Ce travail de thèse a pour objectif le développement d‘un nouvel outil thérapeutique des tumeurs cérébrales en utilisant le tropisme tumoral des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) pour véhiculer et distribuer des nanoparticules (NPs) chargées en principe actif. Une sous-population de CSMs humaines extraites à partir de la moelle osseuse de la crête iliaque de patients, les cellules MIAMI (« Marrow-Isolated Adult Multilineage Inducible‖) et deux types de NPs [NPs polymériques et nanocapsules lipides (NCLs)] ont été utilisés pour montrer la preuve de concept de cet outil thérapeutique. Nous avons montré que les cellules MIAMI incorporent efficacement ces deux types de NPs sans modification de leur potentiel souche. De plus, ces cellules sont capables de véhiculer et de distribuer les NPs in vivo au sein d‘une tumeur cérébrale. La toxicité de ce nouvel outil a été validée in vitro et in vivo dans le modèle du gliome humain U87MG en utilisant des cellules MIAMI chargées en NCLs de ferrociphenol. La sureté de l‘utilisation des cellules MIAMI, en tant que vecteurs cellulaires, a également été étudiée. Nous avons montré que les cellules MIAMI n‘étaient pas capables de se transformer in vitro et in vivo. Cependant, l‘interaction des cellules MIAMI avec les cellules gliales tumorales semble être gliome dépendant suggérant que des investigations supplémentaires doivent être réalisées pour s‘assurer de la sureté des cellules MIAMI. L‘ensemble de ce travail de thèse a montré que les cellules MIAMI combinées à des NPs pour délivrer spécifiquement un principe actif au sein d‘une tumeur cérébrale constituent un outil prometteur dans la thérapie du gliome.

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme et représente un problème de santé publique majeur. L'agressivité des tumeurs mammaires varie notamment en fonction de leurstatut pour le récepteur α des oestrogènes (ERα). Les cancers du sein n'exprimant pas ERα ont unmauvais pronostic, de part leur capacité métastatique plus importante. Cependant, les facteurs sous jacents à cette plus grande agressivité des cancers ERα-négatifs restent mal compris. Il est aujourd'hui admis que la progression tumorale et la dissémination métastatique dépendent, non seulement des propriétés intrinsèques des cellules cancéreuses, mais également des régulations exercées sur ces cellules par le micro environnement tumoral. Les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules présentes au niveau du site tumoral, telles que les cellules leucocytaires,les cellules endothéliales, ainsi que les cellules stromales, sont nécessaires au développement et à l'évolution de la tumeur. Ces interactions sont médiées via la production d'hormones, de cytokines ainsi que de chimiokines. Les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) sont de composants essentiels du stroma tumoral. Leur rôle dans la progression des tumeurs reste, pour le moment, très controversé. L'objectif de notre projet a été de comprendre les raisons pour lesquelles les MSC peuvent favoriser ou inhiber le développement tumoral. Nous nous sommes, dans un premier temps,intéressés aux interactions entre les cellules cancéreuses mammaires et les MSC. Nous avons déterminé si le fait que les cellules cancéreuses soit métastatiques ou non modifiait le phénotype des MSC et leur réponse dans les régulations de la croissance tumorale. Nous avons ainsi constaté quel es facteurs sécrétés spécifiquement par les cellules cancéreuses métastatiques ERα-négativesinduisaient la production de certaines chimiokines, dont CXCL5. Ces chimiokines peuvent êtressécrétées par les cellules du microenvironnement mais également par les cellules cancéreuses ellesmêmes.Nous avons donc étudié le rôle de CXCL5 dans l'agressivité des tumeurs mammaires. Nousavons ainsi montré que ces chimiokines induisent, in vitro, une augmentation des propriétésprolifératives, invasives et migratoires des cellules cancéreuses. Cette étude nous à permis demontrer que les chimiokines et les interactions entre les cellules cancéreuses et les MSC pouvaientêtre impliquées dans la progression tumorale ainsi que dans l'agressivité des tumeurs mammaires. / Breast cancer remains in Europe and USA the first cause of death by cancer for women.Breast cancer aggressiveness relies in particular on estrogen receptor α (ERa) status. Breast cancers which do not express ERα are more metastatic and have a poorer prognosis, than ERα-positivetumors. However underlying factors involved in these invasive properties are poorly understood.Today, it is established that tumor progression is regulated by intrinsic cancer cells properties, and byinteractions between cancer cells and surrounding microenvironment. Several evidences suggest thatleukocytes, endothelial cells, fibroblasts and infiltrating cells present in stromal compartment caninteract with tumor cells through the production of hormones, cytokines and chemokines.Mesenchymal stromal cells (MSC) belong also to the stromal compartment. Recent studies havehighlighted their potential role in cancer growth and metastasis. However, the ability of MSC to favor orprevent cancer progression remains controversial. The aim of this work was to understand the roles ofMSC in tumor progression and to explain the differential effects of MSC on cancer cells, depending onthe type of cancer cells involved. First, we were analyzed MSC and cancer cells interactions, anddetermined if metastatic cancer cells could affect MSC phenotypes and its response in terms of tumorgrowth. We observed that metastatic breast cancer cells secreted factors, which could highly enhancethe release by MSC of several chemokines, including CXCL5. CXCL5 can be secreted by stromal cellsbut also by cancer cells themselves. We next showed in vitro that CXCL5 increased proliferative,invasive and migratory properties of breast cancer cells. This study allowed us to demonstrate thatchemokines play a role in the cross-talk between MSC and breast cancer cells, and that they play akey role in tumor proliferation and aggressiveness.

Les douleurs viscérales chroniques font partie des effets secondaires des patients traités pour des cancers de la zone pelvienne. Ces douleurs peuvent affecter grandement la qualité de vie de ces patients. Dans les cas les plus graves, il n'existe pas de traitement analgésique efficace. Ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces constitue un enjeu majeur. Au sein de notre laboratoire, le potentiel réparateur et immuno-modulateur des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) a déjà été démontré dans un modèle d'ulcération colorectale radio-induite chez le rat. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'évaluer d'abord la pertinence de l'utilisation de ce modèle pour l'étude de l'hypersensibilité viscérale persistante radio-induite, puis, le bénéfice thérapeutique de l'utilisation des CSM comme agent antinociceptif. Nous avons dans un premier temps démontré, dans ce modèle, le maintien au cours du temps d'une hypersensibilité viscérale associée à une sensibilisation centrale persistante après irradiation, validant ainsi le modèle. Nous avons ensuite montré l'implication des mastocytes (MC) et suggéré l'implication du neuromédiateur NO dans les mécanismes de la sensibilisation périphérique sous-tendant une telle hypersensibilité. Nous avons enfin mis en évidence que le traitement par des CSM permettait la réduction de l'hypersensibilité viscérale radio-induite persistante. La capacité des CSM à moduler l'activation des MC et/ou leurs interactions avec les fibres nerveuses pourrait être impliquée dans leur action antinociceptive. En conclusion, ce travail a permis d'élargir le spectre d'action thérapeutique des CSM dans notre modèle d'étude. / Patients who undergo pelvic radiotherapy may develop significant incidence of undesirable chronic gastrointestinal complications resulting from radiation-induced damages around the tumour. Chronic visceral pain is one of the radiation-induced side effects that greatly affects the quality of life of “cancer survivors”. The lack of effective analgesic treatment highlights the importance of novel and effective therapeutic strategies. In our laboratory, mesenchymal stromal cell (MSC) based approach showed beneficial immunomodulatory and regenerative effects in a rat model of irreversible radiation-induced colonic ulcers. The goal of my work was to assess the relevance of this model to study radiation-induced visceral persistent hypersensitivity and its modulation by MSC treatment. We first demonstrated that this model is associated with long-lasting visceral hypersensitivity and central neuronal sensitization. In this context we showed then that mast cells (MC) are involved in the mechanism of peripheral sensitization. Moreover, we suggested the implication of the neuromediator NO• in the pathophysiology of persistent radiation-induced visceral hypersensitivity. We also suggested that MSC treatment reversed radiation-induced hypersensitivity by a mechanism that in part may involve the modulation of MC activation and/or the decrease in the number of MC and nerve fiber interactions. In addition, MSC treatment reduced the percentage of nitrinergic neurons, increased after irradiation, and restored colonic muscular contractibility. Such processes may promote the therapeutic benefit of MSC observed in our study. In conclusion, this work provided new insights on the therapeutic benefit of MSC in our study model and a new argument in favour of their use in a future clinical trial to cure abdominopelvic radiotherapy side effects.

Au cours des dernières décennies, la radiothérapie s'est imposée comme étant un outil majeur dans le traitement des cancers de la zone abdomino-pelvienne. Malgré les évolutions technologiques, la radiothérapie reste associée à des effets secondaires pouvant parfois être très handicapants, principalement dus à la toxicité des rayonnements ionisants pour les tissus sains entourant la tumeur. Dans le cadre des radiothérapies abdomino-pelviennes, ces effets secondaires vont majoritairement toucher le tractus gastro-intestinal, très sensible aux radiations. La mise au point de traitements curatifs est donc devenue une priorité. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont montré leurs capacités de régénération tissulaire et d'immunomodulation dans de nombreux modèles. Durant ma thèse, nous avons voulu mettre en évidence le bénéfice thérapeutique apporté par les CSM dans le traitement des lésions radio-induite, ainsi que les mécanismes sous-jacents. Nos résultats nous ont permis de démontrer l'efficacité de notre traitement, avec un effet à la fois sur la structure et sur les fonctions contractiles coliques. Nous avons pu montrer que cette efficacité thérapeutique dépend de deux processus. La stimulation de la prolifération épithéliale par la voie Wnt permet ainsi d'améliorer la régénération épithéliale. Une sécrétion locale accrue de corticostérone permet quant à elle de diminuer le nombre et l'état d'activation des lymphocytes T. Nos résultats suggèrent également l'existence d'un lien entre les deux phénomènes observés, donnant une nouvelle preuve des effets combinatoires de la thérapie par CSM

Abstract: Human skeletal muscle is an essential source of various cellular progenitors with potential therapeutic perspectives. Muscle-resident mesenchymal stromal cells (mrMSCs) are thought to be involved in the development of several regenerative disorders such as fatty degeneration, heterotopic ossification and fibrosis. Identifying the cell population responsible for these pathologies will help better understand the underlying mechanisms and lead to more efficient treatment. We first developed an isolation method and culture conditions for the proliferation and maintenance of the adherent fraction of human skeletal muscle derived cells. To further enrich the cell population as multipotent progenitors, we used fluorescent-activated cell sorting (FACS) and known mesenchymal stromal cell (MSC) markers. The enriched cell populations obtained were tested for their multipotent capabilities towards the osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. The CD73 + CD 105+ CD90- subset of human skeletal muscle adherent cells displayed robust multipotence to all three lineages under the appropriate differentiation conditions. Clonal differentiation assays confirmed that all three lineages stem from a single multipotent progenitor. Furthermore, this cell subset was able to differentiate into brown adipocyte-like cells, expressing UCP1 at the RNA and protein levels following prolonged stimulation with rosiglitazone (ROS). This result suggests that this cell subset could also represent a human cell model for brown adipogenesis. The cell isolation and enrichment method presented in this thesis represent a novel technique to obtain human mrMSCs. This method holds great promise for future clinical applications with the enriched cell populations since they are expanded in a defined medium, which supports inter-laboratory reproducibility. Furthermore, the phenotypic markers chosen for the FACS isolation are well conserved amongst donors in the proposed conditions, limiting donor-to-donor variability.||Résumé: Le muscle squelettique humain est une source essentielle de cellules progénitrices ayant plusieurs applications thérapeutiques potentielles. Les cellules stromales mésenchymateuses du muscle squelettique humain (hmrMSCs) semblent être impliquées dans des pathologies telles l’ossification hétérotopique, la dégénérescence graisseuse et la fibrose. L’identification de la population cellulaire à l’origine de ces pathologies permettrait de mieux comprendre les mécanismes derrières celles-ci et aiderait à la création de traitements plus efficaces. Nous avons d’abord mis au point une méthode d'isolement et déterminer des conditions de culture pour la prolifération et le maintien en culture de la fraction cellulaire adhérente dérivée du muscle squelettique humain. Par le biais de la cytométrie en flux et des marqueurs connus des cellules stromales mésenchymateuses (MSC), nous avons pu enrichir les cellules stromales multipotentes. Le potentiel ostéogénique, adipogénique et chondrogénique des populations cellulaires enrichies a été évalué par des essais de différenciation. La sous-population de cellules CD73[indice supérieur +]CD105[indice supérieur +]CD90[indice supérieur -] a montré une multipotence robuste sur les trois lignées étudiées. Des essais de différenciation clonale ont confirmés que les trois lignées obtenues proviennent tous d’un progéniteur multipotent commun. De plus, cette sous-population cellulaire avait la capacité de se différencier en cellule de gras brun, démontrée par une expression élevée d’UCP1 au niveau génique et protéique suivant une stimulation continue avec le rosiglitazone (ROS). Ce résultat suggère que cette sous-population cellulaire pourrait également représenter un modèle pour l’adipogenèse vers le gras brun. La méthode d’enrichissement présentée représente une nouvelle technique afin d’obtenir des hmrMSCs. Elle semble prometteuse pour de futures applications cliniques employant ces cellules, étant donné qu’elles sont amplifiées dans un milieu défini permettant une reproductibilité interlaboratoire. De plus, les marqueurs de phénotype choisis pour l’enrichissement par cytométrie en flux sont bien conservés entre individus, limitant la variabilité inter-donneur.[symboles non conformes]

Les douleurs viscérales chroniques font partie des effets secondaires des patients traités pour des cancers de la zone pelvienne. Ces douleurs peuvent affecter grandement la qualité de vie de ces patients. Dans les cas les plus graves, il n'existe pas de traitement analgésique efficace. Ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces constitue un enjeu majeur. Au sein de notre laboratoire, le potentiel réparateur et immuno-modulateur des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) a déjà été démontré dans un modèle d'ulcération colorectale radio-induite chez le rat. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'évaluer d'abord la pertinence de l'utilisation de ce modèle pour l'étude de l'hypersensibilité viscérale persistante radio-induite, puis, le bénéfice thérapeutique de l'utilisation des CSM comme agent antinociceptif. Nous avons dans un premier temps démontré, dans ce modèle, le maintien au cours du temps d'une hypersensibilité viscérale associée à une sensibilisation centrale persistante après irradiation, validant ainsi le modèle. Nous avons ensuite montré l'implication des mastocytes (MC) et suggéré l'implication du neuromédiateur NO dans les mécanismes de la sensibilisation périphérique sous-tendant une telle hypersensibilité. Nous avons enfin mis en évidence que le traitement par des CSM permettait la réduction de l'hypersensibilité viscérale radio-induite persistante. La capacité des CSM à moduler l'activation des MC et/ou leurs interactions avec les fibres nerveuses pourrait être impliquée dans leur action antinociceptive. En conclusion, ce travail a permis d'élargir le spectre d'action thérapeutique des CSM dans notre modèle d'étude.

La première partie de ce travail introduit un nouveau concept d'analyse des enregistrements des essais cliniques et de la dynamique de leur évolution, aussi bien thématique que temporelle. Ce concept a été appliqué à la médecine régénérative, démontrant l'absence de corrélation entre la source de cellules souches et le champ d'application. Les pathologies odonto-stomatologiques sont très peu concernées par les essais cliniques en thérapie cellulaire par cellules souches. Pourtant les parodontites, pathologies immuno-infectieuses responsables de la destruction du tissu de soutien des dents, constituent un enjeu majeur de santé publique. Bien que les auteurs s'accordent sur la responsabilité de l'écologie immunitaire et microbienne dans la physiopathologie de la maladie, les raisons de la dysbiose, de la susceptibilité individuelle sont encore mal connues. La greffe de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) permettrait le retour à l'homéostasie en favorisant l'activation des CSM endogènes. La deuxième partie de ce travail démontre que les parodontites ont été potentiellement associées avec 57 pathologies systémiques ; le registre des essais cliniques de l'Organisation Mondiale de la Santé ayant été analysé. L'efficacité et la sureté de l'utilisation des CSM pour la régénération parodontale dans des modèles animaux ont été également démontrées. Pourtant, les modèles utilisés souffraient de problèmes méthodologiques dont la faible représentativité physiopathologique des lésions parodontales générées. Cette deuxième partie apporte donc des données quant à l'efficacité des ASC (CSM du tissu adipeux) pour améliorer de manière quantitative et qualitative la régénération des tissus de soutien parodontaux dans un modèle murin où les lésions parodontales ont été générées par l'administration répétée de bactéries parodonto-pathogènes. Il s'agit donc d'un modèle dont la physiopathologie est plus proche de celle retrouvée chez l'Homme. Enfin, la deuxième partie démontre un effet antibactérien à large spectre des ASC dont l'effet est à la fois direct (effet macrophage-like) et indirect (via la sécrétion de facteurs antibactériens). / The first part of this work introduces a new concept of analysis of clinical trial records and the dynamics of their evolution, both thematic and temporal. This concept has been applied to regenerative medicine, showing the lack of correlation between the source of stem cells and the fields of application. The stomatognathic diseases are few involved in clinical trials for stem cells therapy. Yet periodontitis, immuno-infectious diseases responsible for the destruction of the tooth supporting tissues, are a major public health issue. While the authors agree on the responsibility of the immune and microbial ecology in the pathophysiology of the disease, the reasons for dysbiosis, individual susceptibilities, are still unclear. Graft of mesenchymal stromal cells (MSCs) would return to homeostasis by promoting the activation of endogenous MSCs. The second part of this work shows that periodontitis were potentially associated with 57 systemic diseases; the clinical trials registry of the World Health Organization have been analyzed. The efficacy and safety of the use of MSCs for periodontal regeneration in animal models have also been demonstrated. Yet the models suffered from methodological problems, periodontal lesions are few representative of the pathophysiology. This second part thus provides data on the effectiveness of ASC (CSM from adipose tissue) to improve quantitative and qualitative regeneration of periodontal supporting tissues in a mouse model where periodontal lesions were generated by repeated administration of parodonto-pathogenic bacteria. It is therefore a model whose pathophysiology is closer to that found in humans. Finally, the second part demonstrates broad antibacterial spectrum of ASC whose effect is both direct (macrophage-like effect) and indirect (via the secretion of antibacterial factors).

La grande originalité de mon projet réside dans la génération de cellules stromales mésenchymateuses (MSCs) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Je rappellerai les propriétés phénotypiques, de multipotence et immunosuppressives des MSCs et m’attarderai sur leurs différents mécanismes immunomodulateurs. Cependant, leur nombre limité et leur isolation difficile limitent leur utilisation thérapeutique nécessitant une autre source de cellules.Mon travail a donc été de générer et de caractériser des MSCs issues d’iPS (huiPS-MSCs). L'avantage des huiPS-MSCs réside dans leur plus grande disponibilité et la possibilité d'en avoir à volonté. Encore faut-il valider l’intérêt thérapeutique potentiel de ces huiPS-MSCs. Premièrement, mes résultats in vitro montrent que les huiPS-MSCs présentent une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T (LT) activés conduisant à une induction de LT régulateurs FoxP3+ fonctionnels. Deuxièmement, dans une approche plus axée sur la thérapie, j’ai analysé in vivo l’activité́ immunosuppressive des huiPS-MSCs dans un modèle de réaction xénogénique de greffon contre l'hôte (souris immunodéficientes NSG injectées avec des LT humains). Je montre clairement, après traitement avec les huiPS-MSCs, une réduction de la proportion de LT humains producteurs de cytokines inflammatoires (IFNγ et TNFα) typiques de la pathologie et l’apparition concomitante de LT présentant un phénotype régulateur (production d’IL10 et expression de FoxP3). La fin de mon travail a été de caractériser moléculairement la régulation de l’expression de PD-L1, une molécule immuno-régulatrice puissante, entre les MSCs issues de la moelle osseuse (BM-MSCs) de donneurs sains et nos huiPS- MSCs. Les huiPS-MSCs ont une expression constitutive de PD-L1, qui est absente sur les BM-MSCs. J’ai analysé les microARNs susceptibles de limiter l’expression de PD-L1, j’ai pu en identifier plusieurs. En mesurant leur expression dans les différentes MSCs à notre disposition, je montre que cette expression est inverse par rapport à celle de PD-L1. J’ai ainsi pu démontrer l’activité immunosuppressive de nos huiPS-MSCs in vitro et in vivo avec une perspective d’induction de tolérance immune, et caractériser la régulation de l’expression de PD-L1, molécule immunosuppressive exprimée par les huiPS-MSCs. / The mesenchymal stromal cells (MSCs) present many features that render attractive as therapeutic cells. Their phenotype, multipotency and immunosuppressive properties are well described. Nevertheless, major restriction for their clinical use is due to the limited in vitro expansion and low quantity of cells that can be collected from adult tissues. The originality of my project consisted in the generation of mesenchymal stromal cells (MSCs) from human induced pluripotent stem cells (iPS). These huiPS-MSCs could fulfill some of the specification required to improve MSCs use in therapeutic approaches: welldefined and unlimited number of cells with reproducible functional characteristics. In a first approach, I characterized the huiPS-MSCs generated in the laboratory. My results highlight the immunosuppressive activity in vitro of the huiPS-MSCs on T-cell stimulation that induces a switch in T-cell cytokine polarization toward the generation of Treg cells. Secondly, in a more therapy-oriented approach, I analyzed in vivo immunosuppressive activity of huiPS-MSCs in a xenogeneic graft versus host model (NSG immunodeficient mice injected with human T lymphocytes). My data showed significantly reduced percentages of human-differentiated T cells producing Th1 inflammatory cytokines (IFNγ and TNFα). By contrast, T cells producing IL-10 and FoxP3+ Treg cells, absent in nontreated animals, were detected in huiPS-MSCs treated mice, confirming the in vitro results of a tolerizing process. The end of my work was to characterize the molecular regulation of the expression of PDL1, an immunoregulatory molecule expressed by the MSCs. Comparing bone marrow MSCs (BM-MSCs) from healthy donors and our huiPS-MSCs, I showed that the huiPSMSCs have a constitutive expression of PD-L1, which is absent on BM-MSCs. Analysing microRNAs that could limit the expression of PD-L1, I could identify several microRNAs which expression is inverse to the expression of PD-L1. For the first time, my results highlight the immunosuppressive activity of huiPS-MSCs on human T-cell stimulation with a concomitant generation of human Treg cells in vivo and characterize the regulation of PD-L1 expression, an immunosuppressive molecule expressed by the MSCs. They may favor the development of new tools and strategies based on the use of huiPS cells and their derivatives for the induction of immune tolerance.

Introduction : L’efficacité de la greffe d’îlots n’est plus à démontrer mais elle reste l’objet de recherches pour améliorer la qualité et la survie des îlots greffés souvent fragilisés par la destruction enzymatique de leur microenvironnement lors de la procédure d’isolement. Dans ce contexte, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) d’origine pancréatique représentent un outil intéressant par leurs propriétés d’immunomodulation et par leur capacité de sécrétion de facteurs du microenvironnement. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’effet des cellules stromales pancréatiques humaines sur les cellules β humaines.Méthodes : Des îlots humains purifiés ont été maintenus en culture pendant plusieurs jours. Les cellules adhérentes se formant en périphérie de l’îlot ont été sélectionnées et immortalisées. Ces nouvelles cellules « human islet-derived stromal cells » (hISC) ont ensuite été caractérisées pour déterminer leur profil mésenchymateux Nous avons ensemencé des cellules β humaines (lignée EndoC-βH1 ou cellules primaires) sur du milieu conditionné de hISC (hISC-CM) utilisé comme support de culture. L’adhérence, la survie, la prolifération, l’insulinosécrétion des cellules β cultivées sur le hISC-CM ont été mesurées et comparées à un support contrôle : la poly-L-lysine.Résultats : Les hISC présentent un profil phénotypique et transcriptomique très proche des CSM issues de la moelle osseuse. D’un point de vue fonctionnel, les hISC présentent une capacité d’immunomodulation. Elles expriment et sécrètent des protéines matricielles connues pour être présentes autour et à l’intérieur des îlots humains tels que les collagènes de type I, IV et VI, la laminine et la fibronectine. Au contact du hISC-CM les cellules EndoC-βH sur adhèrent st s’étalent. Le hISC-CM augmente l’expression du marqueur de prolifération PCNA et améliore la survie et la fonction des cellules EndoC-βH1. D’un point de vue mécanistique, l’interaction cellules β/hISC-CM active la phosphorylation de FAK (focal adhesion kinase) et ERK (extracellular signal-regulated kinases). A l’interface de cette interaction, la sous-unité β1 de l’intégrine est impliquée dans les effets observés du hISC-CM sur l’adhérence et la fonction des cellules β.Conclusion : Nos travaux démontrent l’intérêt prometteur des hISC en tant que cellules de soutien des cellules β humaines par la sécrétion de protéines matricielles pancréatiques. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le maintien des îlots en culture et leur conditionnement dans un microenvironnement plus physiologique permettant ainsi de préserver leur qualité fonctionnelle lors de la greffe. / Introduction : The efficacy of islet transplantation is well established. However, the procedure still needs improvements in the quality of grafted islets, often weakened by the loss of their surrounding tissue during the isolation process. In this respect, mesenchymal stromal cells (MSC) represent an interesting tool as they have immunomodulatory and anti-inflammatory properties and are known to secrete proteins involved in creating a favorable microenvironment. This work aims to investigate the effect of human pancreatic stromal cells on human β-cells.Methods : We characterized the mesenchymal profile of cells, previously immortalized in our lab from human islets of Langerhans adherent cells, hereafter named hISC (human islet-derived stromal cells). We seeded human β-cells (EndoC-βH1 cell line or primary β-cells) on hISC-conditioned medium (hISC-CM) used as coating of Petri dishes. We assessed spreading, survival, proliferation and glucose-induced insulin secretion of β-cells cultured on hISC-CM as compared to poly-L-lysine coating.Results : Phenotypic and transcriptomic profiles of hISC are close to bone-marrow MSC. The hISC have an immunomodulation capacity. They express and secrete extracellular matrix proteins known to be present around and within human islet such as types I, IV and VI collagens, laminin and fibronectin. EndoC-βH1 seeded on hISC-CM adhere and spread on cell culture surface. We show that hISC-CM has positive effects on EndocC-βH1 proliferation, survival and glucose-induced insulin secretion, as compared to poly-L-lysine. From mechanistic point of view, hISC-CM induces FAK (focal adhesion kinase) and ERK (extracellular signal-regulated kinases) phosphorylations. The β1-integrin subunit is involved in both adhesion and increased insulin secretion of β cells induced through hISC-CM.Conclusion : Our work demonstrates a promising interest of hISC as support cells for human β-cells by scaffolding factors secretion. It opens new perspectives for conditioning human β-cells in a more physiological microenvironment to preserve their functional quality before and after transplantation.

La myélofibrose primitive (MFP) est un néoplasme myéloprolifératif chromosome Philadelphie négatif rare, mais de pronostic sévère. Elle se caractérise par une prolifération clonale et une mobilisation des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSH/PH) de la moelle osseuse vers la rate et le foie. Cette anomalie de l’hématopoïèse est associée à une pathologie du stroma (myélofibrose, ostéosclérose et néoangiogenèse). L’existence d’anomalies moléculaires de la CSH/PH telles que les mutations de Jak2, Mpl, TET2 ou CALR ne permet pas à elle seule d’expliquer la physiopathologie de la maladie. Les résultats obtenus dans le laboratoire suggèrent que le microenvironnement médullaire au sein des niches hématopoïétiques et en particulier les cellules stromales mésenchymateuses (CSM), participe vraisemblablement à cette dérégulation de l’hématopoïèse, favorisant le développement du clone pathologique. Cependant, aucune preuve tangible d’une altération des CSM médullaires n’a été jusqu’à présent apportée.Dans ce travail, nous avons isolé les CSM de la moelle de patients atteints de MFP et réalisé une caractérisation « complète » de ces cellules : prolifération, phénotype, soutien de l’hématopoïèse, sécrétome, transcriptome, miRNome et capacités de différenciation. Nos résultats ont permis de dégager un faisceau d’arguments en faveur d’une dérégulation de leur différenciation ostéoblastique (DOB). (i) Les cytokines BMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF et Il-6 sont significativement produites en plus grande quantité par ces cellules. (ii) L’étude du transcriptome a révélé une expression significativement différente d’un ensemble de gènes impliqués dans la DOB tels que RUNX2, DLX5, TWIST1 et NOGGIN. (iii) De nombreux micro-ARN, dont certains sont connus pour être impliqués dans la DOB comme miR-210 ou dans le nichage des cellules souches hématopoïétiques comme miR-34a, sont dérégulés à l’état basal et au cours de cette DOB. (iv) Enfin, l’étude de leurs capacités de différenciation ostéoblastique in vitro et in vivo chez la souris immunodéprimée est en faveur d’une augmentation de ces capacités. Nous avons étudié l’impact du TGF- β1 dans cette DOB. Nous avons mis en évidence que les CSM de malades présentent un état basal d'activation de la voie de signalisation pSmad significativement augmenté, confirmant l’expression endogène de TGF-β1. En utilisant des inhibiteurs spécifiques du récepteur de type I au TGF- β, nous avons montré l’implication de cette cytokine dans les altérations de la DOB. En conclusion, notre travail montre pour la première fois que les CSM des malades de MFP sont anormales et ce indépendamment de la stimulation par le clone hématopoïétique pathologique, suggérant la présence d'anomalies constitutives ou acquises. Ces anomalies impliquent deux acteurs majeurs de la pathologie : le TGF-β1 et l'ostéogenèse. / Primary myelofibrosis (PMF) is a Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm, rare but associated with a poor prognosis. Its features are a clonal proliferation and an egress of hematopoietic stem cells (HSC) from bone marrow to spleen. These abnormalities of hematopoiesis are in relation with a pathological stroma (myelofibrosis, osteosclerosis and neoangiogenesis). Molecular abnormalities present in HSC partially explain the physiopathology of the disease. Results from our lab suggest that the bone marrow micro-environnement, especially mesenchymal stromal cells (MSC), are involved in the deregulation of hematopoiesis, promoting the clonal cells. However, there is no strong evidence of bone marrow MSC alterations reported for now.In our study, we isolated MSC from bone marrow of patients suffering from PMF and performed a broad characterization: proliferation, phenotype, hematopoiesis supporting capacities, secretome, transcriptome and miRNome analysis. Our results highlight arguments in favor of a deregulation of their osteogenic capacities. (i) Cytokines NMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF and Il-6 were significantly overproduced by MSCs. (ii) Transcriptome analysis revealed a specific signature involving genes participating in osteogenic differentiation such as RUNX2, DLX5, TWIST1 and NOGGIN. (iii) Many micro-RNAs, some know to be involved in osteogenic differentiation regulation, as mir-34a, are deregulated in MSCs and in MSC-derived osteoblasts. (iv) Finally, study of their osteogenic potency in vitro and in vivo in nude mice showed an increasing of their osteogenic potency. We studied the impact of TGF-β1 in this process and showed that PMF MSCs showed a basal expression of Smad pathway significantly increased as compared to control. Using specific inhibitor of TGF-β1 receptor, we demonstrated the implication of this cytokine in the osteogenic impairment.To summarize, our work shows for the first time that MSCs from PMF patients are abnormal, independently from stimulation by clonal cells, suggesting intrinsic abnormalities. These abnormalities involve two main factor of the disease: TGF-β1 and osteogenesis.