La myélofibrose primitive (MFP) est un néoplasme myéloprolifératif (NMP) chronique BCR-ABL1-négatif associant une dérégulation de l’hématopoïèse (myéloprolifération, dysmégacaryopoïèse et migration des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSH/PH)) à une altération du stroma médullaire et splénique (fibrose ostéomyélosclérose, néoangiogenèse). Le mégacaryocyte (MK) est un acteur majeur de sa pathogenèse, via la production de cytokines et facteurs fibrosants, dans un contexte inflammatoire. Plusieurs arguments suggèrent que les mutations JAK2V617F et MPL515L/K qui caractérisent les NMP ne sont pas les événements initiaux de la MFP car elles ne sont retrouvées que chez la moitié des patients. L’objectif de mon travail a été de rechercher si d’autres anomalies, géniques ou non, pouvaient expliquer la pathogenèse de la MFP. Pour cela, parallèlement à une démarche génomique (transcriptome et CGH array), nous avons développé une approche de biologie cellulaire ciblée sur le rôle du stroma hématopoïétique. Bien que n’ayant pas identifié d’autres anomalies génomiques que celles décrites dans la littérature et en particulier, la délétion 13q, les approches génomiques que nous avons développées nous ont permis de préciser les bornes de cette délétion dans les PH CD34+ et les polynucléaires des patients. Cette délétion (région chromosomique minimale 13q14-13q21) est située à 2 mégabases (télomérique) du cluster FLT où est localisé le gène FLT3. Plusieurs arguments nous ont ensuite conduits à rechercher si le couple Flt3-ligand/Flt3 était impliqué dans la dérégulation de l’hématopoïèse et plus particulièrement dans la dysmégacaryopoïèse observée chez les patients. Parmi ceux-ci, citons : 1) l’existence d’une modulation d’expression de gènes inclus dans la zone de délétion 13q et dans le cluster FLT, dont le gène FLT3 et 2) le fait que Flt3, un récepteur clé de la régulation de l’hématopoïèse primitive, soit souvent impliqué dans la pathogenèse d’hémopathies malignes et que son ligand, Flt3-ligand, soit majoritairement produit par le stroma hématopoïétique. Notre étude montre une dérégulation de Flt3 et des MAPKs p38 dans les PH CD34+ et les MK des patients atteints de MFP et ceci, quelque soit leur statut mutationnel Jak2. Elle démontre également que la persistance de la stimulation de l’axe Flt3/p38 en réponse à une production accrue de Flt3 ligand, participe à la dysmégacaryopoïèse qui caractérise la maladie. En effet, nous avons mis en évidence : 1) une augmentation du taux sérique de Flt3 ligand et de son expression par les cellules du stroma médullaire et splénique ainsi que par les PH des patients atteints de MFP, 2) une surexpression spécifique de son récepteur Flt3 et de sa phosphorylation dans les CSH/PH CD34+ et les progéniteurs mégacaryocytaires (MK), qui persistent au cours de la différenciation MK, quelque soit le statut mutationnel de Jak2 des patients, 3) une activation de Flt3 dans les progéniteurs MK en réponse au Flt3 ligand conduisant à la phosphorylation en cascade de la voie de signalisation des MAPKs p38 et à l’expression de ses gènes cibles tels que AP-1, p53, NFATc4, ATF2, IL-8, 4) une restauration de la mégacaryopoïèse et une inhibition de la migration (Flt3-ligand)-dépendante des progéniteurs MK des patients après inhibition de Flt3 ou de p38.Nos résultats confirment l’importance d’une altération des MAPKs dans une dérégulation de l’hématopoïèse et soulignent le rôle d’une activation persistante de la voie p38, via le couple Flt3-ligand/Flt3, dans la dysmégacaryopoïèse qui caractérise la myélofibrose primitive. Ils suggèrent également que cette dérégulation participe au processus inflammatoire à l’origine de la réaction stromale et « lit » d’une transformation leucémique potentielle. Ce dialogue altéré entre les cellules hématopoïétiques pathologiques (Bad seeds), en particulier mégacaryocytaires et les cellules stromales (Bad soil), conforte notre concept « Bad seeds in Bad soil ». / The primary myelofibrosis (PMF) is a chronic myeloproliferative neoplasm (NMP) BCR-ABL1-negative associating a dysregulation of hematopoiesis (myeloproliferation, dysmegacaryopoiesis and egress of hematopoietic stem and progenitor cells (HSC / PH)) from an altered bone marrow stroma (osteosclerosis, fibrosis, angiogenesis) to the spleen. The megakaryocyte (MK) is a major player in its pathogenesis through the production of cytokines and fibrotic factors in an inflammatory context. Several arguments suggest that mutations JAK2V617F and MPL515L / K which characterize the NMP are not the initial events of the PMF since they are found only in half of patients. The aim of my work was to investigate whether other abnormalities, genetic or otherwise, could explain the pathogenesis of the PMF. For this, a process parallel to genomics (transcriptome and CGH array), we developed a cell biology approach focused on the role of hematopoietic stroma.Although we have not identified other genomic abnormalities as those described in the literature and in particular, deletion 13q, by genomic approaches we have clarified the limits of this deletion in the PH CD34+ and polymorphonuclear patients. This deletion (chromosomal region 13q14-13q21 minimum) is located 2 megabases (telomeric) of the cluster where is located the FLT gene FLT3. Several arguments have then led to inquire whether the couple was involved in Flt3-ligand/Flt3 deregulation of hematopoiesis, especially in the dysmegakaryopoiesis observed in patients. Among these are: 1) the existence of an expression modulation of genes included in the area of deletion 13q and FLT in the cluster, as gene FLT3 and 2) the fact that Flt3, a key receptor the regulation of primitive hematopoiesis, is often implicated in the pathogenesis of hematologic malignancies and its ligand, Flt3-ligand, was predominantly produced by the hematopoietic stroma.Our study shows dysregulation of Flt3 and p38 MAPKs in CD34+ and PH MK from patients with PMF and this, whatever their Jak2 mutation status. It also shows that persistent stimulation of the axis Flt3/p38 in response to increased production of Flt3 ligand, participates in the dysmegacaryopoiesis that characterizes the disease. Indeed, we have highlighted: 1) an increase in serum Flt3 ligand and its expression by stromal cells and bone marrow and spleen by PH patients with PMF, 2) a specific overexpression of its receptor Flt3 and its phosphorylation in HSC / PH CD34+ and megakaryocytic progenitors (MK), which persist during the MK differentiation, regardless of the mutational status of Jak2 patients, 3) activation of Flt3 in MK progenitors by the Flt3 ligand leads to phosphorylation cascade signaling pathway, p38 MAPK and expression of its target genes such as AP-1, p53, NFATc4, ATF2, IL-8, 4) a restoration of megakaryopoiesis and inhibition of migration (Flt3-ligand)-dependent patients after of MK progenitors by Flt3 or p38 inhibitors.Our results confirm the importance of an alteration of MAPKs in a deregulation of hematopoiesis and highlight the role of a persistent activation of the p38 pathway, via the couple Flt3-ligand/Flt3 in the dysmegakaryopoiesis that characterizes idiopathic myelofibrosis. They also suggest that this dysregulation contributes to the inflammatory process at the origin of the stromal reaction and "bed" of a leukemic transformation potential. The dialogue among impaired hematopoietic cell disease (Bad Seeds), especially the stromal cells and megakaryocyte (Bad Soil), reinforces our concept of "Bad Seeds in Bad Soil". This work could help improve the dialogue with therapeutic approaches targeting the axis Flt3-ligand/Flt3 mediated by activation of p38 which, by reducing the inflammatory process, re-establish a link between the "seed" and the "Soil".

La myélofibrose primitive (MFP) est un néoplasme myéloprolifératif (NMP) chronique BCR-ABL1-négatif associant une dérégulation de l'hématopoïèse (myéloprolifération, dysmégacaryopoïèse et migration des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSH/PH)) à une altération du stroma médullaire et splénique (fibrose ostéomyélosclérose, néoangiogenèse). Le mégacaryocyte (MK) est un acteur majeur de sa pathogenèse, via la production de cytokines et facteurs fibrosants, dans un contexte inflammatoire. Plusieurs arguments suggèrent que les mutations JAK2V617F et MPL515L/K qui caractérisent les NMP ne sont pas les événements initiaux de la MFP car elles ne sont retrouvées que chez la moitié des patients. L'objectif de mon travail a été de rechercher si d'autres anomalies, géniques ou non, pouvaient expliquer la pathogenèse de la MFP. Pour cela, parallèlement à une démarche génomique (transcriptome et CGH array), nous avons développé une approche de biologie cellulaire ciblée sur le rôle du stroma hématopoïétique. Bien que n'ayant pas identifié d'autres anomalies génomiques que celles décrites dans la littérature et en particulier, la délétion 13q, les approches génomiques que nous avons développées nous ont permis de préciser les bornes de cette délétion dans les PH CD34+ et les polynucléaires des patients. Cette délétion (région chromosomique minimale 13q14-13q21) est située à 2 mégabases (télomérique) du cluster FLT où est localisé le gène FLT3. Plusieurs arguments nous ont ensuite conduits à rechercher si le couple Flt3-ligand/Flt3 était impliqué dans la dérégulation de l'hématopoïèse et plus particulièrement dans la dysmégacaryopoïèse observée chez les patients. Parmi ceux-ci, citons : 1) l'existence d'une modulation d'expression de gènes inclus dans la zone de délétion 13q et dans le cluster FLT, dont le gène FLT3 et 2) le fait que Flt3, un récepteur clé de la régulation de l'hématopoïèse primitive, soit souvent impliqué dans la pathogenèse d'hémopathies malignes et que son ligand, Flt3-ligand, soit majoritairement produit par le stroma hématopoïétique. Notre étude montre une dérégulation de Flt3 et des MAPKs p38 dans les PH CD34+ et les MK des patients atteints de MFP et ceci, quelque soit leur statut mutationnel Jak2. Elle démontre également que la persistance de la stimulation de l'axe Flt3/p38 en réponse à une production accrue de Flt3 ligand, participe à la dysmégacaryopoïèse qui caractérise la maladie. En effet, nous avons mis en évidence : 1) une augmentation du taux sérique de Flt3 ligand et de son expression par les cellules du stroma médullaire et splénique ainsi que par les PH des patients atteints de MFP, 2) une surexpression spécifique de son récepteur Flt3 et de sa phosphorylation dans les CSH/PH CD34+ et les progéniteurs mégacaryocytaires (MK), qui persistent au cours de la différenciation MK, quelque soit le statut mutationnel de Jak2 des patients, 3) une activation de Flt3 dans les progéniteurs MK en réponse au Flt3 ligand conduisant à la phosphorylation en cascade de la voie de signalisation des MAPKs p38 et à l'expression de ses gènes cibles tels que AP-1, p53, NFATc4, ATF2, IL-8, 4) une restauration de la mégacaryopoïèse et une inhibition de la migration (Flt3-ligand)-dépendante des progéniteurs MK des patients après inhibition de Flt3 ou de p38.Nos résultats confirment l'importance d'une altération des MAPKs dans une dérégulation de l'hématopoïèse et soulignent le rôle d'une activation persistante de la voie p38, via le couple Flt3-ligand/Flt3, dans la dysmégacaryopoïèse qui caractérise la myélofibrose primitive. Ils suggèrent également que cette dérégulation participe au processus inflammatoire à l'origine de la réaction stromale et " lit " d'une transformation leucémique potentielle. Ce dialogue altéré entre les cellules hématopoïétiques pathologiques (Bad seeds), en particulier mégacaryocytaires et les cellules stromales (Bad soil), conforte notre concept " Bad seeds in Bad soil ". Ce travail pourrait contribuer à l'amélioration de ce dialogue par des approches thérapeutiques ciblées sur l'axe Flt3-ligand/Flt3 médié par l'activation de p38 qui, en réduisant le processus inflammatoire, rétablirait un lien entre le " Seed " et le " Soil ".

La myélofibrose primitive (MFP) est un néoplasme myéloprolifératif chromosome Philadelphie négatif rare, mais de pronostic sévère. Elle se caractérise par une prolifération clonale et une mobilisation des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSH/PH) de la moelle osseuse vers la rate et le foie. Cette anomalie de l’hématopoïèse est associée à une pathologie du stroma (myélofibrose, ostéosclérose et néoangiogenèse). L’existence d’anomalies moléculaires de la CSH/PH telles que les mutations de Jak2, Mpl, TET2 ou CALR ne permet pas à elle seule d’expliquer la physiopathologie de la maladie. Les résultats obtenus dans le laboratoire suggèrent que le microenvironnement médullaire au sein des niches hématopoïétiques et en particulier les cellules stromales mésenchymateuses (CSM), participe vraisemblablement à cette dérégulation de l’hématopoïèse, favorisant le développement du clone pathologique. Cependant, aucune preuve tangible d’une altération des CSM médullaires n’a été jusqu’à présent apportée.Dans ce travail, nous avons isolé les CSM de la moelle de patients atteints de MFP et réalisé une caractérisation « complète » de ces cellules : prolifération, phénotype, soutien de l’hématopoïèse, sécrétome, transcriptome, miRNome et capacités de différenciation. Nos résultats ont permis de dégager un faisceau d’arguments en faveur d’une dérégulation de leur différenciation ostéoblastique (DOB). (i) Les cytokines BMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF et Il-6 sont significativement produites en plus grande quantité par ces cellules. (ii) L’étude du transcriptome a révélé une expression significativement différente d’un ensemble de gènes impliqués dans la DOB tels que RUNX2, DLX5, TWIST1 et NOGGIN. (iii) De nombreux micro-ARN, dont certains sont connus pour être impliqués dans la DOB comme miR-210 ou dans le nichage des cellules souches hématopoïétiques comme miR-34a, sont dérégulés à l’état basal et au cours de cette DOB. (iv) Enfin, l’étude de leurs capacités de différenciation ostéoblastique in vitro et in vivo chez la souris immunodéprimée est en faveur d’une augmentation de ces capacités. Nous avons étudié l’impact du TGF- β1 dans cette DOB. Nous avons mis en évidence que les CSM de malades présentent un état basal d'activation de la voie de signalisation pSmad significativement augmenté, confirmant l’expression endogène de TGF-β1. En utilisant des inhibiteurs spécifiques du récepteur de type I au TGF- β, nous avons montré l’implication de cette cytokine dans les altérations de la DOB. En conclusion, notre travail montre pour la première fois que les CSM des malades de MFP sont anormales et ce indépendamment de la stimulation par le clone hématopoïétique pathologique, suggérant la présence d'anomalies constitutives ou acquises. Ces anomalies impliquent deux acteurs majeurs de la pathologie : le TGF-β1 et l'ostéogenèse. / Primary myelofibrosis (PMF) is a Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm, rare but associated with a poor prognosis. Its features are a clonal proliferation and an egress of hematopoietic stem cells (HSC) from bone marrow to spleen. These abnormalities of hematopoiesis are in relation with a pathological stroma (myelofibrosis, osteosclerosis and neoangiogenesis). Molecular abnormalities present in HSC partially explain the physiopathology of the disease. Results from our lab suggest that the bone marrow micro-environnement, especially mesenchymal stromal cells (MSC), are involved in the deregulation of hematopoiesis, promoting the clonal cells. However, there is no strong evidence of bone marrow MSC alterations reported for now.In our study, we isolated MSC from bone marrow of patients suffering from PMF and performed a broad characterization: proliferation, phenotype, hematopoiesis supporting capacities, secretome, transcriptome and miRNome analysis. Our results highlight arguments in favor of a deregulation of their osteogenic capacities. (i) Cytokines NMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF and Il-6 were significantly overproduced by MSCs. (ii) Transcriptome analysis revealed a specific signature involving genes participating in osteogenic differentiation such as RUNX2, DLX5, TWIST1 and NOGGIN. (iii) Many micro-RNAs, some know to be involved in osteogenic differentiation regulation, as mir-34a, are deregulated in MSCs and in MSC-derived osteoblasts. (iv) Finally, study of their osteogenic potency in vitro and in vivo in nude mice showed an increasing of their osteogenic potency. We studied the impact of TGF-β1 in this process and showed that PMF MSCs showed a basal expression of Smad pathway significantly increased as compared to control. Using specific inhibitor of TGF-β1 receptor, we demonstrated the implication of this cytokine in the osteogenic impairment.To summarize, our work shows for the first time that MSCs from PMF patients are abnormal, independently from stimulation by clonal cells, suggesting intrinsic abnormalities. These abnormalities involve two main factor of the disease: TGF-β1 and osteogenesis.