Au cours des deux dernières décennies, la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a été une maladie épidémique croissante, non seulement dans les pays occidentaux mais également dans le monde entier en raison de l’augmentation continue des modes de vie sédentaires, de l’obésité, et de la résistance à l’insuline. La prévalence mondiale de la NALFD est actuellement estimée à 25% dans la population générale adulte. NALFD est composé d’un éventail d’affections hépatiques s’étendant du foie gras non-alcoolique (NAFL), stéatohépatite non-alcoolique (NASH), fibrose avancée et cirrhose qui peut progresser au carcinome hépatocellulaire (HCC). L’inflammation induite par NASH peut moduler l’activation des cellules stellaires hépatiques (CSH) et donc influencer la progression de la fibrose hépatique. Le rôle de l’inflammation de type 3, qui est caractérisée par la production des cytokines IL-17A et IL-22, dans la fibrose de type NAFLD demeure incompris. Dans cette thèse, nous avons évalué le rôle d’IL-22 et d’IL-17A dans la fibrose liée à la NAFLD. Des biopsies cliniques de foie NAFLD humain et un modèle murin in vivo de NAFLD ont été utilisés et des expériences in vitro ont été effectuées. Nous avons démontré que l’expression hépatique d’IL-22 est plus élevée chez les femmes et chez les femelles avec NAFLD versus les hommes et les mâles. Nous avons identifié les neutrophiles et les cellules T, y compris les cellules T Th17, Th22 et γδ, en tant que principaux producteurs d’IL-22 chez les sujets féminins et les souris atteintes de NAFLD. De plus, nous avons démontré que l’absence de la signalisation endogène du récepteur IL-22 (modèle IL-22RA1 knockout) chez les souris femelles avec NAFLD, aggravait les lésions hépatiques, l’inflammation et la fibrose, comparé aux mâles. Cet effet hépatoprotecteur dépend des mécanismes anti-apoptotiques médiés par la signalisation du récepteur IL-22 qui favorisent la survie des hépatocytes et réduisent au minimum les dommages au foie. Nous avons également montré que l’expression hépatique d’IL-22BP est régulé à la hausse chez les souris femelles avec NAFLD comparé aux mâles. Dans ces femelles, le ratio d’ARN messager hépatique de l’IL-22 envers celui de l’IL-22BP est corrélé positivement avec les gènes en aval de cible d’IL-22 (gènes anti-apoptotiques et antioxydants). Par ailleurs, nous avons prouvé que les neutrophiles intrahépatiques produisent l’IL-17A in situ dans notre modèle NAFLD et ceci correspondait fortement avec la progression de la fibrose de foie et les dommages hépatiques. Nous avons fourni des preuves préliminaires que l’IL-17A peut induire des pièges extracellulaires de neutrophiles (NET) in vitro, et la signature de NETs est impliquée dans la progression de la fibrose hépatique dans notre NAFLD. Pris ensemble, Ces résultats démontrent qu’identifié un nouveau rôle de l’inflammation de type 3 dans la fibrose liée au NAFLD, où l’action de l’IL-22 est dépendante du sexe et possède des 4 fonctions hépatoprotectrices contre la fibrose du foie chez les femelles, alors que l’IL-17A agit en tant que cytokine profibrogénique et favorise la fibrose de foie. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing epidemic, not only in western countries but also worldwide due to the continuous rise in sedentary lifestyles, obesity, and insulin resistance over the last two decades. The global prevalence of NALFD is currently estimated to be 25% in the general adult population. NAFLD is comprised of a spectrum of liver disease ranging from non-alcoholic fatty liver (NAFL), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), advanced fibrosis, and finally cirrhosis that can progress to hepatocellular carcinoma (HCC). NASH-induced inflammation can modulate hepatic stellate cells (HSCs) activation and hence influence hepatic fibrosis progression. The role of type 3 inflammation, which is characterized by the production of the cytokines IL-17A and IL-22, in NAFLD-related fibrosis remain not clear. In this thesis, we evaluated the role of IL-22 and IL-17A in NAFLD-related fibrosis using clinical liver biopsies from a NAFLD human cohort, an in vivo NAFLD mouse model and in vitro experiments. We report that hepatic IL-22 expression had sexually dimorphic differences in both humans and mice with NAFLD where it was elevated in females versus males. We identified intrahepatic neutrophils in female subjects with NAFLD as well as T cells, including Th17, Th22, γδ T cells, in female mice with NAFLD as major producers of IL-22. In addition, we demonstrated that lack of endogenous IL-22 receptor signaling (IL-22RA1 knockout model), exacerbated liver injury, inflammation, and fibrosis in female but not male mice with NAFLD. This hepatoprotective effect was dependent on IL-22 receptor signaling-induced anti-apoptotic signals that promote hepatocyte survival and minimize liver damage. We also demonstrated that hepatic IL-22BP expression was upregulated in female mice with NAFLD compared to males, and the hepatic IL22/IL-22BP mRNA ratio positively correlated with IL-22 downstream target genes (anti-apoptotic and antioxidant genes) in those females. Moreover, we showed that intrahepatic neutrophils produce IL-17A in situ in our NAFLD model and this was strongly correlated with progression of liver fibrosis and liver injury. We provided preliminary evidence that IL-17A can induce neutrophil extracellular traps (NETs) in vitro, and that NETs are implicated in liver fibrosis progression in our NAFLD model. Taken together, we identified a novel role for type 3 inflammation in NAFLD-related fibrosis, where IL-22 act in sex-dependent manner and provided hepatoprotective functions against liver fibrosis in females, while IL-17A act as profibrogenic cytokine and promotes liver fibrosis through enhancing NETs.

L'inhibiteur de l'apoptose lié au chromosome X (XIAP) est une protéine antiapoptotique exprimée de manière ubiquitaire et est un puissant inhibiteur de l'apoptose en bloquant les formes actives des caspases-3, -7 et -9. D’autres fonctions de XIAP reposent sur son activité d'ubiquitine ligase impliquée dans la régulation d'importantes voies de signalisation et la transduction du signal des récepteurs de type NOD ; NOD1 et NOD2, jouant un rôle central dans l'immunité innée. Les mutations hémizygotes résultant en une perte de fonction du gène XIAP sont responsables de la survenue d’une maladie auto-inflammatoire dont le phénotype clinique englobe plusieurs de ces caractéristiques : une lymphohistiocytose hémophagocytaire (HLH), un syndrome d’activation macrophagique (MAS), une maladie inflammatoire de l'intestin mimant la maladie de Crohn. Bien que certaines études antérieures montrent que la suppression de XIAP induit l'activation de l'inflammasome NLRP3, les mécanismes physiopathologiques par lesquels ce déficit induit un syndrome autoinflammatoire ne sont pas définis. Ce projet vise à créer et caractériser une lignée cellulaire monocyte/macrophage THP-1 avec délétion de XIAP pour étudier les mécanismes moléculaires responsable de l'auto-inflammation dans les macrophages en utilisant le système CRISPR-Cas12. J'ai pu montrer que le déficit en XIAP est responsable de l’activation de l'inflammasome NLRP3 et d’un état auto-inflammatoire macrophagique indépendant de l'activité ubiquitine ligase de XIAP. Il m’a aussi été possible d'élucider la rétroaction positive de l’IL-1𝛽 et NF-κB sur l'inflammation. L'étude de ce modèle cellulaire nous permettra une meilleure compréhension des processus régulant l’activation de l'inflammasome et l’apoptose dans les macrophages déficients en XIAP. / The X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein is an anti-apoptotic protein. It is ubiquitously expressed and is a potent inhibitor of programmed apoptosis by blocking the activated forms of caspases-3, -7, and -9. Additional functions of XIAP rely on its ubiquitin ligase activity involved in regulating important signaling pathways. Among other important functions is the role of XIAP in the signal transduction of the NOD-like receptors; NOD1 and NOD2, which play a pivotal role in innate immunity. Hemizygous loss of function mutations in XIAP leads to XIAP deficiency. It can be considered as an autoinflammatory disease since the clinical phenotype encompasses several auto-inflammatory features: Haemophagocytic Lymphohistiocytic syndrome (HLH), macrophage activation syndrom (MAS), an inflammatory bowel disease, mimicking Crohn's disease. Interestingly, while some earlier reports have shown that deletion of XIAP induces NLRP3 inflammasome activation, the precise mechanisms by which XIAP deficiency induces an autoinflammatory syndrome are not defined. This project aims to create and characterize a THP1 monocyte / macrophage cell line with a deletion of XIAP to show the state of hyperinflammation in macrophages using the CRISPR-Cas12 system to study the role of different domains of the gene. I have shown that XIAP deficiency triggers the NLRP3 inflammasome in THP-1 macrophages independently of its ubiquitin ligase activity. In addition, it was possible to elucidate the role of the IL-1𝛽 and NF-κB backloop on inflammation. Studying this cell model will help us refine a better understanding of the dynamics of inflammasome and apoptosis in macrophages with XIAP deficiency.

Le syndrome périodique lié à NLRP12 (NLRP12-AD) est une maladie rare appartenant au groupe des maladies auto-inflammatoires systémiques héréditaires. Ces maladies sont causées par des anomalies du système immunitaire inné. Les cryopyrinopathies (CAPS) sont une famille de maladie auto-inflammatoire liées à des mutations gain de fonction du gène NLRP3. NLRP3 fait partie d’un composant central de l’inflammation, l’inflammasome. En 2007, Jéru et al. ont décrit un premier patient présentant des symptômes évocateurs d’un CAPS qui n’était pas porteur de mutation de NLRP3 mais présentait une mutation de NLRP12. Depuis, 33 patients pédiatriques atteints de NLRP12-AD ont été décrits dans la littérature. Les signes cliniques de la maladie sont variables et ne permettent pas d’établir de critères cliniques diagnostics fiables. La pathogénicité des mutations observées chez les patients est difficile à établir. Les patients atteints de NLRP12-AD représentent également un défi thérapeutique, un certain nombre d’entre eux ne répondant pas aux anti-IL1, un traitement pourtant efficace dans la plupart des inflammasomopathies. De nombreuses études se sont intéressées au rôle de NLPR12, qui posséderait à la fois des propriétés pro et anti-inflammatoires par sa capacité à inhiber les voies canoniques et non canoniques de NFkb mais aussi à former un inflammasome. Le rôle exact de NLRP12 reste controversé, avec des résultats différents selon les cellules ou les stimuli utilisés lors des expériences. L’objectif de notre étude est de créer un modèle in vitro fiable et reproductible afin de mieux comprendre la physiopathologie de NLRP12. Il permettra ensuite d’étudier les mutations de NLRP12 retrouvées chez des patients présentant des symptômes de maladie auto-inflammatoire pour améliorer les performances et la fiabilité du diagnostic et proposer des traitements personnalisés aux patients concernés. Nous avons créé un modèle de cellules THP1 NLRP12 KO en utilisant la technologie de CRISPR/Cas9 qui a permis d’induire une délétion homozygote à la jonction entre le 2ème intron et le 3ème exon de NLRP12, qui code pour le domaine fonctionnel de la protéine. Nos cellules KO semblent sécréter moins de cytokine pro-inflammatoire (IL-1β et TNFα) que les cellules WT, suggérant un rôle pro-inflammatoire de NLRP12 dans notre modèle. Nous avons par ailleurs décrit une cohorte nord-américaine de 17 patients porteurs de mutations de NLRP12 afin d’étudier leurs mutations et produit des vecteurs lentiviraux contenant ces mutations. Nous prévoyons d’explorer le rôle de NLRP12 sur l’activation de la voie NFkB et la formation d’un inflammasome puis de transduire nos cellules KO avec les différentes mutations de nos patients et d’analyser leurs conséquences sur ces mêmes voies et sur la sécrétion cytokinique. / NLRP12-AD is part of a new group of rheumatics’ diseases: the systemic autoinflammatory diseases. Those diseases are caused by defect or dysfunction in the innate immune system. Cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS) is a family of systemic autoinflammatory disease initially linked to NLRP3 gain-of-function heterozygous mutations. NLRP3 is part of a key component of inflammation, the inflammasome. In 2007, Jeru et al. described the first patient with CAPS phenotype, but without NLRP3 mutations. This patient had NLRP12 mutations. Since then, 33 pediatric patients with NLRP12-AD have been published. There is no specific clinical presentation that allow homogenous diagnosis. Determination of the causality of the mutations remains tricky. Lastly, some patients have shown resistance to anti-IL1 treatment, a medication that is highly effective in other inflammasomopathies such as CAPS, a puzzling observation as to the role of NLRP12. NLRP12 has been described with both anti- and pro- inflammatory roles, by its ability to inhibit the canonical and non-canonical NFkB pathways, but also through its hypothetic capacity to form an inflammasome. Hence, the exact role of NLRP12 remains controversial and its role might be stimuli- or cell-dependant. Our objective is to create a reliable and reproductible in vitro model to better understand the role of NLRP12. This model will then allow us to study NLRP12 mutations found in patients with auto-inflammatory symptoms. This will improve our diagnostic performance and help to offer to patients the most suitable therapy. We created NLRP12 knockout THP-1 cells by using the CRPISP-Cas 9 gene editing technology. We were able to induce a homozygous deletion at the intron 2/exon 3 junction that encodes the protein functional domain. Our KO cells seems to secrete less pro-inflammatory cytokines (IL-1β and TNFα) than WT cells. This suggests a pro-inflammatory role of NLRP12. We described a North American cohort of 17 pediatric patients with NLRP12 mutations to study their mutations in our model and produced lentiviral vectors containing those mutations. We planned to study the effects of NLRP12 on NFkB activation and on inflammasome formation. Then, we will transduce our KO cells with the patient’s mutations and compare their consequences on inflammation pathways and cytokine secretion.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Des souris transgéniques ont été créées chez lesquelles l'expression de l'oncostatin M (OM), une cytokine de la famille de l'interleukin-6 (IL-6), est restreinte aux lymphocytes T immatures par l'emploi du promoteur proximal de la tyrosine kinase p561ck Ces souris, nommées LckOM, dévoilent des particularités fascinantes du système . immunitaire que nos connaissances actuelles ne permettent pas de bien définir. organes lymphoïdes des souris LckOM sont étrangement affectés par la surexpression d'OM, de telle sorte que le thymus perd sa capacité de générer des nouveaux lymphocytes T, et les ganglions acquièrent cette fonction thymique et se mettent à produire un quantité phénoménale de lymphocytes T. Les mécanismes qui contrôlent cette voie de différentiation donnent naissance à des populations polyclonales de lymphocytes T matures CD4 + et CD8+ indépendamment de la fonction thymique. Une littérature abondante démontre l'existence de populations lymphocytaires extrathymiques dans le foie, les intestins et la moelle. En revanche, très peu d'études observent directement une thymopoïèse extrathmique de telle envergure dans les ganglions La présente étude a pour but de déterminer les caractéristiques des lymphocytes T issus de la différentiation extrathymique modulée par l 'OM. Les travaux menés au cours de ce projet de maîtrise visaient à caractériser phénotypiquement, par cytométrie en flux, ces lymphocytes extrathymiques et à établir la topographie et la cinétique de leur développement ainsi qu'à examiner leur comportement migratoire. Le modèle choisi pour l'étude de ces lymphocytes T d'origine extrathymique est un modèle de chimère hématopoïétique thymectomisée et reconstituée à l'aide d'une source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) provenant de moelle osseuse transgénique (LckOM) et de foie foetal nom1al (C57BL/6). Ce modèle permet d'étudier spécifiquement le développement extrathymique de lymphocytes T normaux dans un environnement dépourvu d'influences thymiques. La prolifération et la demi-vie des lymphocytes extrathymiques sont établies grâce au marqueur de division cellulaire bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) qui est incorporé dans l'ADN lors de sa synthèse, tandis que leur migration est suivie à l'aide de la molécule fluorescente carboxy-fluorescein diacete succinimidyl ester (CFSE). Les résultats de ces travaux illustrent l'étonnant pouvoir de modulation qu'exerce l'OM sur le développement et l'homéostasie du système immunitaire. Ils démontrent premièrement que les lymphocytes T extrathymiques possèdent un répertoire Vp polyclonal et un phénotype indiquant qu'ils ont vécu une expérience antigénique antérieure. Deuxièmement, ils démontrent que le niveau de prolifération de ces lymphocytes extrathymiques est supérieur à celui des lymphocytes normaux. Troisièmement, ils démontrent que les lymphocytes T matures LckOM sont fortement attirés vers les ganglions. Ces travaux laissent sous-entendre que l'OM a des effets pléiotropiques qui engendrent des changements morphologiques et fonctionnels dans les organes lymphoïdes et des changements dans le comportement de circulation et de proliferation des lymphocytes. Ce phénomène hors du commun de thymopoïèse extrathymique est digne d'intérêt puisqu'il fait surgir des faits importants à propos de l'organisation globale et de l'homéostasie du système immunitaire qui suscite actuellement beaucoup d'intérêt dans la communauté scientifique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'infection des cellules dendritiques (CDs) thymiques pourraient jouer un rôle dans la pathogénèse associée au virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Il a déjà été démontré que les cellules dendritiques du thymus peuvent être infectées in vitro par le VIH-1 et que cette infection cause le relargage d'un ou de plusieurs facteurs cytotoxiques dans le surnageant. Les objectifs principaux du présent travail sont séparés en 2 catégories. Tout d'abord, nous avons tenté de mieux caractériser l'entrée du virus dans les cellules dendritiques. Nous avons également essayé d'identifier la nature du ou des facteurs cytotoxiques retrouvés dans le surnageant de cellules dendritiques infectées par le VIH. Nos résultats démontrent qu'une souche du VIH-1 démontrant un tropisme pour les lignées de lymphocytes T peut entrer dans les CDs thymiques par un mécanisme qui ne requiert pas la présence des récepteurs de surface CD4 et CXCR4 habituellement utilisés par cette souche virale. Ce mécanisme d'entrée est utilisé par les virus infectieux aussi bien que les virus inactivés à la chaleur. Cette entrée virale mène à la présence de la gp120 à la surface des cellules. Nos résultats démontrent également que la cytotoxicité associée au surnageant est dûe à une combinaison de facteurs. Au moins, deux cytokines, le FasL et le TNFa ainsi que la protéine virale gp120 semblent jouer un rôle dans cette cytotoxicité. Par analogie avec les observations faites in vitro, l'infection des CDs thymiques in vivo pourrait entraîner la présentation d'antigènes viraux au cours du processus de selection négative des thymocytes et contribuer à l'élimination des lymphocytes réagissant contre le VIH. Cette infection pourrait aussi occasionner le relargage de facteurs cytotoxiques pour les thymocytes. Ces effets pourraient ultimement entraîner une diminution de la réponse immunitaire dirigée contre le VIH ansi qu'une diminution dans le réapprovisionnement en lymphocytes T matures causant ainsi un progression plus rapide de la maladie et ce, plus spécialement chez l'enfant chez lequel le thymus joue un rôle crucial.

Le transfert adoptif de lymphocytes T virus-spécifiques ou ‘’Chimeric Antigen Receptors’’ (CAR) s’est avéré efficace pour le traitement de plusieurs types d’infections virales et certains cancers à la suite d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, l’immunosuppression administrée pour la prévention du rejet de greffe et de la maladie du greffon contre l’hôte limite l’efficacité et la persistance à long terme des réponses médiées par ces lymphocytes. L’agent immunosuppresseur Tacrolimus (FK506) est parmi les plus utilisés, et fonctionne en liant la protéine FK506-Binding protein (FKBP12) afin d’exercer ses effets immunosuppresseurs sur les lymphocytes T. Dans le but de fournir une protection anti-virale, mais également anti-lymphoprolifératif des lymphocytes B et permettre la poursuite de cette immunosuppression préventive, nous avons pour objectif de générer des lymphocytes CAR-T et virus-spécifiques résistants à l’action du FK506 par l’invalidation du FKBP12. En utilisant la méthode d’édition génique basée sur les CRISPR ciblés par la nucléase Cas9, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T stimulés par CD3-CD28. L’efficacité du knockout a été validée par Western Blot et TIDE sequencing. Le knock-out du gène du FKBP12 a conféré un maintien de la croissance cellulaire et des fonctions effectrices telles que la synthèse de cytokines IL-2, TNFα et IFN γ en présence de Tacrolimus comparativement aux cellules contrôles. Par la même méthode, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T multivirus-spécifiques dont l’efficacité a été validée par cytométrie en flux. Les fonctions effectrices ont également été maintenues en présence de tacrolimus et ont été évaluées par ELISpot. Enfin, des lignées de lymphocytes T multivirus spécifiques dont le gène du FKBP12 a été invalidé ont été transduites avec un vecteur lentiviral dans le but d’exprimer un CAR CD19 dont l’expression a été validée par cytométrie en flux et la réactivité maintenue en présence de tacrolimus. En conclusion, ces résultats nous ont permis de démontrer la faisabilité de génération de lymphocytes T « triple fonction » anti-tumorales, anti-virales et résistantes au tacrolimus. L’application de cette approche semble prometteuse dans un contexte d’une immunothérapie adoptive anti-virale et anti-tumorale post-transplantation de moelle osseuse. / Adoptive transfer of virus-specific T lymphocytes or CAR-T cells has been shown to be effective for the treatment of several types of viral infections and certain cancers following hematopoietic cell transplantation. However, immunosuppression administered for the prevention of transplant rejection and graft-versus-host disease limits the efficacy and long-term persistence of responses mediated by these lymphocytes. The widely used immunosuppressive agent Tacrolimus (FK506) requires FK506-Binding protein (FKBP12) to exert its immunosuppressive effects on T cells. We undertook to engineer a multifunctional T-cell therapy to both optimally prevent viral reactivation and relapse of B-cell malignancies post-transplant in the context of immunosuppression. The objective of our work is to generate tacrolimus resistant, multivirus-specific T-cell lines expressing an anti-CD19 CAR. Using the gene editing method based on Clustered Regular interspaced short palidromic repeats (CRISPR) targeted by the CRISPR-associated protein 9 (Cas9) nuclease, we were able to invalidate the FKBP12 gene on activated T cells (confirmed by TIDE sequencing and western blotting). Invalidation of FKBP12 conferred maintenance of cell growth and effector functions such as the synthesis of cytokines IL-2, TNFα and IFNγ in the presence of Tacrolimus. Using the same method, we were able to delete the FKBP12 gene in virus-specific T lymphocytes. Effector functions were also maintained in the presence of tacrolimus. Finally, we integrated an anti-CD19 CAR by lentiviral transduction into FKBP12-edited multi-virus T-cell lines, and the efficiency of transduction was determined by flow cytometry. The cells maintained their viral reactivity in the presence of tacrolimus. In conclusion, we were able to confirm the feasibility of generation of ‘’triple function’’ T cells (anti-viral, anti-tumoral and tacrolimus resistant). Multifunctional T-cell product manufacturing is a promising approach to optimize post-transplant T-cell immunity against opportunistic pathogens and underlying malignancies.

La thérapie antirétrovirale (ART) a permis d’augmenter l’espérance de vie et sa qualité chez les individus infectés par le VIH-1. Toutefois, l’inflammation chronique persiste et est associée à un excès du « B-cell activating factor » (BAFF). Cette cytokine est un facteur clé de la survie et la différenciation des lymphocytes B, en particulier pour ceux dits de la zone marginale (MZ) qui sont des populations B dites innées possédant un « B-cell receptor » (BCR) polyréactif. Dans le contexte de l’infection au VIH-1, l’excès de BAFF a été associé avec la dérégulation du compartiment B, l’hyperglobulinémie, ainsi que le bris de tolérance et l’apparition de manifestations auto-immunes. De plus, nous avons observé une augmentation de la fréquence d’une population présentant à la fois des caractéristiques de cellules B MZ et transitionnelles immatures (TI) que nous avons nommée « précurseurs des MZ » (MZp) dans le sang des individus infectés. Ces MZp partagent également certains marqueurs phénotypiques avec plusieurs populations B régulatrices (Breg) identifiées chez l’humain. Les objectifs de ce travail sont de 1) caractériser le potentiel Breg des MZp par l’analyse de leur transcriptome et par cytométrie en flux, puis 2) d’étudier l’impact de l’infection au VIH-1 et d’un excès de BAFF sur le potentiel Breg des MZp sanguins d’individus de la cohorte de la primo-infection (PHI) du réseau FRQS, et 3) d’étudier l’impact de l’infection au VIH-1 et d’un excès de BAFF sur la production d’anticorps spécifiques au VIH-1 et la possible contribution des MZp à l’hyperglobulinémie chez ces individus. Dans un premier temps, nos résultats démontrent que les MZp d’individus non infectés possèdent un important phénotype Breg caractérisé par l’expression des molécules régulatrices NR4As, CD83, CD39, CD73 et l’IL-10. Les MZp ont également une fonction régulatrice impliquant CD83 et PD-L1. Dans un deuxième temps, nos résultats démontrent que dans le contexte du VIH-1, ce potentiel est complètement altéré vu la diminution d’expression de ces molécules et par la perte de la fonction régulatrice, et qui est directement affectée par un excès de BAFF. Enfin, nous démontrons que les MZp des individus infectés ont un profil associé à l’épuisement et que les gènes impliqués dans l’activation menant à la production d’anticorps sont augmentés, au détriment de ceux associés à la régulation. De façon intéressante, les MZp provenant du sang d’individus infectés expriment à la hausse des transcrits de gènes IGHV impliqués dans la génération d’anticorps neutralisants du VIH-1. De plus, nous démontrons que la quantité et la qualité des IgG spécifiques au virus sont en lien avec le statut de progression de l’infection et le niveau des taux de BAFF qui y est associés. Ainsi, basé sur nos résultats, il serait possible d’envisager une étude avec des avenues thérapeutiques existantes, ciblant BAFF ou l’expression des NR4As, pour tenter de diminuer les niveaux de BAFF ou restaurer le potentiel Breg des MZp respectivement. De telles avenues, en combinaison avec ART, pourraient être intéressantes dans le but de diminuer l’inflammation chronique et restaurer l’immunocompétence chez ces individus. / Antiretroviral therapy (ART) has increased life quality and longevity of HIV-infected individuals. However, chronic inflammation persists and is associated with increased B-cell activating factor (BAFF). BAFF is a key survival and differentiation factor for B-cells, especially for marginal zone B-cells (MZ). MZ are innate-like B-cells that are known for their quick antibody responses and polyreactive B-cell receptor (BCR). In the context of HIV-1 infection, BAFF is found in excess in the blood of infected individuals and is associated with the dysregulation of the B-cell compartment, hyperglobulinemia, breach of tolerance and autoimmune manifestations. We reported an increase in the frequency of precursor-like MZ (MZp) B-cells in the blood of HIV-infected individuals. Interestingly, these MZp possess a phenotype that is similar to certain Breg populations identified in human. The objective of this work is to first characterize the Breg potential of MZp from HIV-uninfected individuals by RNAseq analyses and flow cytometry, and second to study the impact of HIV-1 infection and excess BAFF on the dysregulation of the Breg potential of MZp from blood samples of individuals from the primo-infection (PHI) cohort of the FRQS. Our third objective is to study the impact of HIV-infection and excess BAFF on HIV-1 specific antibodies and better understand the contribution of MZp to hyperglobulinemia in HIV-1 infected individuals. Our results showed that MZp from HIV-uninfected individuals possess a stong Breg phenotype characterized by high expression of regulatory molecules such as NR4As, CD83, CD39, CD73 and IL-10. They also have an important Breg function that involves CD83 and PD-L1. We also demonstrate that HIV-1 infection impairs the Breg potential of MZp by downregulating the expression of regulatory markers and by altering their function, which high BAFF levels can directly affect. Also, MZp from HIV-infected individuals present an exhausted profile and an increased expression of genes involved in immunoglobulin (Ig) production. Interestingly, MZp from the blood of HIV-infected individuals show increased expression of IGHV gene transcripts associated with broadly neutralizing antibodies. We find that the quantity and quality of HIV-Env specific IgG is linked with disease progression status and associated levels of BAFF. Our results suggest that existing therapeutic strategies targeting BAFF or NR4As expression could be contemplated in order to try reducing BAFF levels or for restoring Breg potential, respectively. As such, such avenues could be envisaged as adjunct to ART to lower the inflammatory burden and restore immune competence of HIV-infected individuals.

La reconnaissance du peptide lié au complexe majeur d’histocompatibilité (pCMH) par les cellules T CD8+ et leur récepteur spécifique (TCR) est une étape cruciale dans l’établissement d’une réponse immunitaire protectrice adéquate et de longue durée. L’engagement du TCR engendre une cascade d’évènements de signalisation qui contrôle la prolifération, la différenciation et les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+ (LT8). Différentes études suggèrent un rôle crucial du zinc dans la biologie des LT8, particulièrement l’observation d’un influx de zinc suivant l’engagement du TCR. De plus, la multitude de transporteurs contrôlant homéostasie du zinc au sein des LT8, couplé aux multiples rôles de cet ion dans les processus cellulaires nous a amené à concentrer notre recherche sur le rôle du zinc dans les cellules T CD8+, qui à ce jour n’est que peu décrit. ZIP13, un des 14 transporteurs contrôlant l’homéostasie du zinc chez les LT8 murins, régule l’activation, la prolifération et la différenciation de ces cellules. En effet, une diminution de l’expression de ZIP13 (ZIP13-KD) en utilisant un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) entraîne une activation précoce exacerbée des LT8 se traduisant par une plus grande prolifération. Ceci a été démontré in vitro dans des lignées d’hybridomes CD8+, mais également chez les LT8 primaires murins (OT-I). De plus, cette hyperactivation est suivie par une perte substantielle des cellules, démontrant un rôle pour ZIP13 de régulateur positif de la survie des cellules T CD8+. L’étude d’une modulation de l’expression de ZIP13 chez les cellules primaires OT-I in vivo dans un modèle d’infection aiguë à Listeria monocytogenes souligne des rôles additionnels de ce gène dans la différenciation des populations effectrices des LT8. Les LT8 ZIP13-KD montrent un biais de différenciation vers la population de cellules effectrices précoces (EEC) au détriment des autres populations effectrices, ainsi qu’une diminution de Ly6C dans les organes lymphoïdes secondaires (SLO). Au site de l’infection, les cellules ZIP13-KD sont enrichies en précurseur de cellules T CD8+ résidentes mémoires (pré-Trm). ZIP13 joue également un rôle dans la formation de la mémoire immunologique puisque les cellules ZIP13-KD ne forment pas de cellules T CD8+ centrales mémoires (Tcm) dans les ganglions lymphatiques. Ces observations sont, corrélées avec une diminution drastique du marqueur de surface CD62L. Ceci se traduit par des cellules OT-I ZIP13-KD formant une mémoire immunologique uniquement composée LT8 effecteurs mémoires (Tem) et de LT8 résidents mémoires (Trm). Finalement, des analyses transcriptomiques des OT-I ZIP13-KD au stade effecteur de la réponse à une infection à Lm-OVA identifient des signatures de gènes associées aux LT8 épuisés et aux cellules Tc17. Nos résultats soulignent l’importance d’une régulation stricte et précise de l’homéostasie du zinc dans les cellules T CD8+ par des transporteurs spécifiques pour une réponse immunitaire adéquate. ZIP13 est le premier transporteur étudié dans le contexte d’une infection aiguë et identifié comme crucial pour la différenciation des populations effectrices ainsi que la formation de la mémoire immunitaire, ajoutant de l’importance à la régulation du zinc dans la biologie des LT8. Une connaissance précise de l’homéostasie spatiotemporelle du zinc dans les LT8 identifierait de nouveaux mécanismes de régulation de ces cellules qui pourrait mener potentiellement au développement de nouveaux outils pour des immunothérapies à base de cellules T génétiquement modifiées. / CD8+ T cell activation via the recognition of peptide-loaded major histocompatibility complex (pMHC) by the T cell receptor (TCR) is crucial for the establishment of a long lasting and protective immune response. TCR triggering induces a cascade of signaling events controlling T cell effector function and differentiation. The multitude of genes controlling zinc homeostasis in T cells, and the observation of an influx of zinc following TCR activation point towards a link between the regulation of zinc homeostasis and CD8+ T cell biology. This growing body of evidence led us to focus our research on zinc homeostasis in T cells, which remains poorly understood. With this study, we have shown that ZIP13, one of the many transporters controlling zinc homeostasis, significantly regulates T cell activation and differentiation following activation. Knockdown (KD) of ZIP13 by shRNA led to a substantial increase in early activation, both in murine CD8+ T cell lines and primary mouse OT-I cells in vitro. Subsequently, this increase in T cell activation is followed by a massive loss of these cells days after activation, highlighting an addition role for ZIP13 in T cell survival. Study of ZIP13 in primary CD8+ T cells in an in vivo acute infection model of Listeria monocytogenes highlights new roles of ZIP13 in the control of effector T cell differentiation. ZIP13-KD in CD8+ T cells alter the normal effector cell differentiation pattern; favoring the early effector cells (EEC) subset and induces a decrease in the surface marker Ly6C in secondary lymphoid organs. At the site of infection, ZIP13-KD CD8+ T cells are enriched in resident memory T cells precursor (pre-Trm). ZIP13 has also an impact on memory T cell formation, since ZIP13-KD cells are lacking the central memory population (Tcm), through the drastic decrease of the surface marker CD62L. This results in ZIP13-KD cells at the memory stage that are mostly composed of effector memory (Tem) and resident memory (Trm) cells. Finally, transcriptomic analyses of WT CD8+ T cells and ZIP13-KD CD8+ T cells at the effector stage demonstrates ZIP13’s role in driving an exhausted T cell and Tc17 cell gene expression signature. Taken together, our results point to the importance of a strict and fine-tuned regulation of zinc homeostasis in T cells through specific zinc transporters for an effective immune response. ZIP13 is the first zinc transporter reported as essential for T cell differentiation and memory formation, adding weight to the importance of zinc regulation in CD8+ immune responses. Having a clear picture of zinc homeostasis in CD8+ T cells would reveal new mechanisms regulating the activity of these cells that could potentially lead to the development of new tools for T cell-based immunotherapy.

La thérapie par cellules T à récepteur d'antigène chimérique (CAR) a produit d'incroyables réponses cliniques contre plusieurs tumeurs malignes, mais elle laisse une marge de manœuvre pour l'échappement de l'antigène. Une nouvelle approche pour surmonter ce problème consisterait à combiner la capacité des CAR à cibler les tumeurs avec la capacité des cellules dendritiques (CD) à amorcer les cellules T afin de générer une thérapie cellulaire qui favorise la propagation de l'épitope plutôt que la destruction directe de la cible. J'ai donc émis l'hypothèse que les cellules dendritiques exprimant les CAR (CAR-CD) peuvent renforcer l'amorçage des cellules T contre les cibles tumorales afin de produire un contrôle adaptatif des tumeurs médié par les cellules T. En utilisant des CD dérivées de la moelle osseuse murine, j'ai d'abord développé un nouveau protocole pour générer des CD. En ajoutant de l'IFNα aux cultures de DC GM-CSF, j'ai généré des CD qui expriment des niveaux plus élevés de molécules stimulant les cellules T et qui induisent une plus forte prolifération des cellules T CD8+ in-vitro par rapport aux CD générées avec le GM-CSF seul. In vivo, ces CD favorisent des réponses effectrices plus fortes, les cellules T CD8+ résultantes exprimant des niveaux plus élevés de marqueurs effectrices, notamment KLRG1 et TIM3, mais des niveaux plus faibles de molécules inhibitrices, notamment PD-1 et CD73. L'expression d'un CAR dans ces DC leur permet de tuer directement des cibles tumorales et d'acquérir des antigènes tumoraux. Plus important encore, ces CAR-CD sont en synergie avec les cellules T CD8+ pour contrôler les cellules tumorales in-vitro, en améliorant la prolifération et la capacité de destruction des cellules T. Chez la souris, les CAR-CD agissent comme un vaccin in vivo en favorisant la génération de réponses de cellules T spécifiques de la tumeur lorsqu'elles sont injectées par voie intratumorale, ce qui permet d'améliorer le contrôle de la tumeur. / Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cell therapy has produced unbelievable clinical responses against several malignancies however, this therapy leaves room for antigen escape. One novel approach to overcome this would be to combine the tumor targeting ability of CARs with the T cell priming capacity of dendritic cells (DCs) to generate a cell therapy that provokes endogenous adaptive immunity through epitope spreading rather than just direct target killing. Therefore, I hypothesized that CAR expressing DCs (CAR-DCs) can enhance T cell priming against tumor targets to produce adaptive T cell mediated tumor control. Using murine bone marrow derived DCs, I first developed a new protocol for generating DCs using IFNα. The addition of IFNα to GM-CSF DC cultures generated DCs that express higher levels of T cell stimulatory molecules and induce stronger CD8+ T cell proliferation in-vitro compared to DCs generated with GM-CSF alone. In-vivo, these DCs promote stronger effector responses with the resulting CD8+ T cells expressing higher levels of effector markers including KLRG1 and TIM3 but lower levels of inhibitory molecules including PD-1 and CD73. The expression of a CAR in these DCs allowed them to directly kill tumor targets and acquire tumor antigens. More importantly, these CAR-DCs synergized with CD8+ T cells to control tumor cells in-vitro, enhancing the proliferation and killing capacity of the T cells. In mice, CAR-DCs act as an in-vivo vaccine promoting the generation of tumor specific T cell responses when injected intratumorally, producing enhanced tumor control.

Les interactions neuro-immunitaires entre les systèmes sensoriels et immunitaires ont été abondamment étudiées; cependant, leur rôle dans la régulation des cancers est encore mal connu. Les interactions croisées entre les cytokines, les facteurs de croissance et les neuropeptides peuvent promouvoir la progression des tumeurs. Les neuropeptides libérés par les nocicepteurs peuvent affecter la polarisation, la chimiotaxie et l'activité du système immunitaire acquis. Étant donné que les neurones sensoriels libèrent localement des neuropeptides qui modulent l'activité des lymphocytes, nous faisons l'hypothèse que les nocicepteurs sécrètent des neuropeptides qui induisent l'épuisement des cellules T CD8 et la croissance tumorale. L’épuisement des lymphocytes T CD8 est un phénomène observé dans le cadre d’infections chroniques et de cancers. Elle est définie comme une perte de la fonction effectrice des lymphocytes T CD8 (diminution de la production d'IFN-γ, de TNF-α et d'IL-2) ainsi qu'une expression élevée de récepteurs inhibiteurs tels que PD-1 (protéine 1 de mort cellulaire programmée), LAG-3 (gène 3 d'activation des lymphocytes) et TIM-3 (protéine 3 d'immunoglobuline des lymphocytes T et de contenant du domaine mucine). Nous avons utilisé le modèle murin de mélanome pour tester cette hypothèse et avons observé que les cellules malignes de cancer de la peau B16F10 interagissent avec les nocicepteurs pour promouvoir la croissance des neurites, la sensibilité aux ligands activateurs et la libération de neuropeptides. En conséquence, le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP), qui est libéré par les nocicepteurs, augmente directement l'épuisement des cellules T CD8 et réduit leur capacité à éliminer les cellules du mélanome. L'ablation génétique des neurones sensoriels, leur inhibition pharmacologique ou le blocage du récepteur au CGRP (RAMP1) suffisent à limiter l'épuisement des lymphocytes infiltrés dans la tumeur et la croissance tumorale. De plus, l'injection de CGRP recombinant dans des souris dépourvues de neurones sensoriels réduit l'épuisement des cellules T CD8. Les cellules T CD8 RAMP1-/- montrent aussi moins d'épuisement que leurs homologues sauvages lorsqu'elles sont co-transplantées dans des souris immunodéficientes Rag1-/- portant une tumeur. En résumé, réduire la libération de CGRP en bloquant localement les nocicepteurs associés à la tumeur limite les effets immunomodulateurs de CGRP sur les cellules T cytotoxiques CD8 et représente une stratégie d'intérêt pour protéger l'immunité antitumorale. / Neuroimmune crosstalk between the nervous and the immune systems has been widely studied; however, their modulating roles are largely unknown in cancer. Bilateral interactions of cytokines, growth factors and neuropeptides may support tumor progression. Nociceptor-released neuropeptides can affect polarization, chemotaxis and adaptive immune system activity. Since sensory neurons locally release neuropeptides that modulate the activities of lymphocytes, we hypothesized that nociceptors might secrete neuropeptides leading to CD8+ T-cell exhaustion and tumor growth. CD8 T cell exhaustion is a phenomenon observed in the context of chronic infections and cancer. It is defined as loss of effector function of CD8 T cells (decreasing the production of IFN-γ, TNF-α, and IL-2) as well as high expression of inhibitory receptors such as PD-1 (programmed cell death protein 1), LAG-3 (lymphocyte-activation gene 3), and TIM-3 (T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3). We used the mouse model of melanoma cancer to test this hypothesis and found that malignant B16F10 skin cancer cells interacted with nociceptors to expand neurite outgrowth, responsiveness to noxious ligands, and neuropeptide release. Consecutively, neuropeptide calcitonin gene-related peptide (CGRP), which is released by nociceptors, directly increased the exhaustion of cytotoxic CD8+ T cells and reduced their ability to eliminate melanoma cells. Genetic ablation of sensory neurons, local pharmacological silencing, and antagonism of the CGRP receptor (RAMP1) were all able to limit the exhaustion of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and tumor growth. Moreover, treatment with recombinant CGRP in sensory neuron- depleted mice reduced the exhaustion of CD8+ T cells. Compared with wild-type cells, RAMP1-/- CD8+ T cells were rescued to go under exhaustion when co-transplanted into tumor-bearing Rag1-/- deficient mice. In summary, reducing CGRP release by local silencing of tumor-associated nociceptors, limits the immunomodulatory effects of CGRP on cytotoxic CD8+ T cells and represents an ideal strategy to protect anti-tumor immunity.