The transcription factor c-Myc plays a central role in cell growth and proliferation owing to the large number of genes it transactivates or transrepresses and to the fact that these genes are in turn implicated in these cellular processes. Also, c-Myc's deregulation and/or overexpression contribute to most aspects of tumoral cellular biology. As a heterodimer with Max, c-Myc activates the transcription of genes leading to cell proliferation and represses the transcription of cytostatic genes such as p15[superscript ink4b] and p21[superscript CiP1]. In contrast to the transactivation mechanism, our current understanding of the transrépression by c-Myc is still incomplete, aside from the fact that an interaction with Miz-1 is essential. Coupling preliminary results from a collaboration with Martin Eilers' group to data obtained following a bioinformatics' approach to predict Miz-1 DNA binding, we were able to elaborate a now transrepression mechanism for c-Myc/Miz-1. In this mechanism, the c-Myc/Max heterodimer directly binds the noncanonical E-box sequences present in the promoters and provoke the supercoiling of DNA assisted by the interaction between c-Myc and Miz-1. This supercoiling impairs accessibility to the initiation site to the transcriptional machinery. This thesis aims at the study on a structural and biophysics viewpoint of the determinants for the specific heterodimerization and DNA binding by c-Myc and Max and the interaction between c-Myc and Miz-1 in order to validate our mechanistic model for the transrépression by c-Myc. In chapter 1, we present an overview of the actual knowledge on Myc and the repression model along with some of the results that led to its elaboration. Chapters 2 and 3 report the study of the structural determinants for the heterodimerization and E-box binding by the b-HLH-LZ domains of c-Myc and Max. Our model allows to predict that b-HLH-LZ peptides able to bind the E-box present in the repressed promoters without interaction with Miz-1 could reverse the inaccessibility and reactivate p15[superscript ink4b] and p21[superscript Cip1] expression in cancer cells where c-Myc is overexpressed.The results presented in this thesis will find application in the development of new inhibitors of c-Myc eventually leading to novel therapies to fight cancer.

Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s'inscrit comme un élément clef dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. L'implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux dommages à l'ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série d'analyses a démontré l'importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs d'acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l'activité catalytique de Esa1. Parallèlement, d'autres études ont permis d'approfondir la fonction du domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté directement au site de cassure de l'ADN. Des recherches menées autour de l'étude de l'activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l'implication de NuA4 dans les événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce complexe dans la réparation de l'ADN.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie mortelle caractérisée par une dégénérescence des neurones moteurs supérieurs et inférieurs. La présence d’inclusions ubiquitinylées de la protéine TDP-43 (Transactive response DNA-binding protein 43) est une caractéristique de la SLA. Afin de comprendre le mécanisme pathogène impliquant cette protéine, nous avons généré et étudié des souris transgéniques en utilisant des fragments génomiques codant pour la TDP-43 humain, de type sauvage ou mutant, associés aux cas familiaux de la SLA. Ces souris développent de nombreux changements liés au processus pathologique et biochimique de la SLA chez l’homme : présence d’inclusions de la protéine TDP-43 ubiquitinylées, anomalies au niveau des filaments intermédiaires, axonopathie et neuroinflammation. Pour mieux comprendre le rôle de la protéine TDP-43 dans la régénération des axones, nous avons utilisé des souris pré-symptomatiques et effectué une lésion du nerf sciatique sur celles-ci. Suite à cette intervention, les souris transgéniques ont eu une paralysie marquée du membre lésé, ont démontré une redistribution altéré de TDP-43 et une regénération plus lente des axones distaux par rapport aux souris non transgéniques. De plus, nous avons constaté que la protéine TDP-43 interagit et colocalise avec la sous-unité p65 du facteur nucléaire κΒ (NF-κΒ). Cette interaction se produit dans les cellules gliales et les neurones des souris transgéniques TDP-43 et aussi chez les patients atteints de la SLA. Nous avons démontré que les niveaux d’ARNm des protéines TDP-43 et NF-κΒ p65, sont plus élevés dans la moelle épinière des patients atteints de SLA que chez les individus sains et que la protéine TDP-43 agit comme un coactivateur de p65. Finalement, le traitement des souris transgéniques TDP-43 avec la Withaférine A, un inhibiteur de l’activité NF-κΒ, réduit le niveau de dénervation des jonctions neuromusculaires et des symptômes liés à la SLA. Nous suggérons donc que le dérèglement de la protéine TDP-43 contribue à la pathogenèse de la SLA en partie par l'augmentation de l'activation de NF-κΒ, et que NF-κΒ pourrait constituer une cible thérapeutique pour la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a lethal disease characterized by degeneration of lower and upper motor neurons. Transactive response DNA-binding protein 43 (TDP-43) ubiquitinated inclusions are a hallmark of ALS. In order to understand the pathogenic mechanism caused by TDP-43, we generated transgenic mice with genomic fragments encoding human TDP-43 wild-type or FALS-linked mutants TDP-43G348C and TDP-43A315T. These novel TDP-43 transgenic mice develop many age-related pathological and biochemical changes reminiscent of human ALS including ubiquitinated TDP-43 positive inclusions, intermediate filament abnormalities, axonopathy and neuroinflammation. In order to understand the role of TDP-43 in axon regeneration, we used pre-symptomatic 3-months old mice and performed sciatic nerve crush on them. After axonal crush, TDP-43 transgenic mice were noticeably paralyzed at the injured limb, have altered TDP-43 redistribution and the distal axons regenerated slowly as compared to non-transgenic mice. Moreover, we found that TDP-43 interacts with and colocalizes with p65, a NF-κΒ subunit, in glial and neuronal cells from TDP-43 transgenic mice and also from ALS patients. We report that TDP-43 and NF-κΒ p65 mRNA and protein expression is higher in spinal cords of ALS patients than healthy individuals. TDP-43 acted as a co-activator of p65, and glial cells expressing higher amounts of TDP-43 produced more proinflammatory cytokines and neurotoxic mediators after stimulation with lipopolysaccharide or reactive oxygen species. TDP-43 overexpression in neurons also increased their vulnerability to toxic mediators. Treatment of TDP-43 mice with Withaferin A, an inhibitor of NF-κΒ activity, reduced denervation in the neuromuscular junction and ALS disease symptoms. We propose that TDP-43 deregulation contributes to ALS pathogenesis in part by enhancing NF-κΒ activation, and that NF-κΒ may constitute a therapeutic target for the disease.

Proefschrift--Universiteit Leiden, 2003. / Bibliogr. en fin de chap.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 15 août 2006). Publié aussi en version papier.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Des études cliniques ont montré que l'hypoxie corrèle avec un mauvais pronostic dans plusieurs types de tumeurs solides. L'hypoxie active plusieurs gènes impliqués dans l'angiogenèse qui contribue à nourrir la tumeur et, dans certains cas, déclenche le processus métastasique. MTF-1 est un facteur de transcription qui est activé par plusieurs facteurs de stress dont fait partie l'hypoxie. MTF-1 a surtout été étudié pour son activation en réponse aux métaux parce qu' il a été découvert pour son rôle essentiel dans l'activation des gènes des Métallothionéines (MT) en réponse aux ions de métaux de transition. Le modèle d'activation de MTF-1 en réponse aux métaux est le suivant: MTF-1 est une protéine à doigts de zinc qui se lie à l'ADN. MTF-1 subit ensuite des événements de phosphorylation qui lui permettent d' activer la transcription des gènes des MT. Quant à l'activation de MTF-1 en réponse à l 'hypoxie, aucun mécanisme n'est connu. Il faut donc se référer à un mécanisme connu d'activation d'un autre facteur de transcription activé par l'hypoxie, RIF-1. L' activation de RIF -1 par l 'hypoxie passe par un mécanisme de dégradation/stabilisation impliquant les hydroxylases. Nous avons d'abord confirmé -que les MT sont induites en hypoxie et que cette induction passe par MTF-1 et les séquences MRE. Nous avons montré que MTF-1 n'est pas stabilisé en hypoxie, donc que les mécanismes d'activation de MTF-1 diffèrent de ceux activant RIF -1 u. Cependant, nous avons montré que les hydroxylases sont impliquées dans l'activation de MTF-1 en hypoxie, de même que le stress oxydant. En se référant au modèlè d'activation de MTF-1 en réponse aux métaux, nous avons aussi montré que des événements de phosphorylation impliquant les kinases JNK, PI3K et PKC sont cruciaux pour l'activation de MTF-1 par l'hypoxie. Finalement, nous avons montré que MTF-1 et RIF-1α entretiennent une relation de coopération pour l'induction de leur activité transcriptionnelle en réponse à l 'hypoxie. Compte tenu des nombreux rôles tenus par MTF-1, une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant son activation permettra ultimement de développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre l'angiogenèse et la progression tumorale. / [MTF-1 : Facteur de transcription de la régulation par les métaux = Metal-regulatory transcription factor-1].

Les bases moléculaires de l’initiation et de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) sont pauvrement comprises. Un élément pathogénique clé dans le cancer est l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs, fréquemment due à l’hyperméthylation de leur région promotrice. Dans ce contexte, nous avons utilisé une approche épigénomique pour trouver des gènes hyperméthylés dans le COE. Nous avons employé un agent déméthylant, 5-aza-dC, pour réactiver les gènes hyperméthylés dans quatre lignées cellulaires du COE (SKOV3, OVCAR3, TOV112 et TOV21). Nous avons trouvé plusieurs cibles potentielles d’hyperméthylation qui pourraient jouer un rôle fonctionnel dans la suppression tumorale, l’apoptose ou la réparation de l’ADN. Nous avons évalué leur statut de méthylation par MSP (methylation-specific PCR) et BSP (bisulfite-sequencing PCR) avec des échantillons normaux et tumoraux et deux lignées cellulaires du COE. Parmi ces cibles, le gène DOK1 a démontré une évidence de méthylation de la région promotrice des échantillons tumoraux comparativement à celle de ceux qui sont normaux. Des clones surexprimant et d’autres sous-exprimant DOK1 ont été construits et validés. Son rôle potentiel dans la prolifération cellulaire, dans la sensibilité au taxol et au cisplatin, et dans le cycle cellulaire a été évalué par des études fonctionnelles et une légère implication a été détectée dans ces fonctions. Les changements d’expressions globales reliés à l’expression de ce gène ont également été analysés par la technologie de micropuces de l’ADN. Nos données montrent que DOK1 est touché par une hyperméthylation de sa région promotrice potentielle dans les tumeurs du COE. Par contre, cette hyperméthylation ne semble pas influencer son niveau d'expression. Au contraire, son expression augmente dans le cancer ovarien. Cette augmentation serait reliée à une diminution des risques de progression du COE. Cette observation confirme le rôle potentiel de suppresseur de tumeur de DOK1 dans le COE. / The molecular basis of the epithelial ovarian cancer (EOC) initiation and progression are still poorly understood. A key pathogenic element in cancer is the inactivation of tumours suppressor genes, frequently due to the hypermethylation of their promoter sequence. In this context, we used an epigenomic approach to identify hypermethylated genes in the EOC. We used the demethylating agent, 5-aza-dC, to reactivate hypermethylated genes in four cells lines of EOC (SKOV3, OVCAR3, TOV112 and TOV21). We identified several targets genes potentially hypermethylated that could play a functional role in ovarian tumorigenesis suppression, apoptosis or DNA repair. We evaluated their methylation status by MSP (methylation-specific PCR) and BSP (bisulfite-sequencing PCR) within normal and tumoral ovarian samples and in two EOC cells lines. Among these targets, the DOK1 gene showed an evidence of methylation of the promoter region in the tumour samples compared to the normal ones. Clones over-expressing and others under-expressing DOK1 were built and validated. The potential role of this gene in cellular proliferation, sensitivity to taxol and cisplatin, and in the cell cycle was evaluated by functional studies and a little implication of the DOK1 gene was detected in these functions. The global expression changes connected to the expression of the DOK1 gene were also analyzed by the microarray genomics technology. Our data show that DOK1 is affected by hypermethylation of its potential promoter region in EOC tumors. This hypermethylation do seems not to influence its expression levels. On the contrary, its expression level increases in ovarian cancer. This increase would be connected to a reduction in the risks of progression of the COE. Moreover, this observation confirms the potential role of DOK1 as tumor suppressor in EOC.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη. / Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.