cell differentiation. We have demonstrated that this expression was modulated on Multiple Myeloma (MM) plasma cells, and and was significantly decreased or disappeared in malignant plasma cells. Moreover, we have shown that CD146 was an independent good prognostic marker and that it was implicated in mechanisms that confers a survival advantage to the tumor cell. The next part of the project consisted to set up a detection protocol for circulating endothelial cells in blood and bone marrow in multiple myeloma in order to develop a tool for studying angiogenesis in this pathology which can also be used during therapeutic monitoring.

Le myélome multiple (MM) est une néoplasie B caractérisée par l'accumulation d'un clone plasmocytaire dans la moelle osseuse. Cette pathologie demeure incurable d'où la nécessité d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L'utilisation des puces à ADN a permis d'identifier, de nombreux gènes dont l'expression par les cellules de MM est associée à un mauvais ou bon pronostic. La plupart des gènes pronostics identifiés dans le MM codent pour des protéines impliquées dans les processus de réplication, de réparation et de recombinaison de l'ADN. Nous avons voulu aller plus loin dans l'identification et la fonction biologique de ces gènes pronostics. D'une part, nous avons recherché les gènes présentant des pics d'expression très élevés ‘gènes spikés' chez une fraction des patients. Ces gènes sont généralement associés à des évènements oncogéniques. D'autre part, nous avons identifié des gènes pronostics non associés à la machinerie du cycle cellulaire et qui sont fortement exprimés dans des cellules souches pluripotentes ou adultes. L'identification de ces gènes nous a permis de construire un score pronostic très puissant, éliminant les scores pronostics publiés à présent. Un autre aspect majeur est l'élucidation des mécanismes biologiques impliquant ces gènes et qui sont responsables de la résistance aux traitements et/ou de la courte durée de survie des patients, afin de pouvoir les reverser. Nous avons donc évalué le rôle biologique de DEPDC1A un gène fortement exprimée dans les cellules de MM en association avec un mauvais pronostic. Le knockdown conditionnel de DEPDC1A par l'utilisation d'un shRNA, inhibe la croissance des lignées de myélome avec une accumulation des cellules en phase G2/M du cycle cellulaire. Cette accumulation est associée à la phosphosphorylation et à la stabilisation de P53, et à l'accumulation de P21/WAF1. Le knockdown de DEPDC1A résulte également en l'expression de marqueurs de cellules plasmocytaires matures dans les lignées de MM : CD31, CD38, CD138, IL6R, CXCR4, CD9, VLA6. DEPDC1A contrôle donc le cycle cellulaire des plasmocytes tumoraux en interférant avec la voie P53 et bloque leur différenciation. Ces travaux montrent que DEPDC1A pourrait jouer un rôle essentiel dans la croissance des cellules de myélome et pourrait être une cible moléculaire prometteuse pour de nouvelles drogues ou de peptides-vaccins dans le MM. / Multiple myeloma (MM) is a B neoplasia characterized by the accumulation of a plasma cell clone in the bone marrow. This disease remains incurable, hence the need to identify new therapeutic targets. The use of DNA microarrays has identified many genes whose expression in MM cells is associated with poor or good prognosis. Most of the genes identified in the MM predictions encode proteins involved in DNA replication, repair and recombinaison processes. We wanted to go further in the identification and biological function of these prognostic genes.First, we looked for genes that have a spike expression, i.e. they are highly expressed in MMCs of a fraction of patients. These genes are generally associated with oncogenic events.On the other hand, we have identified pluripotent and adult stem cell genes unrelated to cell cycle and aberrantly expressed by human multiple myeloma cells in association with poor prognosis. The identification of these genes has allowed us to build a powerful prognostic score, stonger than already published scores.Another major aspect is the elucidation of biological mechanisms involving these genes that are responsible for drug resistance and/or short-term survival of patients, to revert them. We evaluated the biological role of DEPDC1A gene which are highly expressed in MM cells in association with a poor prognosis. The conditional knockdown of DEPDC1A by using an shRNA, inhibits the growth of myeloma cell lines with an accumulation of cells in G2/M phase of cell cycle. This accumulation is associated with phosphosphorylation and stabilization of p53, and accumulation of P21/WAF1. The knockdown of DEPDC1A also results in the expression of mature plasma cell in MM cell lines: CD31, CD38, CD138, IL6R, CXCR4, CD9, VLA6. DEPDC1A therefore controls the cell cycle of plasma cells by interfering with the p53 pathway and blocks their differentiation. This work shows that DEPDC1A could play a role in the growth of myeloma cells and could be a promising molecular target for new drugs or vaccine peptides in MM.

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne de la lignée B qui se manifeste par <p>une accumulation de plasmocytes monoclonaux dans la moelle osseuse. Le MM se caractérise par <p>la nature inéluctable de ses rechutes de plus en plus réfractaires au traitement. Au sein de la moelle <p>osseuse, les cellules malignes interagissent avec leur microenvironnement notamment composé de <p>cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Les CSM apportent un soutien aux cellules <p>plasmocytaires (PC) malignes via des interactions cellulaires directes (VLA-4, VCAM-1, CD44,…) <p>ou par la production de cytokines (IL-6, SDF1, VEGF,…). De ces interactions résulte l’apparition <p>d’altérations constitutives au sein des MM-CSM telles qu’une production réduite de dépôts de <p>calcium et une augmentation de la sécrétion de nombreux facteurs (IL-6, GDF-15, etc.). <p>L’objectif de ce travail est de mieux caractériser les anomalies constitutives (génomiques, <p>prolifératives, immunomodulatrices, etc.) des MM-CSM et d'évaluer l’impact des traitements reçus <p>par les patients sur ces anomalies. Ces analyses permettront de mieux définir le rôle des CSM dans <p>la physiopathologie et la progression de la maladie afin de mettre en évidence d’éventuelles cibles <p>thérapeutiques.<p>Compte tenu de l’altération de nombreux acteurs du cycle cellulaire mise en évidence par <p>notre analyse du profil d’expression génique des MM-CSM après comparaison avec celui des CSM <p>de donneurs sains (DS-CSM), nous avons décidé d’étudier leurs capacités prolifératives. Nos <p>observations démontrent que a) les MM-CSM sont caractérisées par une réduction de leur <p>clonogénicité et par un temps de doublement plus important par rapport aux DS-CSM b) l’entrée <p>précoce des MM-CSM en sénescence est confirmée par l'augmentation drastique du nombre de <p>cellules exprimant la « senescence-associated β-galactosidase », par l’augmentation de la taille <p>cellulaire, par l’expression spécifique de membres du « senescence-associated secretory profile » <p>(SASP) et par la surexpression de TP53 et TP21, deux facteurs importants du cycle cellulaire et de <p>la sénescence c) l’ostéoblastogenèse des MM-CSM est altérée en raison de ce processus de <p>sénescence, à savoir, une réduction de la production de calcium et une hausse précoce de l’activité<p>de la phosphatase alcaline des MM-CSM par rapport aux DS-CSM d) l’activité de support à <p>l’hématopoïèse des MM-CSM est augmentée (« increased Blast-Colony Forming Cells and LongTerm Culture Initiating Cells »). <p>Dans la seconde partie de ce travail, on s’est intéressée plus particulièrement aux capacités <p>immunomodulatrices des MM-CSM. Nous avons observé, par réaction mixte lymphocytaire et <p>stimulation mitogénique (PHA/IL-2), a) une réduction de l’inhibition de la prolifération des <p>lymphocytes T activés en présence de MM-CSM par rapport aux DS-CSM b) une inversion du ratio <p>Th17/Treg lorsque des lymphocytes T activés sont cultivés en présence de MM-CSM par rapport <p>aux DS-CSM ;les mécanismes potentiellement impliqués dans ces altérations ont été investigués c)<p>les MM-CSM présentaient une expression anormale du CD40/40L, VCAM1, ICAM-1, LFA-3 <p>HLA-DR et HLA-ABC et des taux d’IL-6 et d’IL-10 altérés ont été mesuré dans le milieu de <p>culture lorsque les lymphocytes T activés étaient cultivés en présence de MM-CSM par rapport aux <p>DS-CSM. <p>Nos résultats suggèrent que les MM-CSM entrent précocement en sénescence avec de <p>profondes altérations de leurs propriétés biologiques et notamment leur capacités <p>d'immunomodulation et de différenciation ostéogénique. Nous concluons que l’entrée en <p>sénescence des MM-CSM pourrait être à l’origine d’une altération du microenvironnement tumoral <p>qui favoriserait rechutes et résistances aux traitements. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le myélome multiple (MM) est un cancer hématologique qui se caractérise par une prolifération et une accumulation de cellules plasmocytaires malignes au niveau de la moelle osseuse (MO). Il représente 10% des hémopathies malignes et 2% de la mortalité par cancer dans le monde occidental. La principale conséquence de l’expansion plasmocytaire clonale médullaire est la sécrétion excessive d’une immunoglobuline (Ig) unique qui va être à l’origine du caractère multi-symptomatique de cette pathologie. Ainsi, les manifestations du MM se caractérisent par des lésions osseuses, une atteinte rénale, une anémie, une hypercalcémie et une immunodéficience humorale conduisant à des infections récidivantes. Son pronostic est mauvais avec une médiane de survie qui se situe entre cinq et sept ans sous chimiothérapie qui vise à éliminer les cellules plasmocytaires malignes.A partir de la lignée U266 de myélome, nous avons dérivé des clones résistants au bortézomib (R6). Grâce à une analyse par biopuces à ADN, nous avons identifié 160 gènes significativement régulés dans les cellules R6 par rapport à la lignée parentale U266. Nous avons établi, par une approche fonctionnelle, que la surexpression de la protéine HspB8 conduit, via l’activation de la dégradation autophagique, à l’élimination des agrégats protéiques et à compenser l’effet de l’inhibition du protéasome conférant ainsi la résistance des cellules de myélome aux inhibiteurs du protéasome.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’implication de la protéine Bcl-B (BCL2L10) dans la pathogenèse du MM. Nous avons confirmé que Bcl-B est impliqué dans la pathogénèse du MM (patients et modèle murin). / Velcade is one of the inescapable drug to treat patient suffering from multiple myeloma (MM) and resistance to this drug represents a major drawback for patients. However, the mechanisms underlying velcade resistance remain incompletely understood. We derived several U266 MM cell clones that resist to velcade. We derived several U266 MM cell clones that resist to velcade. U266- resistant cells were resistant to velcade-induced cell death but exhibited a similar sensitivity to various proapoptotic stimuli. Careful analysis of proteosomal subunits and proteasome enzymatic activities showed that neither the composition nor the activity of the proteasome was affected in velcade-resistant cells.In addition, pangenomic profiling of velcade-sensitive and resistant cells showed that the small heat shock protein HSPB8 was overexpressed in resistant cells. Finally, gain and loss of function experiment demonstrated that HSPB8 is a key factor for velcade resistance. In conclusion, HSPB8 plays an important role for the elimination of aggregates in velcade-resistant cells that contributes to their enhanced survival. Multiple myeloma (MM) evolves from a premalignant condition known as monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS). However, the factors underlying the malignant transformation of plasmocytes in MM are not fully characterized. We report an MM phenotype in transgenic mice with Eμ-directed expression of the Bcl-B protein. With age, Eμ-bcl-b transgenic mice develop the characteristic features of human MM. In addition, this MM-like disease is serially transplantable, underlying the tumoral origin of plasmocytes.

Le myélome multiple (MM) est une néoplasie B caractérisée par l’accumulation d’un clone plasmocytaire dans la moelle osseuse. Des études ont démontré que les modifications épigénétiques comme la méthylation de l’ADN jouent un rôle dans la régulation d’expression de différents gènes associés au cancer. Dans une étude récente, nous avons pu décrire un score génique de méthylation de l’ADN permettant de prédire la sensibilité des cellules de MM aux inhibiteurs de DNMT (DNA methyltranfexrase) (Moreaux, et al 2012). Parmi les gènes dont l’expression est inhibée par les inhibiteurs de DNMT et associés avec un pronostic péjoratif chez les patients atteints de MM, nous avons identifié RECQ1. RECQ1 est une hélicase de la famille RECQ qui s’associe aux origines de réplication durant la phase S du cycle cellulaire et joue un rôle important dans l’élongation des fourches de réplication. RECQ1 est fortement exprimé dans différents types de tumeurs solides et l’inhibition de RECQ1 conduit à la catastrophe mitotique et inhibe la croissance de tumeurs solides. Le but de notre projet a été de caractériser la fonction de RECQ1 dans la physiopathologie du MM et les mécanismes de résistance aux traitements. Afin d’étudier le rôle biologique de RECQ1 dans les plasmocytes tumoraux, nous avons utilisé des vecteurs lentiviraux pour induire de façon inductible la surexpression ou l'inhibition de RECQ1. La déplétion de RECQ1 dans les cellules de MM entraîne une inhibition de la croissance, une induction significative d’apoptose et la formation de foyers 53BP1 indiquant la présence de cassures d’ADN double brin. Une forte expression de RECQ1 étant associée à un mauvais pronostic et la déplétion de RECQ1 conduisant à une induction de cassures d’ADN double brin, nous nous sommes demandé si l’inhibition de l’expression de RECQ1 pourrait sensibiliser les cellules de MM aux agents génotoxiques utilisés dans le traitement du MM. La déplétion de RECQ1 sensibilise, de façon significative, les cellules de MM au melphalan suggérant que l’association d’un inhibiteur de DNMT pour cibler RECQ1 et du melphalan pourrait avoir un effet synergique chez les patients RECQ1++. La surexpression de RECQ1 protège les lignées cellulaires de myélome contra l'apoptose induite par melphalan et bortézomib. De plus, l'épuisement RECQ1 sensibilise les cellules de myélome de traitement est démontré que RECQ1 interagit avec des protéines impliquées dans différentes voies de réparation des dommages de l’ADN : PARP1 (NHEJ/BER), RAD51 (HR), MSH2 et MSH6 (Mismatch repair). RECQ1 interagit avec PARP1 dans la fraction chromatinienne des cellules de MM mais pas avec RAD51 ni MSH2. Cette interaction est significativement induite en présence de melphalan. Des inhibiteurs de PARP sont actuellement en développement préclinique ou en essai clinique. De façon intéressante, la déplétion de RECQ1 sensibilise significativement les cellules de MM à un inhibiteur de PARP in vitro suggérant que l’association d’un inhibiteur de DNMT pour cibler RECQ1 et d’un inhibiteur de PARP pourrait avoir un intérêt thérapeutique dans le MM. Nous avons également confirmé que des doses sous-létales d’inhibiteur de DNMT sensibilisent les cellules de MM au melphalan in vitro. / Multiple myeloma (MM) is a plasma cell cancer with poor survival, characterized by the clonal expansion of multiple myeloma cells (MMCs), primarily in the bone marrow. Using a microarray-based genome-wide screen for genes responding to DNA methyltransferases (DNMT) inhibition in MM cells, we identified RECQ1 among the genes downregulated by DNMT inhibitor. RECQ helicase are DNA unwinding enzymes involved in the maintenance of chromosome stability. RECQ1 silencing in cancer cells results in mitotic catastrophe and prevents tumor growth in murine models. RECQ1 is significantly overexpressed in primary myeloma cells compared to normal plasma cells and in myeloma cell lines compared to primary myeloma cells of patients. High RECQ1 expression is associated with a poor prognosis in two independent cohorts of patients. RECQ1 knock down inhibits growth of myeloma cells and induces apoptosis. Given the known role of RECQ1 in replication and DNA repair activation, the effect of RECQ1 depletion in DNA damage response was investigated. RECQ1 depletion induced spontaneous accumulation of DNA double strand breaks (DSBs) evidenced by the phosphorylation of ATM and H2AX histone and detection of 53BP1 foci. Using an alkaline comet assay, a significant increase in DNA strand breaks was confirmed in RECQ1 depleted cell lines compared to control. RECQ1 depletion was associated with CHK1 and CHK2 phosphorylation in MM cells. Since RECQ1 depletion is associated with DNA damage response activation and DNA strand breaks formation, a link between RECQ1 expression and drug sensitivity was hypothesized. RECQ1 overexpression significantly protects myeloma cell lines from melphalan and bortezomib-induced apoptosis. Furthermore, RECQ1 depletion sensitizes myeloma cells to treatment. Using immunoprecipitation, RECQ1 was shown to interact with PARP1 but not RAD51 or MSH2. An increased association of the two proteins was found upon DNA damages induced by melphalan. In agreement, RECQ1 depletion sensitizes myeloma cell lines to PARP inhibitor. We identified RECQ1 as a miR-203 target. Interestingly, aberrant methylation of miR-203 was reported in MM cells and treatment with 5-aza-2’-deoxycitidine led to promoter demethylation and miR-203 re-expression. Furthermore, anti-miR-203 treatment induced a significant increase of RECQ1 mRNA level in MM cells.In conclusion, RECQ1 represent a biomarker of drug resistance in MM, which is targeted by DNMT inhibitors. This suggests association of alkylating agents and/or PARP inhibitors with DNMT inhibitor may represent a therapeutic approach in RECQ1high patients associated with a poor prognosis.

Les mécanismes épigénétiques jouent un rôle essentiel dans la régulation de l’expression des gènes. L’enzyme du complexe répresseur Polycomb II EZH2, capable de triméthyler la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) est impliquée dans la régulation de nombreux processus normaux, tels que le développement et la différenciation cellulaire. Les plasmocytes jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire humorale. La différenciation des lymphocytes B en plasmocytes (PCD) est finement régulée par un réseau de facteurs de transcription impliqué de l’induction et le maintien de l’identité de ces deux types cellulaires. Par ailleurs, peu de mécanismes épigénétiques ont été décrits dans la PCD. En utilisant un modèle in vitro de PCD développé dans notre laboratoire, nous avons mis en évidence une surexpression d’EZH2 dans le stade préplasmablaste (prePB) de la PCD. Grâce à l’analyse globale des séquences d’ADN associées à EZH2 et H3K27me3 dans ce type cellulaire, nous avons montré que l’enzyme était capable de réprimer l’expression de gènes impliqués dans différentes fonctions des lymphocytes B et des plasmocytes. EZH2 est également capable de se fixer sur le promoteur de gènes actifs dans les prePB, impliqués dans la régulation de la prolifération de ces cellules. En outre, nous avons montré que l’inhibition chimique d’EZH2 dans notre modèle résultent en une dérégulation transcriptionnelle associée à une accélération du processus de différenciation. Nos résultats suggèrent qu’EZH2 est impliqué dans le maintien de l’état transitoire, immature et prolifératif des prePBs via la régulation de gènes, dépendante et indépendante de H3K27me3, favorisant l’amplification des cellules à défaut de leur différenciation en plasmocytes. Des anomalies de séquence ou de l’expression d’EZH2 ont été mis en évidence de nombreux cancers hématologiques et solides. Le myélome multiple (MM) est une hémopathie caractérisée par l’accumulation de plasmocytes tumoraux dans la moelle osseuse. Nos travaux ont notamment permis d’identifier une surexpression des membres du complexe Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) dans les cellules de MM, en association avec leur prolifération. Afin de comprendre le rôle de PRC2 dans le MM, nous avons utilisé un inhibiteur de l’activité méthyltransférase d’EZH2 (EPZ-6438). L’effet de l’inhibiteur d’EZH2 sur la prolifération et la survie des cellules de MM est très hétérogène. En effet, les cellules sensibles présentent un arrêt du cycle cellulaire et entrent en apoptose. De manière intéressante, la résistance des cellules de MM à l’inhibiteur d’EZH2 pourrait être médiée induite par la méthylation des promoteurs des gènes cibles de PRC2. Nous avons ainsi établi un score (EZ-score), basé sur l’expression des gènes, permettant d’identifier des patients de mauvais pronostic pouvant bénéficier d’un traitement avec un inhibiteur d’EZH2. Nous avons également mis en évidence un effet synergique de EPZ-6438 et du Lenalidomide, un agent immuno-modulateurs utilisé en traitement conventionnelle du MM. Cette inhibition de la croissance cellulaire est notamment due à l’induction de l’expression de facteurs de transcription, spécifiques des lymphocytes B, et des suppresseurs de tumeurs en association avec la répression de l’expression de MYC. Aussi, un prétraitement avec l’inhibiteur d’EZH2 permet de surmonter la résistance des cellules tumorales au Lenalidomide. Ces données suggèrent que le ciblage de PRC2 pourrait avoir un intérêt thérapeutique chez les patients caractérisés par un mauvais pronostic et un fort EZ-score. Ainsi, l’inhibiteur d’EZH2 pourrait également permettre de resensibiliser les patients aux chimiothérapies basées sur des agents immuno-modulateurs. / Epigenetic mechanisms play an essential role in gene expression regulation. EZH2, the catalytic sub-unit of PRC2, is able to trimethylate the lysine 27 of histone H3 (H3K27me3) and is involved in the regulation of numerous normal processes, such as development and cell differentiation. Plasma cells (PCs) play a major role in the defense of the host organism against pathogens, by producing antigen-specific antibodies. B cell differentiation into PC is mediated by a fine-tuned regulatory network of cell specific transcription factors involved in B and plasma cell identity. Although numerous key actors involved in plasma cell differentiation (PCD) have been described, most of the epigenetic mechanisms associated with this process are yet to be unveiled. Using an in vitro model of PCD developed in our laboratory, we showed that EZH2 is upregulated in the preplasmablast stage (prePB) of the PCD. By analyzing DNA sequences associated with EZH2 and H3K27me3 in this cell type, we highlighted that EZH2 is recruited to and represses through H3K27me3 a subset of genes involved in B cell and plasma cell identity. Interestingly, in prePBs and PBs, EZH2 was also found to be recruited to H3K27me3-free promoters of transcriptionally active genes known to regulate cell proliferation and DNA repair. Inhibition of EZH2 catalytic activity resulted in B to PC transcriptional changes associated with PC maturation induction together with higher immunoglobulin secretion. Altogether, our data suggests that EZH2 is involved in the maintenance of prePBs/PBs transitory immature proliferative state through H3K27me3-dependent and independent gene regulation supporting their amplification. Moreover, while EZH2 overexpression was previously shown to inhibit PCD in mice, this study highlights for the first time that EZH2 inhibition can accelerate normal human PCD by prematurely inducing a plasma cell transcriptional program.EZH2 mutations or abnormal expression were shown to be involved in numerous hematological malignancies and solid tumors. Multiple Myeloma (MM) is a malignant plasma cell disease with a poor survival, characterized by the accumulation of myeloma cells (MMCs) within the bone marrow. We identified a significant upregulation of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) core genes in MM cells in association with proliferation. We used EPZ-6438, a specific small molecule inhibitor of EZH2 methyltransferase activity, to evaluate its effects on MM cells phenotype and gene expression profile. PRC2 targeting results in cell growth inhibition due to cell cycle arrest and apoptosis together with Polycomb, DNA methylation, TP53 and RB1 target genes induction. EZH2 inhibitor induced toxicity was heterogeneous in human myeloma cell lines and primary MM cells from patients. Interestingly, we found that MM cell resistance to EZH2 inhibitor could be mediated by DNA methylation of PRC2 target genes. We established a gene expression-based EZ-score allowing to identify poor prognosis patients that could benefit from EZH2 inhibitor treatment. We also demonstrated a synergistic effect of EPZ-6438 and Lenalidomide, a conventional drug used for MM treatment, through the activation of B cell transcription factors and tumor suppressor gene expression in concert with MYC repression. Moreover, EPZ-6438 pre-treatment was able to overcome MM cells resistance to lenalidomide. These data suggest that PRC2 targeting could have a therapeutic interest in MM patients characterized by high-risk EZ-score values, reactivating B cell transcription factors and tumor suppressor genes. EZH2 inhibitor could also re-sensitize MM patients to chemotherapies based on immunomodulatory agents.

Le myélome multiple (MM) est le second cancer hématologique le plus répandu après les lymphomes. Malgré une amélioration de sa prise en charge au cours des 20 dernières années, les traitements actuels ne permettent pas d’éviter les rechutes répétitives associées au développement de mécanismes de résistance. Les résistances aux traitements sont notamment expliquées par la forte hétérogénéité de la maladie qui rend nécessaire le développement de prises en charges adaptées aux profils moléculaires des patients. L’avènement des technologies de séquençage haut-débit permet d’accéder à des niveaux de plus en plus détaillés de l’hétérogénéité moléculaire tumorale, ce qui permettra de proposer des solutions plus performantes dans l’optique de développer une médecine personnalisée. Dans cet objectif, nous avons analysé l’exome, le transcriptome et l’épigénome de cellules primaires de patients et de lignées cellulaires de MM. Sur la base de ces analyses, nous avons non seulement mis en évidence de nouveaux mécanismes impliqués dans la physiopathologie du MM mais également de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, des biomarqueurs pronostiques ainsi que des signatures d’orientation thérapeutiques. Les données et résultats de nos études constituent une ressource d’intérêt pour la communauté scientifique et permettront d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MM. / Multiple myeloma (MM) is the second most common hematological malignancy after lymphoma. Recent advances in treatment have led to an overall survival of intensively-treated patients of 6-7 years. However, patients invariably relapse after multiple lines of treatment, with shortened intervals between relapses, and finally become resistant to all treatments, resulting in loss of clinical control over the disease in association with drug resistance. Treatment improvements will come from a better comprehension of tumorigenesis and detailed molecular analyses to develop individualized therapies taking into account the molecular heterogeneity and subclonal evolution. In this purpose, we analyzed the exome, transcriptome and epigenome of primary MM cells from patients and human MM cell lines. Our results have highlighted new mechanisms involved in the pathophysiology of MM as well as potential new therapeutic targets, prognostic signatures and theranostic biomarkers. The data and results of our studies represent an important resource to understand the mechanisms of tumor progression and drug resistance and develop new ways to diagnose and treat patients.

Résumé confidentiel / Confidential abstract

La réduction des inégalités d'accès aux soins a toujours été un axe majeur des politiques de lutte contre le cancer. Alors qu'il existe de nombreuses études en cancérologie solide, peu d'études avec une méthodologie correcte existent en onco-hématologie, notamment chez les patients atteints de Myélome Multiple (MM). Cette maladie a vu son pronostic transformé par l'arrivée de nouvelles thérapeutiques dont l'usage a été rapidement intégré dans les recommandations de la Société Française d'Hématologie. L'objectif de travail intitulé Parcours de Soins des patients atteints d'hémopathie maligne en Poitou Charentes était donc de décrire et d'analyser les écarts aux recommandations, en prenant le MM comme premier exemple. Grâce au registre des Cancers Poitou-Charentes et à l'exhaustivité des cas qu'il assure, notre travail a permis de déterminer des variables associées à une inégalité d'accès aux soins. Ces variables sont démographiques (âge, distance entre le domicile et l'hôpital), liées à la tumeur (maladie symptomatique ou non), mais aussi organisationnelles (niveau de l'hôpital, passage en réunion de concertation pluridisciplinaire). De plus nous avons pu montrer que ces inégalités avaient un impact sur la survie globale des patients, notamment chez les plus âgés. Notre travail se poursuit par une analyse plus fine de la survie globale et l'étude des longs survivants du Myélome Multiple. A plus long terme, nous souhaitons appliquer cette approche à d'autres hémopathies. / French national Cancer plans aimed to reduce health care inequalities. These inequalities are well known in solid cancers but few data with correct methodology exist in Hematology, especially in Multiple Myeloma (MM). The new treatments in this disease have dramatically improved Overall Survival. So guidelines of the Société Française d'Hématologie have quickly recommended the use of these new drugs. The aim of our work: Care Pathway of patients with hematological malignancies in Poitou Charentes area was to describe and analyze non compliance to guidelines. Based on the exhaustivity of the Poitou Charentes Cancer Registry, our work revealed variables associated with healthcare inequalities. They were demographical (age, distance between home and hospital), tumor-related (symptomatic MM or not) but also organizational (level of the hospital, multidisciplinary meeting). Moreover we showed that those inequalities had a negative impact on overall survival, especially in elderly people. Our work continues with more accurate analysis of overall survival and a study on MM long survivors. Longer-term studies would be to transfer this approach to other hemopathies.