This document only includes an excerpt of the corresponding thesis or dissertation. To request a digital scan of the full text, please contact the Ruth Lilly Medical Library's Interlibrary Loan Department (rlmlill@iu.edu).

This document only includes an excerpt of the corresponding thesis or dissertation. To request a digital scan of the full text, please contact the Ruth Lilly Medical Library's Interlibrary Loan Department (rlmlill@iu.edu).

Nesse trabalho foram estudadas 2 estratégias visando a purificação de IgM a partir de plasma humano. A primeira estratégia baseou-se em um processo desenhado para a fábrica de produção de hemoderivados do Instituto Butantan para a produção dos fatores de coagulação VIII e IX, albumina e IgG. Após 2 colunas cromatográficas, a IgM foi separada das 2 proteínas mais abundantes do plasma, a albumina e a IgG e o enriquecimento da IgM em relação a IgA e IgG foi bastante satisfatória. A segunda estratégia está inserida no processo de fracionamento de plasma desenvolvida em nosso laboratório. Através de um estudo sistemático em coluna de troca aniônica, obtivemos uma fração contendo IgG, uma contendo albumina, ambos praticamente puros e uma terceira contendo IgM e outras proteínas contaminantes. Os resultados obtidos indicam que a IgM pode ser purificada com sucesso empregando ambas as estratégias. Entretanto, para se obter um produto mais homogêneo, será necessário ainda adicionar uma ou mais etapas de purificação. / In this work we studied two strategies for the purification human plasma IgM. The first strategy was based on a process designed for the hemoderivatives production factory of the Butantan Institute for the production of coagulation factors VIII and IX, albumin and IgG. After 2 chromatographies, IgM was separated from the 2 most abundant plasma proteins, that is, albumin and IgG and the achieved enrichment of IgM in relation to IgG and IGA was very satisfactory. The second strategy is part of a plasma fractionation process under development in our laboratory. Through a systematic study using an anionic exchange column we separated a fraction containing IgG, a second containing albumin, being both nearly pure and a third fraction containing IgM and other contaminating proteins. The obtained results indicate that IgM can be purified successfully by both strategies. However, to obtain a more homogeneous product, additional purification steps are necessary.

Nesse trabalho foram estudadas 2 estratégias visando a purificação de IgM a partir de plasma humano. A primeira estratégia baseou-se em um processo desenhado para a fábrica de produção de hemoderivados do Instituto Butantan para a produção dos fatores de coagulação VIII e IX, albumina e IgG. Após 2 colunas cromatográficas, a IgM foi separada das 2 proteínas mais abundantes do plasma, a albumina e a IgG e o enriquecimento da IgM em relação a IgA e IgG foi bastante satisfatória. A segunda estratégia está inserida no processo de fracionamento de plasma desenvolvida em nosso laboratório. Através de um estudo sistemático em coluna de troca aniônica, obtivemos uma fração contendo IgG, uma contendo albumina, ambos praticamente puros e uma terceira contendo IgM e outras proteínas contaminantes. Os resultados obtidos indicam que a IgM pode ser purificada com sucesso empregando ambas as estratégias. Entretanto, para se obter um produto mais homogêneo, será necessário ainda adicionar uma ou mais etapas de purificação. / In this work we studied two strategies for the purification human plasma IgM. The first strategy was based on a process designed for the hemoderivatives production factory of the Butantan Institute for the production of coagulation factors VIII and IX, albumin and IgG. After 2 chromatographies, IgM was separated from the 2 most abundant plasma proteins, that is, albumin and IgG and the achieved enrichment of IgM in relation to IgG and IGA was very satisfactory. The second strategy is part of a plasma fractionation process under development in our laboratory. Through a systematic study using an anionic exchange column we separated a fraction containing IgG, a second containing albumin, being both nearly pure and a third fraction containing IgM and other contaminating proteins. The obtained results indicate that IgM can be purified successfully by both strategies. However, to obtain a more homogeneous product, additional purification steps are necessary.

This document only includes an excerpt of the corresponding thesis or dissertation. To request a digital scan of the full text, please contact the Ruth Lilly Medical Library's Interlibrary Loan Department (rlmlill@iu.edu).

No description available.

This document only includes an excerpt of the corresponding thesis or dissertation. To request a digital scan of the full text, please contact the Ruth Lilly Medical Library's Interlibrary Loan Department (rlmlill@iu.edu).

As células da linhagem macrofágica são fundamentais na infecção por T. cruzi. Além do reconhecimento por PRRs, a interação com anticorpos e/ou complemento facilita a internalização. Avaliamos o papel in vivo e in vitro de IgM e IgG específicas na saída de parasitas Sylvio X10/4 do sangue, um clone miotrópico de T. cruzi que causa infecção sem parasitemia patente. Devido à sua saída espontânea, estudamos a remoção no sexto dia de infecção, momento em que a parasitemia subpatente aumenta. Camundongos foram infectados e tratados com soro normal (NMS), soro crônico (B6) e soro de animais CD28KO crônicos (que produzem somente IgM). O grupo tratado com soro de CD28KO apresentou uma remoção significativa, porém menos eficiente do que com soro crônico (B6). Tais resultados foram reproduzidos em estudo in vitro na invasão de macrófagos (derivados de medula óssea ou do peritônio) com os distintos tratamentos. Concluímos que os macrófagos são fundamentais na remoção dos parasitas e os anticorpos, não somente IgG, mas também os da classe IgM reforçam este processo. / The cells of the macrophage lineage are essential for the infection by T. cruzi. Besides the recognition by PRRs, interaction with antibodies and/or complement facilitates internalization. We evaluated the role in vivo and in vitro of specific IgM and IgG in the blood output of parasites Sylvio X10/4, clone myotropic of T. cruzi which causes infection without patent parasitemia. Due to its spontaneous exit, we studied the removal on the sixth day of infection, when the parasitemia subpatent increases. Mice were infected and treated with normal mouse serum (NMS), chronic serum (B6) and serum from CD28KO chronic mice (which produce only IgM). The group treated with CD28KO serum showed a significant removal, but less efficiently than with chronic serum (B6). These results were reproduced in vitro study on the invasion of macrophages (derived from bone marrow or peritoneum) with these different treatments. We conclude that macrophages are essential in the removal of parasites and antibodies, not only IgG, but also IgM enhance this process.

An intact complement system including the complement receptors 1 and 2 (CR1/2) is crucial for the generation of a normal antibody response in animals and humans. Moreover, activation of the classical pathway is thought to be important since deficiency in complement components C1q, C2, C4 or C3 lead to impaired antibody responses. The classical pathway is mainly initiated by antibodies bound to their antigen. It is unclear how classical pathway activation can be crucial for primary antibody responses since the levels of specific antibodies are very low in naïve animals. It has been hypothesized that natural IgM, with high enough affinity, can initiate the classical pathway after immunization. To test this, we generated the knock-in mouse strain Cμ13, producing IgM unable to activate complement. Surprisingly, the antibody response against SRBC and KLH in Cµ13 mice was normal. Thus, the importance of classical pathway activation and natural IgM in antibody responses is not dependent on the ability of IgM to activate complement. SIGN-R1, SAP and CRP are other known activators of the classical pathway, but mice lacking these also had normal antibody responses. Complement activation leads to the generation of C3 split products which are ligands for CR1/2. In mice, CR1/2 are expressed on B cells and follicular dendritic cells (FDC), but it is unclear on which cell-type expression of CR1/2 is needed for the generation of a normal antibody response. Some reports argue that increased antigen retention by CR1/2+ FDC would increase the effective antigen concentration, giving more effective B-cell stimulation. In contrast, several mechanisms involving CR1/2 on B cells are suggested. First, marginal zone B cells could transport complement-coated antigen or IC via CR1/2 into the follicle. Second, different ways of co-crosslinking the B-cell receptor with CR1/2, lowering the threshold for B-cell activation, have been proposed. Finally, CR1/2 on B cells are shown in vitro to facilitate endocytosis and thereby presentation of antigen to T cells. We show that abrogated antibody responses in mice lacking CR1/2 are not due to lack of CR1/2-mediated antigen presentation to T cells. Chimeric mice with CR1/2 expression on both B cells and FDC, on neither B cells nor FDC, or on either B cells or FDC, were generated. The antibody response against SRBC was completely dependent of CR1/2-expression on FDC. However, when this requirement was fulfilled, B cells without expression of CR1/2 were equally efficient antibody producers as wildtype B cells. Antigen-specific IgM together with its antigen can enhance the antibody response to that antigen and CR1/2-expression is crucial for the enhancement. We show that the response to IgM in complex with SRBC is dependent on CR1/2 expression on both B cells and FDC.

Orientador: Claudio Lucio Rossi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suzuki_LisandraAkemi_D.pdf: 1217880 bytes, checksum: 4ceb1f773f112c88145bc69e02976ef2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A neurocisticercose (NC) e uma importante causa de doença neurológica em muitos paises em desenvolvimento, incluindo o Brasil. O diagnostico clinico da NC e dificultado pelo polimorfismo e pela não especificidade dos sintomas. As tecnicas de neuroimagem e pesquisa de anticorpos específicos tem contribuído para o diagnostico da NC e uma melhor compreensão dos processos fisiopatológicos dessa infecção. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, por meio de técnicas imunoenzimaticas (ELISA), a resposta imune humoral na NC, utilizando como preparações antigênicas o liquido vesicular (LV) e uma fração glicoproteica obtida do extrato bruto de cisticercos de Taenia solium (T. solium) com afinidade por lentil-lectina (fração Gp). Cinquenta e seis amostras de liquido cefalorraquidiano (LCR), 22 de pacientes com NC e 34 de pacientes com outros problemas neurológicos, foram utilizadas para a pesquisa de IgG e suas subclasses, com os seguintes resultados: IgG-LV: 100% de sensibilidade e especificidade; IgG1 -LV: 72,73% de sensibilidade e 100% de especificidade; IgG2-LV: 81,81% de sensibilidade e 100% de especificidade; IgG3-LV: 59,09% de sensibilidade e 97,06% de especificidade; IgG4-LV: 90,91% de sensibilidade e 97,06% de especificidade; IgG-fração Gp: 90,91% de sensibilidade e 97,06% de especificidade; IgG1-fração Gp: 59,09% de sensibilidade e 91,18% de especificidade; IgG2-fração Gp: 68,18% de sensibilidade e 94,12% de especificidade; IgG3-fração Gp: 36,36% de sensibilidade e 100% de especificidade; IgG4-fração Gp: 86,36% de sensibilidade e 100% de especificidade. Quarenta e sete amostras de LCR, 16 de pacientes com NC e 31 de pacientes com outros problemas neurológicos foram utilizadas para a pesquisa de IgE, com os seguintes resultados: IgE-LV e IgE-fração Gp: 93,75% de sensibilidade e 100% de especificidade. Cinquenta e sete amostras de soros, 22 de pacientes com NC, 18 de pacientes com outras infecções e 17 de pessoas presumivelmente sadias, foram utilizadas para a pesquisa da IgG e suas subclasses, IgE, IgA e IgM, com os seguintes resultados: IgG-LV: 100% de sensibilidade e especificidade; IgG1-LV: 86,36% de sensibilidade e 94,28% de especificidade; IgG2-LV: 90,91% de sensibilidade e 97,14% de especificidade; IgG3-LV: 86,36% de sensibilidade e 97,14% de especificidade; IgG4-LV: 100% de sensibilidade e de especificidade; IgG-fração Gp: 95,45% de sensibilidade e 100% de especificidade; IgG1-fração Gp: 63,64% de sensibilidade e 94,28% de especificidade; IgG2-fração Gp: 68,18% de sensibilidade e 97,14% de especificidade; IgG3-fração Gp: 54,54% de sensibilidade e 88,57% de especificidade; IgG4-fração Gp: 90,91% de sensibilidade e 100% de especificidade; IgELV: 90,91% de sensibilidade e 97,14% de especificidade; IgE-fração Gp: 86,36% de sensibilidade e 100% de especificidade; IgA-LV: 54,54% de sensibilidade e 94,28% de especificidade; IgA-fração Gp: 13,63% de sensibilidade e 100% de especificidade. Anticorpos IgM não foram detectados com as preparações de LV e fração Gp. Nossos resultados mostraram que, com ambas as preparações antigênicas, tanto em amostras de LCR quanto em amostras de soros, a maior positividade foi obtida na detecção de anticorpos das classes IgG e IgE, seguida da positividade da IgA. Anticorpos IgM não foram detectados em amostras de soros com reações de ELISA realizadas com LV e fração Gp. Com relação as subclasses da IgG, a IgG4 apresentou, tanto em amostras de LCR como em amostras de soros, valores de positividade e concentração iguais ou superiores as outras subclasses. As reações ELISA realizadas com LV mostraram sensibilidades iguais ou superiores aquelas obtidas com a fração Gp. Considerando a complexidade e o custo final da obtenção da fração Gp, o LV pode ser considerado mais adequado para a pesquisa de anticorpos em amostras de LCR e soros de pacientes com NC. / Abstract: Neurocysticercosis (NC) is an important cause of neurological disease in many developing countries, including Brazil. The clinical diagnosis of NC is hindered by the polymorphism and non-specificity of the symptoms. Neuroimaging techniques and detection of specific antibodies have contributed to the diagnosis of NC and a better understanding of the physiopathological processes of this infection. The purpose of this study was to evaluate the humoral immune response in NC by using immunoenzymatic techniques (ELISA) in which vesicular fluid (VF) and a glycoprotein fraction purified from a crude extract of Taenia solium cysticerci with affinity for lentil-lectin (fraction Gp) were used as antigenic preparations. Fifty-six cerebrospinal fluid (CSF) samples, 22 from patients with NC and 34 from patients with other neurological disorders, were assayed for IgG and IgG subclasses, with the following results: IgG-VF: 100% sensitivity and specificity, IgG1 - VF: 72.73% sensitivity and 100% specificity, IgG2 -VF: 81.81% sensitivity and 100% specificity, IgG3 -VF: 59.09% sensitivity and 97.06% specificity, IgG4 -VF: 90.91% sensitivity and 97.06% specificity, IgG-fraction Gp: 90.91% sensitivity and 97.06% specificity, IgG1- fraction Gp: 59.09% sensitivity and 91.18% specificity, IgG2-fraction Gp: 68.18% sensitivity and 94.12% specificity, IgG3 -fraction Gp: 36.36% sensitivity and 100% specificity, IgG4 - fraction Gp: 86.36% sensitivity and 100% specificity. Forty-seven CSF samples, 16 from patients with NC and 31 from patients with other neurological disorders, were assayed for IgE, with the following results: IgE-VF and IgE-fraction Gp: 93.75% sensitivity and 100% specificity. Fifty-seven serum samples, 22 from patients with NC, 18 from patients with other infections and 17 from presumably healthy individuals, were assayed for IgG, IgG subclasses, IgE, IgA and IgM, with the following results: IgG-VF: 100% sensitivity and specificity, IgG1-VF: 86.36% sensitivity and 94.28% specificity, IgG2 -VF: 90.91% sensitivity and 97.14% specificity, IgG3 -VF: 86.36% sensitivity and 97.14% specificity, IgG4 -VF:100% sensitivity and specificity, IgG-fraction Gp: 95.45% sensitivity and 100% specificity, IgG1- fraction Gp: 63.64% sensitivity and 94.28% specificity, IgG2 -fraction Gp: 68.18% sensitivity and 97.14% specificity, IgG3 -fraction Gp: 54.54% sensitivity and 88.57% specificity, IgG4 - fraction Gp: 90.91% sensitivity and 100% specificity, IgE-VF: 90.91% sensitivity and 97.14% specificity, IgE-fraction Gp: 86.36% sensitivity and 100% specificity, IgA-VF: 54.54% sensitivity and 94.28% specificity, IgA-fraction Gp: 13.63% sensitivity and 100% specificity. No specific IgM antibodies were detected with VF and fraction Gp antigenic preparations. These results show that with the two antigenic preparations the highest positivity in CSF and serum samples was obtained for IgG and IgE antibodies, followed by positivity for IgA. No IgM antibodies were detected in serum samples assayed with VF and fraction Gp. With regard to IgG subclasses, IgG4 positivity and concentration in CSF and serum samples were higher than or equal to the other subclasses. ELISA reactions done with VF showed equal or higher sensitivities than those obtained with fraction Gp. Considering the complexity and high cost of obtaining fraction Gp, VF could be more suitable for detecting specific antibodies in CSF and serum samples from patients with NC. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas