In vivo, les cellules osseuses évoluent dans un microenvironnement complexe, tridimensionnel et interagissent avec celui-ci à de nombreuses échelles, depuis le nanomètre (tropocollagène) jusqu’à des structures de plusieurs centaines de micromètres (trabécules). Paradoxalement, la majeure partie de nos connaissances sur la physiologie cellulaire est issue d’expériences réalisées sur des cellules cultivées sur du plastique et en deux dimensions. Ces différences ne peuvent qu’avoir une influence sur le comportement des cellules, qui n’entretiennent plus les mêmes relations spatiales entre elles, ainsi qu’avec leur environnement. De plus, si ces dernières années, nombre d’études ont été réalisées sur l’influence de la topographie à des échelles nano et micrométriques, peu d’études ont montré le rôle de la géométrie du substrat à une échelle tissulaire, soit au sein de structures supérieures à 100 µm. Afin d’étudier l’influence de la macroarchitecture du substrat sur le comportement cellulaire, des céramiques en hydroxyapatite à architecture contrôlée ont été ensemencées avec des cellules primaires de calvaria de souris. Une première étude a été entreprise sur des substrats macroarchitecturés, présentant des sillons de différentes géométries : sillons semi-circulaires (Wave), sillons triangulaires à angle de 90° ou à angle de 45°. Plus la géométrie du substrat était refermée (45°>90°>Wave), plus la différenciation ostéoblastique était rapide. Cela s’est traduit par une augmentation des niveaux d’expression génique et protéique d’ostéocalcine et de sclérostine, indiquant la présence d’ostéocytes au sein de l’important tissu déposé par les cellules. De plus, au sein de la géométrie à l’angle le plus fermé (i.e. « 45° »), des structures fibreuses minéralisées, orientées parallèlement au fond du substrat ont été observées. Cette orientation s’est confirmée au niveau cellulaire, avec une orientation similaire des fibres de stress et un étirement des noyaux cellulaires. La géométrie du substrat influence donc le comportement des cellules en modifiant très probablement leur signalisation intracellulaire. Ces investigations ont été poursuivi par le développement d’un modèle d’ostéogénèse 3D sous perfusion au sein du bioréacteur BOSE ElectroForce® 5270 BioDynamic®de la plateforme Equipex IVTV, afin d’explorer les interactions cellulaires-substrat en réponse à des contraintes mécaniques (forces de cisaillement). Le dépôt tissulaire était particulièrement abondant au sein des pores triangulaires à angle de 45°, confirmant les données obtenues sur les substrats macroarchitecturés et laissant penser que ce type de pores est le plus à même de permettre une différenciation ostéoblastique optimale. Les résultats de ces travaux pourront permettre des avancées dans la compréhension de la biologie de l’os, mais également dans la conception d’implants innovants destinés à la réparation de défaux osseux, avec une ostéointégration stimulée via la présence de structures à géométrie fermée, tel que des sillons triangulaires à angles de 45°. / In vivo, cells reside in a complex and three-dimensional microenvironment, with which they interact at multiple scales, from the nanometer (tropocollagen) to structures of several hundred of micrometers (trabeculae). However, most of our knowledge on cell physiology has been obtained from cells grown in Petri dishes, on plastic and in two dimensions. In those conditions, the spatial relationships between cells and their environment can only be deeply modified. Moreover, if the impact of substrate closure at a cellular level is particularly well documented, very few studies have shown its role at a tissue level (i.e. greater than 100 µm), and thus focused mostly on the matrix deposition rather than on the osteoblastic differentiation. In order to study the effects of substrate macroarchitecture on cells, primary mouse calvarial cells were seeded on hydroxyapatite-based bioceramics, made from wax molds by 3D printing. A first study was conducted on macroarchitectured substrates. These bioceramics have three patterns of different degrees of closure: semi-circular grooves (Wave), triangular grooves with 90° angle and triangular grooves with 45° angle. The tighter was the substrate geometry (45°> 90°> Wave), the faster was osteoblastic differentiation. This resulted in increased levels of gene and protein expression of osteocalcin and sclerostin, indicating the presence of osteocytes inside the tissue layed by cells. Moreover, in the tightest geometry (i.e. 45°), mineralized fibrous structures, oriented parallel to the bottom substrate were observed. This orientation was confirmed at the cellular level, with a similar orientation of stress fibers and a stretch of cell nuclei. Thus, the substrate macroarchitecture influences the cellular behavior by, most likely, modifying the intracellular signaling. These investigations were pursued with the development of a 3D model of osteogenesis under perfusion, in the BOSE 5270 ElectroForce® BioDynamic® bioreactor of the IVTV Equipex platform, to explore cell-substrate interactions in response to mechanical stress (shear forces). Tissue deposition was particularly abundant in the triangular pores with 45° angles, confirming our previous observations and suggesting that this geometry was able to promote osteoblast differentiation.Our results could lead to breakthroughs in the understanding of the bone biology but also in the design of innovative implants for the repair of bone defects, with a stimulated osseointegration throught the presence of structures with closed geometries, such as triangular grooves with 45° angles.

Le développement d’un biomatériau contrôlant précisément le comportement de cellules souches serait un avantage considérable pour des applications de médecine régénératrice et d’ingénierie tissulaire. Actuellement, le vieillissement de la population mondiale est associé à de nombreux problèmes de dégénérescence des tissus, en particulier dans le contexte osseux. Le coût annuel des opérations chirurgicales orthopédiques pratiquées aux États-Unis s’élève à 8.2 milliards de dollars US. Afin de trouver des alternatives aux greffes traditionnelles, des biomatériaux mimant la physiologie osseuse ont été conçus. Une des stratégies consiste à préparer des matériaux biomimétiques en fonctionnalisant, par exemple, la surface des matériaux par des peptides dérivés des protéines d’adhésion de la matrice extracellulaire (ECM) tel que la fibronectine pour favoriser l’ancrage des cellules osseuses. D’autres molécules comme les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) jouent un rôle essentiel dans le processus physiologique de la réparation osseuse. Ces BMPs peuvent être combinées aux biomatériaux afin d’orienter la réponse des cellules osseuses et ainsi améliorer la régénération des tissus. L’utilisation de peptides dérivés des BMPs, 300 fois moins dispendieux, ajoute un avantage considérable dans le développement des matériaux biomimétiques. En outre, des relations croisées entre les récepteurs cellulaires des protéines de l’ECM et ceux des BMPs peuvent influencer la signalisation et la différenciation des cellules osseuses, d’où l’intérêt de fonctionnaliser les biomatériaux non seulement avec des molécules d’adhésion, mais aussi avec des BMPs ou leurs peptides dérivés. Dans ce projet, un biomatériau biomimétique de 3eme génération a été développé afin de permettre l’adhésion et l’orientation des cellules souches vers la lignée ostéoblastique. L’étude a consisté à analyser le potentiel de la co-immobilisation d’un peptide d’adhésion dérivé de la fibronectine (pFibro) et d’un peptide dérivé de la BMP-9 (SpBMP-9) sur un film de polycaprolactone (PCL). L’utilisation d’un peptide négatif du SpBMP-9, le NSpBMP-9, a permis de vérifier les effets synergiques potentiels de cette co-immobilisation. Dans un premier temps, l’attachement et l’organisation du cytosquelette des cellules ont été déterminés par un immunomarquage des protéines du cytosquelette. Puis la cinétique d’activation de la voie de signalisation Smad impliquée dans la différenciation ostéoblastique a été analysée par immunobuvardage de type Western. Afin de vérifier la différenciation des cellules souches vers un phénotype défini, l’expression de gènes codant pour des marqueurs de différenciation ostéogénique (Runx2, Ostérix), chondrogénique (Sox9) et adipogénique (PPARγ) a également été évaluée par des immunobuvardages de type Western. Ce projet de recherche a amélioré les connaissances actuelles sur les interactions entre les biomatériaux co-fonctionnalisés par des peptides d’adhésion et dérivés de la BMP-9 et les cellules osseuses, afin de potentialiser les propriétés ontéoconductive, ostéointégrative et ostéoinductive essentielles pour obtenir un matériau biomimétique efficace.

La myélofibrose primitive (MFP) est un néoplasme myéloprolifératif chromosome Philadelphie négatif rare, mais de pronostic sévère. Elle se caractérise par une prolifération clonale et une mobilisation des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSH/PH) de la moelle osseuse vers la rate et le foie. Cette anomalie de l’hématopoïèse est associée à une pathologie du stroma (myélofibrose, ostéosclérose et néoangiogenèse). L’existence d’anomalies moléculaires de la CSH/PH telles que les mutations de Jak2, Mpl, TET2 ou CALR ne permet pas à elle seule d’expliquer la physiopathologie de la maladie. Les résultats obtenus dans le laboratoire suggèrent que le microenvironnement médullaire au sein des niches hématopoïétiques et en particulier les cellules stromales mésenchymateuses (CSM), participe vraisemblablement à cette dérégulation de l’hématopoïèse, favorisant le développement du clone pathologique. Cependant, aucune preuve tangible d’une altération des CSM médullaires n’a été jusqu’à présent apportée.Dans ce travail, nous avons isolé les CSM de la moelle de patients atteints de MFP et réalisé une caractérisation « complète » de ces cellules : prolifération, phénotype, soutien de l’hématopoïèse, sécrétome, transcriptome, miRNome et capacités de différenciation. Nos résultats ont permis de dégager un faisceau d’arguments en faveur d’une dérégulation de leur différenciation ostéoblastique (DOB). (i) Les cytokines BMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF et Il-6 sont significativement produites en plus grande quantité par ces cellules. (ii) L’étude du transcriptome a révélé une expression significativement différente d’un ensemble de gènes impliqués dans la DOB tels que RUNX2, DLX5, TWIST1 et NOGGIN. (iii) De nombreux micro-ARN, dont certains sont connus pour être impliqués dans la DOB comme miR-210 ou dans le nichage des cellules souches hématopoïétiques comme miR-34a, sont dérégulés à l’état basal et au cours de cette DOB. (iv) Enfin, l’étude de leurs capacités de différenciation ostéoblastique in vitro et in vivo chez la souris immunodéprimée est en faveur d’une augmentation de ces capacités. Nous avons étudié l’impact du TGF- β1 dans cette DOB. Nous avons mis en évidence que les CSM de malades présentent un état basal d'activation de la voie de signalisation pSmad significativement augmenté, confirmant l’expression endogène de TGF-β1. En utilisant des inhibiteurs spécifiques du récepteur de type I au TGF- β, nous avons montré l’implication de cette cytokine dans les altérations de la DOB. En conclusion, notre travail montre pour la première fois que les CSM des malades de MFP sont anormales et ce indépendamment de la stimulation par le clone hématopoïétique pathologique, suggérant la présence d'anomalies constitutives ou acquises. Ces anomalies impliquent deux acteurs majeurs de la pathologie : le TGF-β1 et l'ostéogenèse. / Primary myelofibrosis (PMF) is a Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm, rare but associated with a poor prognosis. Its features are a clonal proliferation and an egress of hematopoietic stem cells (HSC) from bone marrow to spleen. These abnormalities of hematopoiesis are in relation with a pathological stroma (myelofibrosis, osteosclerosis and neoangiogenesis). Molecular abnormalities present in HSC partially explain the physiopathology of the disease. Results from our lab suggest that the bone marrow micro-environnement, especially mesenchymal stromal cells (MSC), are involved in the deregulation of hematopoiesis, promoting the clonal cells. However, there is no strong evidence of bone marrow MSC alterations reported for now.In our study, we isolated MSC from bone marrow of patients suffering from PMF and performed a broad characterization: proliferation, phenotype, hematopoiesis supporting capacities, secretome, transcriptome and miRNome analysis. Our results highlight arguments in favor of a deregulation of their osteogenic capacities. (i) Cytokines NMP2, RANTES, PDGF, TGF-β1, VEGF and Il-6 were significantly overproduced by MSCs. (ii) Transcriptome analysis revealed a specific signature involving genes participating in osteogenic differentiation such as RUNX2, DLX5, TWIST1 and NOGGIN. (iii) Many micro-RNAs, some know to be involved in osteogenic differentiation regulation, as mir-34a, are deregulated in MSCs and in MSC-derived osteoblasts. (iv) Finally, study of their osteogenic potency in vitro and in vivo in nude mice showed an increasing of their osteogenic potency. We studied the impact of TGF-β1 in this process and showed that PMF MSCs showed a basal expression of Smad pathway significantly increased as compared to control. Using specific inhibitor of TGF-β1 receptor, we demonstrated the implication of this cytokine in the osteogenic impairment.To summarize, our work shows for the first time that MSCs from PMF patients are abnormal, independently from stimulation by clonal cells, suggesting intrinsic abnormalities. These abnormalities involve two main factor of the disease: TGF-β1 and osteogenesis.

Les patients infectés par le VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine) traités par les antirétroviraux (ARV) ont aujourd'hui une espérance de vie quasi normale. Cependant, ils présentent une augmentation de la prévalence de pathologies classiquement associées au vieillissement, dont l'ostéoporose, suggérant un vieillissement prématuré ou accentué. Les facteurs impliqués sont, entre autres, l'infection par le VIH, les ARV et un état d'inflammation chronique. L'ostéoporose correspond à une déminéralisation, suite à un déséquilibre entre formation (ostéoblastes) et résorption osseuse (ostéoclastes). L'infection par le VIH et les ARV, en particulier les inhibiteurs de protéase (PI), augmentent la prévalence de l'ostéoporose. Dans ce contexte, je me suis intéressée à l'effet de certaines protéines du VIH et PI sur les précurseurs ostéoblastiques, les cellules souches mésenchymateuses (MSC). Nous montrons que deux protéines du VIH, Tat et Nef, induisent une sénescence prématurée des MSC, associée à un stress oxydant et in fine à un défaut de différenciation en ostéoblastes. Les effets de Tat sont médiés par le facteur pro-inflammatoire et pro-sénescent NF-?B, et ceux de Nef sont liés à une inhibition de l'autophagie. Nous montrons également que les PI atazanavir et lopinavir associés au ritonavir induisent une sénescence et un stress oxydant du fait de l'accumulation de prélamine A farnésylée toxique conduisant à un déficit de la différentiation ostéoblastique. Ces travaux montrent que le VIH et certains PI peuvent jouer un rôle délétère sur les MSC, et mettent en lumière certains des mécanismes impliqués dans le vieillissement des patients infectés par le VIH et traités. / The efficacy of highly active antiretroviral treatment (ARV) has resulted in a considerable improvement in the life expectancy of HIV (Human Immunodeficiency Virus)-infected patients. However, many patients encounter the early occurrence of several common age-related comorbidities, such as osteoporosis, stressing for a premature or accentuated aging process. Proposed pathogenic mechanisms include HIV infection, ARV treatment and chronic inflammation. Osteoporosis is defined by a decrease in bone mineral density, resulting from the alteration of the balance between bone formation (osteoblasts) and resorption (osteoclasts). HIV infection, through the bystander effect of HIV secreted proteins, and ARV, particularly protease inhibitors (PI) increase the prevalence of osteoporosis.Our studies focused on the capacity of some HIV proteins, and of some PI to alter osteoblast precursors, namely mesenchymal stem cells (MSC). We showed that two HIV proteins, Tat and Nef, induced premature senescence of MSC, associated with an oxidative stress and a decreased osteoblastic differentiation potential. Tat triggered senescence via NF-κB activation, whereas the effect of Nef was linked to the inhibition of autophagy. We also showed that the PI, atazanavir and lopinavir boosted with ritonavir, induced senescence and oxidative stress through the accumulation of toxic farnesylated prelamin A, thus leading to a decreased osteoblastic differentiation.Overall, these data show that some HIV proteins and some PI can exert deleterious effects on MSC, resulting in senescence, and highlight several mechanisms which could be involved in the aging process of ART-controlled HIV infected patients.

La cicatrisation de défauts osseux permet tout au plus une réparation de l'os et dans peu de cas, une régénération ad integrum. Le développement de biomatériaux issus de l'ingénierie tissulaire en vue d'une régénération osseuse est donc un enjeu majeur. Le but de cette étude a été d'évaluer si des peptides GXXPG issus de l'élastine sont capables de favoriser la différenciation ostéoblastique de cellules mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine (CMMO) ainsi que la formation de la matrice osseuse et sa minéralisation. Pour y répondre, nous avons utilisés les lattis de collagène de type I (COL1). La contraction de lattis « flottants » (LF) stimule l'expression de marqueurs de l'ostéoblaste (Runx-2, BSP…) par les CMMO ainsi que la minéralisation de la matrice osseuse. Cette différenciation ostéoblastique est aussi associée à l'activation de la cascade MT1-MMP/MMP-2/MMP-13. Nous montrons ensuite que les peptides GXXPG stimulent de façon dose-dépendante l'expression de marqueurs ostéoblastiques comme Runx-2 via S-Gal. Sur « coating » de COL1, ils stimulent la différenciation ostéoblastique des CMMO, la formation de la matrice osseuse et sa minéralisation. Enfin, dans des conditions « inflammatoires » créées par l'ajout de plasminogène (Plg) exogène, ces peptides conservent une activité ostéogénique sous contraintes mécaniques ou non. Plg seul induit également la différenciation ostéoblastique. Bien que les peptides GXXPG stimulent la production d'enzymes à activité collagénolytique (MT1-MMP, MMP-1), la lyse des LF n'est pas significative. En conclusion, les peptides GXXPG apparaissent comme des biomolécules pharmacologiques prometteuses pour la régénération osseuse. / Bone healing leads in only a few cases to an ad integrum regeneration, but most often to an incomplete tissue repair. Thus, the development of new biomaterials from tissue engineering in order to promote bone regeneration is a major goal. The purpose of our study was to evaluate if GXXPG peptides, derived from elastin, are able to favor human bone marrow mesenchymal cells (HBMC) to mature osteoblasts and bone matrix formation and mineralization.To this end, we used type I collagen (COL1) lattices. Floating lattice (LF) contraction stimulates osteoblasts markers expression (Runx-2, BSP…) by HMBC and bone matrix mineralization. Osteoblast differentiation is also associated to MT1-MMP/MMP-2/MMP-13 proteolytic cascade activation. We then showed that GXXPG peptides stimulate osteoblast markers like Runx-2 in a dose-dependent manner, an effect which involves S-Gal receptor. On a type I collagen coating model, these peptides also promote CMMO differentiation into osteoblast, bone matrix formation and mineralization. Finally, under “inflammatory” conditions, which can be catalyzed by plasminogen (Plg) supplementation, these peptides keep their ability to induce osteogenic responses in HBMC, even under mechanical stress. Plg alone is also able to promote osteoblast differentiation. Although GXXPG peptides stimulate collagenolytic enzymes (MT1-MMP, MMP-1) production, collagen degradation in LF is not significant. To conclude, GXXPG peptides appear as promising pharmacological biomolecules in bone regeneration.

Dans le cas de larges pertes de substance osseuse, l’ingénierie tissulaire représente une alternative intéressante aux greffes. Cette technique consiste à associer des cellules à des biomatériaux dans le but de réparer le tissu. L'objectif de ce travail est l'étude de l'amélioration du potentiel ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses issues du tissue adipeux humain (ASC), afin d’augmenter la formation de matrice osseuse en territoire ischémique. Nous avons montré que le fucoïdane, un polysaccharide d’origine marine, était capable d’améliorer la différenciation ostéogénique des ASC in vitro. Cependant, la combinaison de ces cellules avec des biomatériaux (granules de biphosphate de calcium) ne suffit pas à permettre une formation osseuse dans un modèle de pousse osseuse en site ectopique chez la souris. Afin d’augmenter l’angiogenèse, essentielle dans la réparation osseuse, nous avons associé les ASC à des cellules progénitrices endothéliales (appelées ECFC), dans ce modèle. Cette association ne permet d’améliorer que faiblement la formation osseuse. Nos études in vitro d'association de CPE et d'ASC ont montré que ces cellules en coculture étaient capables de synthétiser un grand nombre de cytokines impliquées dans les différenciations ostéogénique et angiogénique, telles que le transforming growth factor (TGFß1), l’insulin like growth factor (IGF-1) ou encore le vascular endothelial growth factor (VEGF). Dans nos conditions de culture, le surnageant de l’association des ECFC avec des ASC induit, par rapport au surnageant des ASCs seules, une inhibition de la différenciation ostéogénique dont le mécanisme reste à identifier.L’ensemble de nos données démontre le potentiel du fucoïdane dans l’ingénierie tissulaire osseuse et que les ASC seules ne sont pas capables de former de matrice osseuse. / In the case of large bone defects, tissue engineering represents an attractive alternative to transplantation. Tissue engineering is a combination of cells with biomaterials in order to repair tissue. The aim of this work was the study of the improvement of the osteogenic potential of mesenchymal stromal/stem cells derived from human adipose tissue (ASC) in the order to increase the formation of bone matrix in the ischemic territory. We have shown that fucoidan, a marine polysaccharide, was able to improve the osteogenic differentiation of ASC in vitro. However, the combination of these cells with biomaterials (biphasic calcium phosphate particles) is not enough to have bone formation in an ectopic bone growth model in mice. To promote angiogenesis, a crucial step in bone repair, we associated ASC with endothelial progenitor cells (called ECFC), in our model. This association promotes only lightly the bone formation. Our in vitro coculture studies of ECFC with ASC showed that the cells in coculture were able to synthesize several cytokines involved in angiogenic and osteogenic differentiation, such as transforming growth factor (TGF-ß1), insulin like growth factor (IGF-1) or vascular endothelial growth factor (VEGF). However, ASC in coculture did not express the receptors of these cytokines. In our culture conditions, the supernatant of the association of ECFC + ASC induces, compare to ASC alone, an inhibition of osteogenic differentiation which mechanism has to be identified.Our data show the potential of fucoidan in bone tissue engineering and that ASC alone did not promote bone matrix formation.

L’ingénierie du tissu osseux vise à concevoir un substitut tissulaire associant des cellules ostéoprogénitrices à une matrice tridimensionnelle capable de promouvoir la reconstruction osseuse, ouvrant la voie au développement de thérapeutiques substitutives à la pratique de la greffe dont les limitations sont bien connues.Le but de ce travail a été de développer un nouveau produit d’ingénierie tissulaire (PIT) destiné à la régénération osseuse constitué i) d’une matrice tridimensionnelle poreuse constituée de polysaccharides naturels biodégradables, ii) de cellules souches adultes issues du tissu adipeux humain (ADSCs) et d’identifier les conditions de culture optimales permettant le développement d’un produit fonctionnel pour une utilisation clinique. Nos résultats montrent que l’architecture et la composition de la matrice macroporeuse polysaccharidique permet de guider la différenciation ostéoblastique des ADSCs, en l’absence de facteurs ostéogéniques, et notamment en conditions de culture dynamique, grâce à l’organisation cellulaire en agrégats promouvant les interactions cellulaires. Les ADSCs peuvent être marquées à l’aide de nanoparticules superparamagnétiques et suivies in vivo de façon non invasive par imagerie par résonnance magnétique (IRM) au sein des matrices après leur implantation en site sous-cutané chez la souris. Les images IRM montrent que le matériau permet de délivrer une partie des cellules au niveau du site d’implantation participant probablement à un processus de réparation tissulaire. Enfin, en vue d’applications cliniques, un milieu de culture sans sérum répondant aux conditions GMP (Good Manufacturing Practices) pour la différenciation ostéoblastique a été développé par un industriel et validé au cours de ce travail de thèse.En conclusion de ces travaux, l’association d’une matrice macroporeuse composée de polysaccharides avec des ADSCs dans des conditions de culture spécifiques, en conditions dynamiques, semble pertinente et prometteuse pour des applications cliniques en ingénierie du tissu osseux. / Bone tissue engineering may associate osteoprogenitor cells to a tridimensional scaffold that can promote tissue reconstruction in order to replace bone grafting strategies whose limitations are well known. This study aims to develop a new tissue-engineered construct for bone regeneration constituted by i) a tridimensional polysaccharide-based scaffold, ii) adult stem cells extracted from human adipose tissue and identify the best culture conditions needed to develop a functional construct for clinical use. Our results show that this macroporous scaffold offers, without any osteoinductive factors, a suitable architecture and composition for driving osteoblastic differentiation of ADSCs especially when placing the tissue-engineered construct in dynamic conditions, thanks to cell aggregate conformation promoting cell-to-cell interactions. Thanks to ADSCs labeling, the tissue-engineered construct can be tracked in vivo in a non invasive way by magnetic resonance imaging (MRI), after their subcutaneous implantation. Results evidenced that this scaffold behaves as a cell carrier for of holding in its own cell fraction and delivering another fraction to the site of implantation for inducing a better tissue regeneration process. Finally, a serum free medium meeting standards GMPs (Good Manufacturing Practices) has been developed for inducing ADSCs osteoblastic differentiation as a first step towards clinical application.In conclusion, this polysaccharide-based scaffold associated with ADSCs, cultured under low fluid flow in a new bioreactor device, could be a relevant and promising tissue engineered construct for bone tissue engineering applications.