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Stratégies de limitation du portage sain des Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC) par les bovins. Potentiel bio-protecteur des bactéries lactiques en alimentation animale / Limitation of Shiga-toxin producing Escherichia coli (STEC) asymptomatic carriage by cattle, bio-protective potential of Lactic Acid Bacteria in cattle feed

Duniere, Lysiane 14 February 2012 (has links)
Les Escherichia coli producteurs de Shiga-Toxines (STEC) sont responsables de maladies humaines sévères. Les ruminants sont considérés comme étant leur principal réservoir. La dissémination des STEC au sein des élevages est liée en partie à l’alimentation des animaux et donc potentiellement à l’ingestion d’ensilages contaminés. Les bactéries lactiques peuvent être employées comme agents technologiques ou dans des stratégies de bio-protection. Sur le plan de l’ensilage, elles jouent un rôle de préservation mais peuvent également représenter une barrière à la survie de pathogènes comme les STEC. Ce travail a permis de sélectionner des bactéries lactiques inhibitrices de la croissance de divers sérogroupes de STEC. Les études de compétitions ont mis en évidence un phénomène bactéricide sur certaines souches, dont le mécanisme reste encore non élucidé. Le potentiel inhibiteur des bactéries lactiques sélectionnées a été testé indépendamment dans des ensilages de maïs contaminés à différentes étapes de leur réalisation : à la mise en silos, à l’ouverture ou après une période d’exposition aérobie. En cas de contamination à la mise en silos, les souches de STEC testées n’ont pas survécu dans des ensilages correctement menés. Une souche de Ln. mesenteroides a permis de limiter la survie des souches de STEC dans les ensilages contaminés à l’ouverture. Cependant, après 144h d’aération, aucun additif n’a montré d’effet protecteur avéré. Le contrôle de l’alimentation animale afin de limiter l’entrée des STEC dans le cycle épidémiologique pourrait donc passer par l’emploi de bactéries lactiques ; sans négliger cependant les Bonnes Pratiques nécessaires à la réalisation de l’ensilage. / Shiga-toxin producing Escherichia coli (STEC) are responsible for severe human diseases. Cattle are considered as the main reservoir of this pathogen. STEC dissemination in farm environment is linked to cattle feed and potentially to ingestion of contaminated silage. Lactic Acid Bacteria (LAB) could be employed as starters in fermentations or in strategies of bioprotection. In silage, LAB play a preservative role and could also represent a barrier for the survival of pathogenic bacteria such as STEC. The selection of LAB strains, able to inhibit the growth of several serogroups of STEC strains, was performed in this study. Competitions assays have shown a bactericidal effect on some STEC strains, but reasons of this phenomenon remain unclear. Inhibiting potential of the selected LAB strains was tested independently in corn silages contaminated at different steps of their realizations : at ensiling, at opening or after aerobic exposure. In case of contamination at ensiling, STEC strains tested did not survive in well-made silages. A Ln. mesenteroides strain allowed the limitation of the STEC strains survival in silage contaminated at opening. However, after 144 h of aerobic exposure, no inoculant showed any protective effect. Control of cattle feed, in order to limit STEC entry in their epidemiological cycle, could be reached through LAB utilization ; however, Good Manufacturing Practices involved in silage making should not be omitted.
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Identification de nouvelles souches probiotiques à propriétés immuno-modulatrices et anti-oxydantes / Identification of novel probiotic strains with immunomodulatory and antioxidative properties

Larguèche, Noura 30 March 2012 (has links)
Depuis quelques années, les probiotiques sont devenus un front de science très actif. La majorité des bactéries probiotiques actuellement sur le marché sont des bactéries lactiques. L’identification de nouvelles souches bactériennes aux propriétés probiotiques est l’objectif principal de ces travaux de thèse, et s’inscrivent dans le cadre du projet Probiotique en partenariat avec deux groupes industriels et le pôle de compétitivité VITAGORA. / In recent years, probiotics market is boosting. Most probiotic bacteria on the market today are lactic acid bacteria. The identification of novel bacterial strains with probiotic properties is the main objective of this thesis, which is part of the Probiotic project in partnership with two industry groups and the network innovation VITAGORA.
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Isolement et caractérisation de bactéries lactiques de produits laitiers brésiliens en vue de leur utilisation potentielle en biopréservation ou pour l\'amélioration de la digestibilité des protéines du lactosérum / Isolamento de bactérias láticas de leite e queijo com potencial para bioconservação de alimentos e utilização no aumento da digestibilidade de proteínas do lactosoro

Tulini, Fabricio Luiz 17 October 2014 (has links)
Les bactéries lactiques (BAL) ont été utilisées par l\'humanité depuis des siècles en raison de leurs propriétés technologiques et de leur capacité à améliorer les propriétés organoleptiques des aliments. En outre, la demande des consommateurs pour des produits laitiers sains et dépourvus de conservateurs chimiques est de plus en plus grande.Dans ce contexte, l\'utilisation de bactéries lactiques utilisées depuis des siècles pour la fermentation des produits laitiers semble pertinente pour améliorer la digestibilité et/ou prolonger la durée de vie des produits laitiers fermentés. L\'une des principales propriétés de ces bactéries est la production de substances antimicrobiennes telles que des bactériocines, des peptides ou des composés non protéiques de faible poids moléculaire (acides organiques, H2O2, et ainsi de suite) qui inhibent la croissance des pathogènes alimentaires et des micro-organismes d\'altération. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens ribosomiques produits entre autre par certaines bactéries lactiques et qui possèdent un spectre d\'inhibition étroit ciblant généralement les bactéries à Gram-positif. Les substances inhibitrices produites par BAL peuvent également inhiber les champignons qui sont en grande partie responsables pour la détérioration des aliments. Un autre propriété importante de BAL est de modifier les protéines du lait au cours du processus de fermentation. Ceci est important pour les personnes allergiques, en raison de la modification du potentiel allergénique de protéines du lait, mais également important pour la production de peptides bioactifs. Récentes découvertes ont montré que des peptides dérivés de l\'hydrolyse des protéines du lait peuvent avoir des activités biologiques, tels que des activités antihypertensives, antioxydantes, antimicrobiennes et immunomodulatrices. En résumé, les BAL sont des outils potentiels pour la production d\'aliments de haute qualité, ce qui stimule la recherche de nouvelles souches ayant des propriétés biologiques intéressantes. Ainsi, l\'objectif de cette étude était d\'isoler et de cribler de nouvelles souches de BAL possédant des activités antimicrobienne et / où protéolytique. Des souches de BAL ont ainsi été isolées de lait de vache, de buffle et de chèvre ainsi que des fromages provenant du sud-est du Brésil. À partir de 156 échantillons de lait et de fromages, 815 isolats ont été obtenus sur des géloses sélectives pour les BAL. La majorité d\'entre elles était des coques ou des bacilles à Gram-positif et négatif pour la production de catalase. La présence d\'activités antimicrobiennes a été évaluée sur des cultures pures de ces nouveaux isolats par des tests d\'antagonisme sur géloses (essai spot-on-the-lawn), et leurs activités protéolytiques on été évaluées par culture sur géloses BHI (Brian Heart Infusion) additionnée de lait écrémé. Les isolats les plus protéolytiques ont été testés par culture dans du lait écrémé suivie d\'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Parmi les 815 isolats testés, quatre d\'entre eux, identifiés comme Lactobacillus paraplantarum FT 259 et Streptococcus uberis (FT86, FT126 et FT190) étaient producteurs de bactériocines, tandis que quatre autres, identifiés comme Weissella confusa FT424, Weissella hellenica FT476, Leuconostocs citreum FT671 et Lactobacillus plantarum FT723 ont montré une activité antifongique lors d\'essais préliminaires. Des analyses complémentaires ont montré que la souche la plus antifongique était L. plantarum FT723 qui inhibait Penicillium expansum sur gélose MRS modifiée (de Man, Rogosa, Sharpe, sans acétate) et dans un modèle de lait fermenté. Des activités protéolytiques ont été détectées dans 205 isolats lors des tests sur géloses supplémentées en lait écrémé. Les activités protéolytiques des 123 isolats présentant les activités les plus fortes ont été confirmées en faisant migrer les surnageants de laits fermentés sur SDS-PAGE. Les capacités protéolytiques des trois isolats les plus protéolytiques Enterococcus faecalis (FT132 et FT522) et Lactobacillus paracasei FT700 ont également été testées sur des caséines et sur deux protéines du lactosérum (?-lactoglobuline et d\'?-lactalbumine), les produits de dégradation ont été visualisés par SDS-PAGE. En raison de la grande similitude entre les deux souches d\'Enterococcus, seul E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont été sélectionnés pour des études plus poussées sur leurs activités protéolytiques en utilisant des protéines du lait comme substrats lors d\'incubations dans différentes conditions suivies de l\'analyse des produits d\'hydrolyse par SDSPAGE et par chromatographie liquide haute performance (high performance liquid chromatography, HPLC). Tant E. faecalis FT132 que L. paracasei FT700 ont montré des activités protéolytiques à un pH de 6,5, à des températures comprises entre 37 à 42 ºC. Leurs activités protéolytiques étaient dues à des métallo-protéases. Pour évaluer les activités biologiques possibles des peptides dérivés de l\'action d\'E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 sur les protéines du lait, les surnageants des laits fermentés par ces souches ont été purifiés sur colonnes C8 puis lyophilisés. Ces lyophilisats ont ensuite été repris dans du RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) et ajoutés à différentes cultures primaires (monocytes et macrophages) pour évaluer leur cytotoxicité, les mécanismes de la mort celullaire qui y étaient associés, ainsi que leurs propriétés immunomodulatrices (différenciation des monocytes en macrophages et quantification de TNF-?). Les peptides générés par les deux souches testées étaient toxiques (favorisant l\'apoptose des cellules) après 72 h d\'exposition à une concentration de 10 mg/mL. Au-dessous de ces concentrations cytotoxiques, les deux surnageants de laits fermentés produits par E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont stimulé la différenciation des monocytes en macrophages, comme observé par l\'expression accrue du marqueur CD71. Cette stimulation du système immunitaire n\'était pas inflammatoire en raison de la faible production de TNF-?. Certaines BAL peuvent contribuer à la santé des consommateurs et sont utilisées comme probiotiques. Cependant, les effets biologiques des souches ainsi que leur innocuité doivent être vérifiés avant leur utilisation comme probiotiques. Contrairement aux entérocoques, plusieurs espèces de lactobacilles sont reconnues comme GRAS (Generally Recognized as Safe). Dans cette étude, il a été montré que la souche E. faecalis FT132 hébergeait trois gènes de virulence asa1, as et gelE, et qu\'elle était résistante à l\'érythromycine et à la tétracycline, ce qui signifie que cette souche ne peut pas être ajoutée à des produits alimentaires. Cependant, L. paracasei FT700 pourrait d\'avéré un candidat potentiel pour être utilisée en tant que probiotique, ainsi que L. paraplantarum FT259, la souche bacteriocinogénique décrite précédemment. Afin d\'évaluer leur capacité de survie dans le tractus digestif en vu d\'une éventuelle utilisation comme probiotiques, les souches ont été incubées dans des milieux de culture acidifiés (pH 2,0, 2,5 et 3,5), dans des sels biliaires, dans des conditions simulant les conditions gastriques et leur capacité de survie a été testée ainsi que leur sensibilité à différents antibiotiques. En outre, la bactériocine produite par L. paraplantarum FT259 a été partiellement purifiée sur colonne remplie de résine XAD-16, suivie d\'une extraction en phase solide sur colonne C18, suivie d\'une analyse par SDS-PAGE. Des PCR avec différentes amorces ciblant la plantaricine NC8, la plantaricine S et la plantaricine W ont été effectuées suivie du séquençage des amplicons afin d\'idéntifier des gènes pour la production de bactériocines. Les résultats ont montré que L. paraplantarum FT259 tolérait des expositions à un pH de 3,5, et à une concentration en sels biliaires de 0,3% pendant une durée maximum de 180 minutes. En revanche, il n\'était plus possible de détecter de cellules viables (limite de détection de la méthode : 100 UFC / mL) après une exposition à des pH de 2,0 et de 2,5 pendant 90 minutes. Lors des expériences simulant les conditions gastriques, le nombre de cellules viables de L. paraplantarum FT259 a diminué de 8,6 log UFC/mL à 4,4 log UFC/mL après 180 minutes d\'incubation. Les résultats obtenus pour la souche L. paracasei FT700 ont montré que celle-ci a survécut à presque toutes les conditions. Après 180 minutes dans un pH de 2,0 et dans le jus gastrique simulé, la population bactériennes ont respectivement diminué de 4 et de 3 log UFC/mL. Il a également été démontré que L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700 étaient sensibles à la majorité des antibiotiques testés. L\'analyse par SDS-PAGE a indiqué que la bactériocine partiellement purifiée présentait une masse moléculaire d\'environ 3900 Da et que le séquençage des amplicons d\'ADN suite aux PCR a montré que la souche possédait le gène de la plantaricine NC8. L\'ensemble de ces résultats indique que les deux souches de lactobacilles isolées lors de cette étude (L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700) possèdent des caractéristiques pouvant leur conférer un intérêt d\'utilisation en tant queprobiotiques. La production de bactériocines (L. paraplantarum FT259), et l\'activité protéolytique (L. paracasei FT700) pourraient également être des caractéristiques intéressantes pour des applications alimentaires. En conclusion, les BAL obtenues dans cette étude pourraient être utiles dans l\'industrie alimentaire pour la production de nouveaux produits laitiers à durée de conservation prolongée et une digestibilité accrue, ou encore pour la production de peptides bioactifs. / As bactérias láticas (BAL) têm sido utilizadas pela humanidade há séculos devido às suas propriedades tecnológicas e potencial para conferir características sensoriais agradáveis aos alimentos. Além disso, é cada vez maior a demanda por alimentos de qualidade. Neste contexto, BAL tem grande potencial para serem utilizadas na produção de alimentos. Uma das principais características destas bactérias é a produção de substâncias que inibem a multiplicação de agentes patogênicos e micro-organismos deteriorantes em alimentos, tais como ácidos orgânicos, H2O2 e bacteriocinas. Estas últimas são um peptídeos antimicrobianos produzido via ribossomo por algumas bactérias e possuem pequeno espectro inibição. As bacteriocinas podem reduzir a multiplicação de bactérias-alvo, aumentando a segurança alimentar e a vida de prateleira de alimentos. Essas substâncias inibitórias produzidas por BAL podem também inibir fungos, que são em grande parte responsáveis pela deterioração dos alimentos. Outra importante propriedade das BAL é capacidade de modificar as proteínas do leite durante o processo de fermentação. Isto é importante para indivíduos alérgicos devido à alteração de potencial alergênico das proteínas do leite, e também é importante para a produção de peptídeos bioativos. Recentemente, resultados demonstraram que os peptídeos obtidos a partir da hidrólise de proteínas do leite podem ter diferentes atividades biológicas, tais como anti-hipertensiva, antioxidante, antimicrobiana e imunomodulatória. Em resumo, BAL apresentam potencial para a produção de alimentos de alta qualidade, o que estimula a busca de novas linhagens com propriedades tecnológicas de interesse. Assim, no presente estudo, BAL com atividade antimicrobiana e / ou proteolítica foram isoladas de leite e queijo de vaca, búfala e cabra, obtidos na região sudeste do Brasil. A partir de 156 amostras de leite e queijo, foram obtidos 815 isolados em ágar seletivo para BAL. A maioria eram cocos ou bacilos Gram-positivos, e não produziam a enzima catalase. Culturas puras destes novos isolados foram avaliadas quanto a atividade antimicrobiana por testes de antagonismo em ágar (spot-on-the-lawn), e quanto a atividade proteolítica sobre proteínas do leite pelo cultivo em placas de ágar BHI (Brain Heart Infusion suplementado com leite desnatado). Os isolados com maior atividade proteolítica também foram testados pelo cultivo em leite desnatado seguido de análise do leite fermentado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Entre os 815 isolados testados, quatro deles foram identificados como produtores de bacteriocinas, Lactobacillus paraplantarum FT259 (uma linhagem) e Streptococcus uberis (três linhagens, FT86, FT126 e FT190), enquanto quatro outros identificados como Weissella confusa FT424, W. hellenica FT476, Leuconostoc citreum FT671 e Lactobacillus plantarum FT723, os quais apresentaram atividade antifúngica em ensaios preliminares. Análises complementares mostraram que a linhagem com maior atividade antifúngica foi L. plantarum FT723, o qual inibiu Penicillium expansum em ágar MRS modificado (De Man, Rogosa, Sharpe, sem acetato) e em iv modelo de leite fermentado. No entanto, nenhuma inibição foi observada contra Yarrowia lipolytica. A atividade proteolítica foi detectada em 205 isolados por testes em ágar, sendo que 123 isolados com intensa atividade proteolítica foram submetidos a confirmação da atividade por SDS-PAGE. As atividades proteolíticas de três isolados identificados como Enterococcus faecalis (FT132 e FT522) e Lactobacillus paracasei FT700 foram confirmadas por SDS-PAGE, como visualizado pela digestão de caseínas e proteínas de soro de leite (?-lactoglobulina e ?- lactalbumina). No entanto, devido à alta semelhança entre as linhagens, apenas E. faecalis FT132 (juntamente com L. paracasei FT700) foram selecionados para os próximos estudos utilizando proteínas do leite como substratos em diferentes condições, seguidas de análises por SDS-PAGE e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high-performance liquid chromatography). Ambos E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 apresentaram atividades proteolíticas em pH 6,5, entre 37 e 42 °C. A atividade proteolítica das linhagens foi devida à presença de metaloproteases. Em seguida, para avaliar as possíveis atividades biológicas dos peptídeos derivados da atividade proteolítica de E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 em proteínas do leite, o sobrenadante de leite fermentado produzido por estas linhagens foi purificado em cartucho C8 e liofilizado. Desse modo, os sobrenadantes de leite fermentado produzidos por estas linhagens foram adicionados às culturas de células (monócitos e macrófagos) para avaliar a sua citotoxicidade, os mecanismos de morte celular, propriedades imunomoduladoras (diferenciação de monócitos em macrófagos) e quantificação de TNF-? (do inglês tumor necrosis factor). Os sobrenadantes apresentaram toxicidade após 72 h de exposição a 10 mg/mL por apoptose. Abaixo das concentrações citotóxicas, ambos os sobrenadantes de leite fermentado estimularam a diferenciação de monócitos em macrófagos, como observado pelo aumento da expressão do marcador CD71. Esta estimulação imune não foi inflamatória visto que houve pouca produção de TNF-?. BAL também podem contribuir para a saúde dos consumidores quando utilizadas como probióticos. No entanto, algumas características das linhagens devem ser verificadas antes de serem utilizadas como probióticos, especialmente com relação aos fatores de virulência. Lactobacilos geralmente possuem um status GRAS (do inglês generally recognized as safe), ao contrário dos enterococos. Neste estudo, foi demonstrado que E. faecalis FT132 possuía três genes de virulência, asa1, ace e gelE, e que era resistente à eritromicina e à tetraciclina, indicando que esta linhagem não pode ser adicionada em alimentos. No entanto, L. paracasei FT700 seria um potencial candidato para ser utilizada como probiótico, bem como a linhagem bacteriocinogênica descrita anteriormente, L. paraplantarum FT259. As linhagens foram testadas quanto à sobrevivência em meio ácido (pH 2,0, 2,5 e 3,5), tolerância in vitro aos sais biliares, viabilidade em suco gástrico sintético e sensibilidade a antibióticos. Além disso, o peptídeo antimicrobiano produzido por L. paraplantarum FT259 foi parcialmente purificado em coluna preenchida com resina XAD-16, seguido de extração em fase sólida com cartucho de C18, e analisados por SDSPAGE. Reações em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) com primers para os genes estruturais da plantaricina NC8, plantaricina S e plantaricina W, seguidas de sequenciamento de DNA, foram realizados para detectar genes responsáveis pela produção de bacteriocinas. Os resultados mostraram que L. paraplantarum FT259 foi resistente ao pH 3,5 e a 0,3% de sais biliares por até 180 minutos, mas a população bacteriana em pH 2,0 e 2,5 após 90 minutos estava abaixo do limite de detecção do método (2 log UFC/mL). Em testes utilizando suco gástrico sintético, a população de L. paraplantarum FT259 reduziu de 8,6 log UFC/ v mL para 4,4 log UFC/mL após 180 minutos. Por outro lado, L. paracasei FT700 sobreviveu bem em quase todas as condições. Depois de 180 minutos em pH 2,0 e em suco gástrico sintético, a população bacteriana reduziu 4 e 3 log UFC/mL, respectivamente. Também foi demonstrado que L. paraplantarum FT259 e L. paracasei FT700 foram sensíveis à maioria dos antibióticos testados. A análise de SDS-PAGE indicou que a bacteriocina parcialmente purificada apresentava uma massa molecular de aproximadamente 3900 Da, e o sequenciamento de DNA do produto de amplificação obtido por PCR mostrou a presença do gene que codifica a produção da plantaricina NC8. De modo geral, os resultados indicaram que ambas as linhagens possuem potencial probiótico. Além disso, a produção de bacteriocinas (L. paraplantarum FT259) e a atividade proteolítica (L. paracasei FT700) podem ser características interessantes para aplicações em alimentos. As BAL obtidas neste estudo podem ser úteis na indústria de alimentos para a produção de novos produtos lácteos com maior vida de prateleira e aumento da digestibilidade de proteínas do leite, assim como para a produção de peptídeos bioativos comercializados como fórmulas parcialmente purificadas.
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Analyse de la séquence génomique et Etude de l'adaptation à l'acidité de L. delbrueckii ssp. bulgaricus ATCC11842

Penaud, Stéphanie 07 1900 (has links) (PDF)
Le travail décrit dans cette thèse a commencé à un moment où peu de données génétiques sur Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (L. bulgaricus) étaient disponibles. Le séquençage du génome de la souche ATCC 11842, en collaboration avec le Génoscope, était en cours. La première partie de cette thèse décrit le travail effectué sur l'annotation et l'analyse du génome. Cette dernière suggère que L. bulgaricus est en voie de spécialisation à une niche écologique restreinte, le milieu lait. Elle révèle également que L. bulgaricus possède peu de systèmes de régulation et de résistance aux stress environnementaux. Ces résultats nous ont conduit à faire l'hypothèse que L. bulgaricus serait un bon modèle pour identifier les mécanismes essentiels pour l'adaptation à l'acidité (ATR). La deuxième partie de la thèse décrit les études menées sur l'ATR de L. bulgaricus par différentes approches complémentaires. Les résultats transcriptomiques mettent en évidence que l'expression de 20% des régulateurs ainsi que celle de 50% des transporteurs d'ions de L. bulgaricus est modifiée par l'ATR. En revanche, aucun des 5 facteurs s ni des 5 systèmes à deux composants du génome ne présente une expression variable. L'analyse protéomique par électrophorèse bidimensionnelle révèle 19 protéines dont l'abondance est affectée par l'ATR, parmi lesquelles les protéines chaperons et des protéines impliquées dans la biosynthèse des acides gras. L'ensemble des résultats suggère que l'ATR de L. bulgaricus fait intervenir de multiples régulateurs, des phénomènes d'atténuation de la transcription, et des régulations posttranscriptionnelles et post-traductionnelles. Ces résultats préliminaires nécessitent cependant des analyses complémentaires pour déterminer quelle partie des réponses visualisées est réellement à la base de la résistance accrue à l'acidité acquise après adaptation.
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Identification de bactéries lactiques isolées de l'écosystème mammaire bovin et caractérisation de leur potentiel inhibiteur contre des pathogènes associés à la mammite / Identification of lactic acid bacteria isolated from bovine udder ecosystem and its characterisation as potential inhibitors against mastitis-associated pathogens / Identificaçao de bacterias laticas isoladas do ecossistema mamario bovino e caracterizacao de seu potencial inibidor contra patogenos associados à mastite

Seridan de Assis, Bianca 12 March 2015 (has links)
Les mammites ont un impact économique considérable dans les régions productrices de lait de divers pays, dont le Brésil et la France. Elles constituent la première cause de consommation d’antibiotiques dans les élevages laitiers qui doivent répondre à une forte demande sociétale pour une agriculture consommant moins d’intrants et plus respectueuse de l’environnement et du bien-être animal. Il y a donc une réelle nécessité de trouver des outils alternatifs efficaces pour le contrôle des mammites bovines infectieuses. Ce travail de thèse a eu comme objectif la recherche de souches de bactéries lactiques (BL) ayant des capacités inhibitrices de l'infection mammaire, pouvant être utilisées comme probiotiques mammaires. Pour cela, 278 (165 en France et 113 au Brésil) souches bactériennes ont été isolées à partir de lait et de la superficie et du canal du trayon de vaches laitières et 10 souches non-redondantes de BL ont été identifiées et caractérisées en fonction de leurs propriétés deparoi et de production de composés inhibiteurs avant d'évaluer leurs interactions avec des agents pathogènes responsables de mammites et/ou avec les cellules hôtes dans un modèle de cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb). Deux souches de Lactobacillus brevis et une de Lactobacillus plantarum ont montré une bonne capacité d’adhésion aux cellules épithéliales ce qui pourrait inhiber l'invasion par Staphylococcus aureus, un pathogène majeur responsable de mammites, et de stimuler la production de cytokines pro- et anti-inflammatoires par les CEMb. D'autres tests d'interaction avec des lign / Mastitis causes huge economic losses in the dairy sector both in Brazil and France. They also are the first cause of antibiotic consumption in the dairy farms. There is thus a need for new alternatives to antibiotics to control infectious mastitis. In this thesis work, we isolated 278 (165 in France and 113 in Brazil) bacterial strains from bovine milk and teat canal, and identified 10 non-redundant lactic acid bacteria (LAB) strains that were further tested as potential mammary probiotic candidates. LAB strains were tested for their surface properties and production of inhibitory compounds and then evaluated for their interactions with Staphylococcus aureus and Escherichia coli, two major mastitis pathogens, or with bovine mammary epithelial cells (bMEC), in vitro. Some LAB strains (Lactobacillus brevis e Lactobacillus plantarum) presented inhibitory capacity against S. aureus adhesion and internalisation and were shown to stimulate the production of pro- and anti-inflammatory cytokinin bMEC. Other interaction tests with bMEC showed that Lactococcus lactis V7 was able to significantly inhibit bMEC invasion by Escherichia coli and S. aureus. Although the inhibitory mechanism was not elucidated, Lactococcus lactis V7 showed promising capacities in terms of mammary probiotic potential with, notably, the ability to modulate the immune response of E. coli-infected bMEC by modifying the expression of inflammatory cytokine genes. In this work, several LAB strains were identified in the milk and teat canal microbiota. We showed that L. brevis, L. plantarum and Lactococcus lactis
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Etude de la modulation de voies métaboliques par une sélection de bactéries lactiques et bifidobactéries dans la cellule épithéliale intestinale humaine : détermination des effets physiologiques induits par la bactérie Lactobacillus rhamnosus CNCMI - 4317 dans un modèle murin axénique / Lactic acid bacteria and bifidobacteria modulation of metabolic pathways in human intestinal epithelial cells : Assessment of Lactobacillus rhamnosus CNCMI-4317 physiological effects in axenic mice model

Jacouton, Elsa 02 July 2014 (has links)
Au cours des dix dernières années, il a été observé une augmentation des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2…) avec des conséquences dramatiques en santé humaine. Un intérêt scientifique a émergé pour mieux comprendre comment les bactéries lactiques (BLs) régulent la l’équilibre énergétique de leur hôte. PPAR- (peroxisome proliferator activated receptor ), un récepteur nucléaire, et FIAF (fasting – induced adipose factor) une adipokine apparaissent comme deux régulateurs centraux dans l’homéostasie énergétique. Dans cette étude, nous avons examiné les mécanismes de régulation de Fiaf par les BLs. Nous avons identifié une souche L.rhamnosus CNCMI–4317 induisant l’expression de Fiaf dans la cellule épithéliale intestinale. Nous avons déterminé que cet effet était probablement du à une protéine de surface agissant de façon indépendante de PPAR-. Nous avons confirmé cet effet dans un model in vivo. De plus, nous avons réalisé une transcription du génome complet des cellules HT-29 en contact avec la bactérie confirmant une régulation de Fiaf et suggérant une régulation supplémentaire dans le métabolisme des lipides.Nous avons caractérisé un model HT-29 PPAR- rapporteur à la luciférase. Nous avons appliqué une approche de métagénomique fonctionnelle développée au sein de l’équipe pour cribler des banques génomiques de bactéries lactiques (BLs). Nous n’avons pas réussi à identifier des clones d’intérêt parmi les banques testées. Nous avons également développé une méthode de criblage des BLs sur le modèle HT-29 PPAR-mais après avoir caractériser l'effet bactérien, nous n’avons pas pu confirmer celui-ci par une approche classique de RT-qPCR. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’effet observé était un effet direct sur le signal luciférase.Ce travail contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation du métabolisme de l’hôte par les bactéries. / Over the last decades, an increase of metabolic diseases (obesity, type-2 diabetes…) has been observed with dramatic consequences on human health. Scientific interest has extended for a better understanding of lactic acid bacteria (LAB) regulation of host energy balance. PPAR- (peroxisome proliferator activated receptor ), a nuclear receptor, and FIAF (fasting – induced adipose factor), a secreted adipokine, appear as two major regulators of energy homeostasis.In this study we examined the mechanisms of Fiaf regulation by LAB. We identified a lactobacillus rhamnosus (L.rhamnosus) CNCMI-4317 strain up-regulating Fiaf expression in intestinal epithelial cells (HT-29). We determined that the effect was probably due to a surface exposed protein acting in a PPAR- independent manner. We confirmed this regulation in an in vivo model. Furthermore, we performed a whole genome transcription (of HT-29 in contact with bacteria) confirming the Fiaf regulation and suggesting an additional lipids metabolism regulation. We characterized a HT-29 PPAR- luciferase reporter model. We applied functional metagenomic approach developed inside the team to screen bacteria genomic libraries. We failed to identify clones of interest among tested libraries. We also performed a screening of LABs on PPAR- luciferase reporter model but after characterization of bacterial effect we failed to confirm it using another approach based on RT-qPCR and speculated that it was a direct effect on luciferase activity. This work contributed to a better knowledge of host metabolism regulation by bacteria.
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Effet de barrière des populations microbiennes des laits crus vis-à-vis de Listeria monocytogenes dans un fromage à pâte pressée non cuite

Saubusse, Marjorie 30 March 2007 (has links) (PDF)
L'objectif était de déterminer si et comment les populations microbiennes des laits crus pouvaient faire barrière à Listeria monocytogenes dans un fromage à pâte pressée non cuite. La comparaison des profils SSCP de fromages avec et sans développement de L. monocytogenes a permis d'identifier les pics de Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus saccharominimus, Enterococcus faecium, Chryseobacterium sp. et Corynebacterium flavescens dominants dans les profils des fromages inhibiteurs. Lc. lactis s'est révélée le plus inhibiteur en fromages par production d'acide lactique en début d'affinage. L'inventaire des populations du lait cru le plus inhibiteur a permis de reconstituer une communauté de 32 espèces. Par omission successive de groupes microbiens constituant cette communauté, il a été montré que les bactéries lactiques agissaient en synergie avec les bactéries à Gram positifs non lactiques dans l'inhibition. Le rôle des levures serait moindre et les bactéries à Gram négatif n'interviendraient pas. En cours d'affinage, l'inhibition serait plutôt attribuée à la production d'acides organiques, d'alcools et de certains esters
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Carnobacterium maltaromaticum : caractéristiques physiologiques et potentialités en technologie fromagère / Carnobacterium maltaromaticum : physiological properties and potentialities in the cheese-making manufacturing process

Edima, Hélène Carole 20 September 2007 (has links)
La souche Carnobacterium maltaromaticum LMA 28, isolée d’un fromage à pâte molle, possède des propriétés physiologiques non conventionnelles pour une bactérie lactique. Sa croissance en TSB-YE et en lait traduisent son exigence nutritionnelle en facteurs de croissance facilement assimilables et sa faible vitesse de production d’acide lactique à partir de glucose, lactose, fructose et saccharose. Le galactose n’est pas métabolisé et lors de l’hydrolyse du lactose n’est pas excrété dans le milieu de culture. Les caillés lactiques sont obtenus après des durées d’incubation non compatibles avec les cadences industrielles. De plus, ils présentent une texture très friable. La numération et l’identification de cette souche, en vue de suivre son comportement dans une matrice fromagère, ont été optimisées par la mise au point du milieu de culture sélectif CM, à l’aide de plan d’expériences, et par la technique de PCR. Le comportement de C. maltaromaticum LMA 28 a été comparé à ceux de deux souches lactiques d’intérêt technologique Lc. lactis DSM 20481 et S. thermophilus INRA 302, dans une large gamme de températures (3 à 37 °C) et de pH (5,2- 8,0). Des essais en co-culture, associant cette souche avec Lc. lactis DSM 20481 ou avec S. thermophilus INRA 302, ont montré que la production d’acide lactique était due à la croissance de la souche lactique traditionnelle. Cependant C. maltaromaticum LMA 28, souche lente, n’est pas inhibée par cette acidification. L’aptitude fromagère de C. maltaromaticum LMA 28 a été testée lors de deux fabrications de fromages à pâte molle. Inoculée à différents niveaux de population, elle a été mise en évidence à tous les stades de la fabrication. Présente à une concentration très faible dans le lait de fabrication, elle devient une flore lactique dominante après l’affinage et le stockage en réfrigération. Cette aptitude technologique est en relation avec son caractère psychrotrophe et sa faculté à se développer activement à des pH alcalins. Son « alimentarité », testée par la production d’amines biogènes, a montré des niveaux nuls ou très faibles en tyramine et en histamine, comme avec S. thermophilus INRA 302 et avec Lc. lactis DSM 20481. L’optimisation de sa production de flaveurs maltées a été abordée sur milieu TSB-YE et sur lait, supplémentés avec de la leucine, de l’isoleucine ou de la valine. La production de 3-méthylbutanal est la plus importante. Les analyses sensorielles des fromages contenant des niveaux de population importants (108-109 ufc.g-1) de C. maltaromaticum LMA 28 n’ont pas permis de mettre en évidence cet arôme. Présente dans de nombreux fromages français AOC ou non AOC, cette espèce opportuniste, de statut GRAS, pourrait être considérée comme un auxiliaire de fabrication intéressant, car elle permet un ralentissement du vieillissement des fromages, en évitant notamment l’apparition de flaveurs désagréables. Cette flore lactique psychrotrophe pourrait être retenue comme flore bactérienne d’affinage / The C. maltaromaticum LMA 28 bacteria strain, isolated from soft cheese, was observed to possess non conventional lactic bacteria physiological properties. Its growth in TSB YE medium and milk was found to be characterised by the requirements for easily assimilated growth nutrients and a low kinetic rate of lactic acid production from glucose, lactose, fructose and sucrose. In addition, it was found to not metabolise galactose or not excrete it during the hydrolysis of lactose. In the process of milk fermentation, it not only took an unusually long duration but produced products of fragile texture. In order to eventually determine the behaviour of this strain in the process of cheese-making, a selective culture medium CM was developed using an experimental design and PCR techniques for its isolation and identification. The behaviour of C. maltaromaticum LMA 28 was compared with that of two strains of lactic bacteria of technological interest namely Lc. lactis DSM 20481 and S. thermophilus INRA 302, within a wide temperature range (3 to 37°C) and of pH (5.2 – 8.0). Tests carried out in co-culture associating this strain with Lc. lactis DSM 20481 or with S. thermophilus INRA 302 showed that the lactic acid production was due mainly to the growth of the traditional lactic strain. In the process, the C. maltaromaticum LMA 28 slow strain was observed not to be inhibited by acidification. The cheese-making potential of C. maltaromaticum LMA 28 was evaluated in the process of two soft cheese manufactures. Inoculated at various levels of population, it was observed to be present at all manufacturing stages. Generally present at very weak concentrations in the starting milk, it becomes a dominant lactic flora following ripening and refrigeration storage. This technological aptitude is in relation with its psychrotrophic character and its ability to actively develop in alkaline medium. Its “alimentarity”, tested by its ability to produce biogenic amines, showed zero or very low levels in tyramine and histamine, as in the case of S. thermophilus INRA 302 and Lc. lactis DSM 20481. The optimization of its malted flavour production capacity was carried out on a TSB-YE medium and on milk supplemented with leucine, isoleucine or valine. In this process the production of 3-méthylbutanal was observed to be the most abundant product while cheese containing high levels (108-109 ufc.g-1) of C. maltaromaticum LMA 28 did not exhibit this flavour. This notwithstanding, the presence of this species of GRAS status in many French AOC and non AOC cheeses could be considered as an interesting auxiliary in cheese manufacturing process since it tends to slow down the aging process and thereby retard the development of unpleasant flavours. In this respect this strain of psychotrophic lactic bacteria could be retained as a flora for cheese ripening process
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Probiotiques, prébiotiques, synbiotiques et prévention des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin : proposition d'un crible de sélection rationnel in vitro / Probiotics, prebiotics, synbiotics and inflammatory bowel diseases prevention : in vitro screen proposition

Grimoud, Julien 07 December 2010 (has links)
De nombreuses pathologies découlent de déséquilibres du microbiote intestinal. Ainsi, des stratégies visent à les prévenir en restaurant cet écosystème par l'apport de probiotiques, de prébiotiques et de synbiotiques. Des résultats prometteurs nécessitant d'être validés rationnellement, nous nous sommes proposés d'établir un premier crible de sélection de bactéries lactiques et de glucooligosaccharides (GOS) pour des activités anti-inflammatoires et anti-prolifératives in vitro. Les probiotiques ont inhibé des pathogènes tout en se révélant résistants aux conditions du tube digestif, tandis que deux GOS ont conduit à leur croissance sélective. De plus, les probiotiques ont réduit la réponse inflammatoire de cellules intestinales et la prolifération de cellules cancéreuses en association avec un GOS. Nous avons donc retenu des produits potentiellement actifs contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et du cancer colorectal, par un crible devant être validé in vivo. / Some pathologies are induced by intestinal microbiota disorders. Thus, some strategies aim torestore this ecosystem through probiotics, prebiotics and synbiotics. Promising results need tobe rationally validated, so we aimed to establish the screening first step of lactic acid bacteriaand glucooligosaccharides (GOS) against anti-inflammatory and anti-proliferative activity invitro. Probiotics inhibited pathogens and were resistant to digestive tract conditions whileGOS promoted specifically their growth. Moreover, probiotics reduced inflammatoryresponse of intestinal cells and proliferation of cancer cells when combined with GOS. Thus,we selected compounds potentially efficient against inflammatory bowel diseases andcolorectal cancer, through a screen that need to be validated in vivo
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Etude des plasmides et génomes d’Oenococcus oeni pour l’identification des gènes d’intérêt technologique / Study of plasmids and genomes of Oenococcus oeni to identify genes of technological interest

Favier, Marion 17 December 2012 (has links)
Oenococcus oeni joue un rôle essentiel dans l’élaboration du vin. Adaptée aux environnements acides et riches en alcool, elle est la bactérie lactique naturellement sélectionnée pour mener la fermentation malolactique (FML). Elle est ainsi la principale espèce recherchée et utilisée industriellement comme levain malolactique. Toutefois, il existe une grande diversité phénotypique au sein des souches d’O. oeni et notamment une variabilité des propriétés technologiques que sont la résistance à la lyophilisation, la résistance à l’inoculation dans le vin et la capacité à réaliser rapidement la FML. De nombreux gènes impliqués dans l’adaptation au vin ont déjà été identifiés mais, ne se sont pas toujours révélés efficaces pour la sélection de souches œnologiques. Dans ce contexte, cette étude a consisté à identifier des gènes spécifiques des souches d’intérêt technologique à travers l’analyse des plasmides et génomes. Face aux difficultés rencontrées pour purifier les grands plasmides, seul le plasmide pOENI-1 a été étudié. Ce travail a révélé différentes formes plasmidiques regroupées en une famille nommée « pOENI-1 ». Plusieurs gènes accessoires ont été identifiés et deux d’entre eux ont été détectés chez les souches associées aux fermentations malolactiques spontanées. La comparaison des génomes de souches aux propriétés technologiques diverses a également révélé des séquences génétiques qui leur sont spécifiques. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier plusieurs gènes dont la distribution statistique parmi les souches d’O. oeni a été analysée par la construction de courbes ROC. Ces courbes permettent d’évaluer la qualité des gènes en tant que marqueurs génétiques des souches d’intérêt technologique. Il est donc maintenant possible d’orienter la sélection des nouveaux levains malolactiques par l’utilisation des données génétiques et des outils statistiques décrits dans cette étude. / Oenococcus oeni plays an essential role in the production of wine. Adapted to acidic and alcohol rich environments, it is the lactic acid bacterium species that is naturally selected to conduct malolactic fermentation (MLF). It is also the main species that is selected and used industrially as malolactic starter. However, there is a huge phenotypic diversity among strains of O. oeni, which includes a variability of technological properties such as resistance to freeze-drying, resistance to inoculation into the wine and the ability to quickly achieve the MLF. Many genes involved in adaptation to wine have been identified but have not always proven effective in selecting wine strains. In this context, this study aimed to identify genes that are specific strains of technological interest through the analysis of genomes and plasmids. Due to difficulties encountered to purify large plasmids, only the plasmid pOENI-1 was studied. This work has revealed several different but related plasmids that were grouped into a family named "pOENI-1". Several accessory genes have been identified and two of them were detected in O. oeni strains associated with spontaneous MLF. Comparing the genomes of strains showing various technological properties also revealed genetic sequences that are specific of those strains. Altogether, these works have revealed several genes whose statistical distribution among O. oeni strains was analyzed by constructing ROC curves. These curves are used to assess the quality of genes as genetic markers of strains of technological interest. It is now possible to guide the selection of new malolactic starters by the use of genetic data and statistical tools described in this study.

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