Ets-1 est un facteur de transcription qui régule des gènes impliqués dans divers processus physiologiques et pathologiques. Il n’agit pas seul au niveau de ses promoteurs cibles mais en coopération avec une variété de partenaires protéiques. L’identification de nouvelles protéines interagissant avec Ets-1 devrait nous permettre de mieux appréhender certaines de leurs fonctions intrinsèques. Dans ce but, nous avons mis au point une stratégie de purification par affinité des partenaires protéiques d’Ets-1. Ceci nous a permis d’identifier et de confirmer comme partenaires d’interaction d’Ets-1, les trois protéines du complexe DNA-PK : Ku70, Ku86 et DNA-PKcs. Nous avons ensuite déterminé les conséquences fonctionnelles des interactions. Ces résultats ont permis de définir une nouvelle régulation de son activité qui pourrait fournir de nouveaux indices pour comprendre les diverses fonctions d’Ets-1.Dans une autre étude, nous avons démontré que l’isoforme majoritaire Ets-1 p51 est un nouveau substrat de la caspase-3, protéase effectrice de la machinerie apoptotique. En effet, Ets-1 p51, mais pas le variant d’épissage Ets-1 p42, est clivé in vitro et dans des cellules apoptotiques par la caspase-3. Ce clivage génère trois fragments C-terminaux : Cp20, Cp17 et Cp14 et un fragment N-terminal Np36. le fragment Cp17, le principal produit de clivage, est capable de bloquer l’activation des promoteurs cibles induites par Ets-1 p51, démontrant ainsi ses propriétés de dominant négatif naturel. Ces données suggèrent un nouveau mécanisme de régulation d'Ets-1 via son clivage par la caspase-3 en générant un fragment dominant négatif qui peut jouer un rôle actif durant l'apoptose / Ets-1 is a transcription factor that regulates genes involved in various physiological and pathological processes. Ets-1 proteins do not act alone on their target promoters but with a wide range of protein partners. Identifying novel proteins that interact with Ets-1 should permit a better understanding of the intrinsic functions of the Ets-1 proteins. For this purpose, we develop an affinity purification strategy of Ets-1 interaction partners using streptavidin pull-down assay. We thereby identified new potentials interaction partners consisting for a heterotrimeric complex of DNA-PK, made up of Ku70, Ku86 and DNA-PKcs. Then, we characterized the functional consequences of the interactions. These results have permit to identify a new regulation of its activity that could provide new clues to understand the diverse functions of Ets-1.In another study, we demonstrated that the majority isoform Ets-1 p51 is a novel cleavage substrate of caspase-3, an effector protease of apoptosis. Indeed, Ets-1 p51, but not the spliced variant Ets-1 p42, is processed in vitro and in cells undergoing apoptosis by caspase-3. These cleavages lead to the generation of three C-terminal fragments Cp20, Cp17 and Cp14 and a N-terminal fragment, Np36. The Cp17 fragment, the major cleavage product generated during apoptosis, inhibits Ets-1 p51-mediated transactivation of target genes, acting thus as a natural dominant-negative of the full-length Ets-1 p51 protein. These data suggest a novel mechanism of Ets-1 p51 regulation through its caspase-mediated cleavages and generation of a dominant-negative fragment, which may play active role during apoptosis

Des préoccupations d’ordre économique et environnemental ont introduit depuis quelques années déjà le concept d’intensification de procédés. En traitant de la maîtrise et de l’intensification de procédés enzymatiques, cette thèse s’est partagée en deux parties. La première s’est focalisée sur la mise en œuvre et l’étude microcinétique de réactions enzymatiques en microréacteur. Elle visait à optimiser la préparation d’un peptide opioïde à partir d’une réaction protéolytique, l’hydrolyse de l’hémoglobine bovine par la pepsine porcine. Tout d’abord, une modulation de la sélectivité cinétique de la réaction a été mise en évidence. Puis, en adoptant une démarche d’intensification, un couplage du microprocédé de protéolyse enzymatique à un microprocédé séparatif a été mis au point. Il a permis la récupération sélective et continue de l’hémorphine LVV-h7 par un enchaînement de deux extractions liquide-liquide consécutives. Au travers de l’ensemble de ces résultats, la première partie de ce travail de thèse tente de mettre en évidence quelques bénéfices attrayant que peut procurer l’utilisation de technologies microfluidiques en génie des procédés. Enfin, la deuxième partie de cette thèse s’est étendue à la conception d’un réacteur microstructuré à enzyme immobilisé en proposant l’utilisation exclusive d’un matériau organosilicié, le TétraMéthylDiSiloxane. La technologie des plasmas froids employée a d’abord permis la mise au point d’une méthodologie originale d’immobilisation enzymatique par piégeage stérique. Le protocole développé a ensuite permis d’imaginer la conception « bio-intégrante » d’un microréacteur à enzyme immobilisé, par polymérisation assistée par plasma. / New economic and environmental issues previously introduced the concept of process intensification since some years ago. Dealing with the control and the intensification of enzyme processes, this thesis was divided into two parts. The first part focused on the study of enzyme reactions in microreactor from a microkinetic perspective. It was intended to optimize the preparation of an opioid peptide from a proteolytic reaction, the hydrolysis of bovine hemoglobin by porcine pepsin. Firstly, a modulation of the reaction kinetic selectivity was highlighted. Then, on the basis of a sustainable approach, the enzymatic process was coupled to a separative process. It allowed the selective and continuous recovery of the hemorphin LVV-h7 by a sequence of two consecutive liquid-liquid extractions. Through all of the results, the first part of this thesis attempts to highlight some attractive benefits derived of the use of microfluidics in process engineering. Finally, the second part of this thesis has been extended to the design of a microstructured reactor with immobilized enzyme by exclusively using an organosilicon material, TetraMethylDiSiloxane. First, cold plasma technology allowed the development of an original methodology for enzyme immobilization by steric entrapment. Then, by using plasma-assisted polymerization, this protocol was used to design an immobilized enzyme microreactor according to a “bio-integrating” methodology.

La protéolyse péricellulaire représente un phénomène commun à différentes pathologies vasculaires, notamment l’athérome et les anévrismes de l’aorte ascendante humaine (TAA). Le plasminogène est un zymogène plasmatique délivré à la paroi aortique sous l’effet de la conductance hydraulique transmurale où il s’active au contact des cellules musculaires lisses (CML) en plasmine. La protéase nexine-1 (PN-1), une serpine tissulaire exprimée et sécrétée par les CML est capable de réguler l’activité protéolytique des sérines protéases, notamment celle de la plasmine au sein de la paroi aortique. Notre hypothèse est donc que la PN-1 a un rôle protecteur au cours des pathologies athéromateuses et anévrismales via l’endocytose des complexes plasmine-PN-1 par le LRP-1 (LDL receptor related protein-1).Nous avons mis en évidence, dans les tissus des stades précoces de l’athérome humain, une présence du plasminogène, une augmentation d’activité plasmine et une surexpression de laPN-1 et du LRP-1. Les plaquettes et les cellules spumeuses, plus particulièrement les CML représentent les sites majeurs d’accumulation de la PN-1 à ces stades de la pathologie. L’expression de la PN-1 est également modulée par les LDL (low density lipoprotein). Nous avons observé dans les TAA, une augmentation d’expression du plasminogène, de la PN-1 et du LRP-1. L’activité plasmine est aussi augmentée et corrélée avec la production de la PN-1 dans les milieux conditionnés provenant de TAA. Nos données en immunocytochimie ont montré que les complexes plasmine-PN-1 et la PN-1seule sont internalisés via le LRP-1 dans les CML d’aortes saines et de TAA. En revanche, la plasmine seule n’est pas internalisée. En conclusion, nos travaux montrent que la PN-1 a un rôle protecteur dans l’athérome précoce humain et les TAA via l’inhibition de la plasmine et la clairance tissulaire des complexes plasmine-PN-1 par le récepteur scavenger LRP-1 dans les CML. / Pericellular proteolysis is a common phenomenon to various vascular diseases, includinghuman atheroma and aneurysms of the ascending aorta (TAA). Plasminogen is a plasmazymogen delivered to the aortic wall by radial transmural hydraulic conductance, where it isactivated in contact with smooth muscle cells (SMC) into plasmin. Protease nexin-1 (PN-1), atissue serpin expressed and secreted by SMC is capable of regulating proteolytic activity ofserine proteases, especially plasmin activity within the aortic wall. Our hypothesis is that PN-1 has a protective role in the atherosclerotic and aneurysmal pathologies via the endocytosisof plasmin-PN-1 complexes by LRP-1 (LDL receptor related protein-1).We showed in tissue of early stages of human atheroma, a presence of plasminogen, anincrease of plasmin activity and an overexpression of PN-1 and LRP-1. Platelets and foamcells including SMC are the major sites of PN-1 accumulation at those stages of the disease.PN-1 expression is also modulated by LDL (low density lipoprotein).In TAA, plasminogen, PN-1 and LRP-1 were overexpressed. The plasmin activity is alsoincreased and correlated with PN-1 production in conditioned media from TAA.Our immunocytochemical data showed that plasmin-PN-1 complexes and PN-1 alone areinternalized via LRP-1 in SMC from healthy aortas and TAA. However, plasmin alone is notinternalized.In conclusion, our work show that PN-1 has a protective role in early human atheroma andTAA via plasmin inhibition and tissue clearance of plasmin-PN-1 complexes by the scavengerreceptor LRP-1 in SMC.

Différentes formes plus courtes de la protéine de la matrice (M) du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) peuvent être produites lors de l'infection de cellules in vitro à cause des phénomènes d'initiation interne de la traduction (Jayakar et Whitt, 2002) et de protéolyse (Rosen et al., 1983). L'objectif de la présente étude était de caractériser les formes plus courtes de M produites lors de l'infection de cellules par une souche sauvage du VSV (HR), ou par un variant (T1 026-R1) qui possède une mutation sur sa protéine M (M51R). Pour ce faire, des cellules HeLa, BHK-21 et L929 ont été infectées par ces deux variants lors d'expériences séparées. Des immunobuvardages et des tests de type «pulse-chase» ont permis d'observer l'existence d'au moins quatre formes de M à l'intérieur des cellules infectées (M1, M', M" et Mfc) et ce, indépendamment de la souche virale employée. Lors de l'infection des cellules par la souche sauvage du VSV (HR), les formes M" et Mfc pourraient être produites par initiation interne de la traduction aux positions 33 et 51 de M, respectivement. L'existence de la forme Mfc, ou d'une protéine de taille semblable, à l'intérieur des cellules infectées par T1026-R1, ne peut cependant pas être expliquée par un évènement d'initiation interne de la traduction en position 51 à cause de la mutation M51 R. L'origine de cette protéine pourrait être attibuable à l'action de la trypsine ou une autre protéase activée au cours de l'infection. Des expériences de «pulse-chase» en présence de l'inhibiteur z-VAD ont montré que l'apparition de Mfc pouvait dépendre de l'activation des cystéines protéases. L'analyse des séquences des différentes formes de M par dégradation de Edman et par spectrométrie de masse n'a pas permis d'identifier la portion manquante de la protéine. Aussi, afin de tenter de déterminer le rôle physiologique des formes de M produites par initiation interne de la traduction, des vecteurs d'expression inductible des gènes tronqués ont été construits. L'expression de ces protéines à l'intérieur de cellules HeLa transfectantes stables n'a pu être détectée. La protéase impliquée dans la production de la forme Mfc du mutant T1 026-R1 reste à identifier ainsi que le rôle des différentes formes plus courtes de la protéine M dans la cytopathogénèse et le cycle de réplication du VSV. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Virus stomatite vésiculeuse, Protéine matrice, Initiation interne de la traduction, Protéolyse.

La dégradation des protéines, appelée protéolyse, est un mécanisme essentiel pour le fonctionnement et la survie cellulaire. Elle se fait en grande partie grâce à l’ubiquitination des protéines qui permet au protéasome de les reconnaître et de les cliver. Dans le cadre de ce projet, et ce, à partir de deux cas cliniques, j’ai étudié le rôle la protéine F-box/WD repeat-containing protein 4 (FBXW4) dans ce processus de dégradation. Les patients étaient tous deux atteints d’un syndrome polymalformatif caractérisé par une ectrodactylie appelé split hand/split foot malformation de type 3 (SHFM3) et par une insuffisance rénale chronique. Ils étaient aussi tous deux porteurs d’une mutation P376Q dans FBXW4. Comme on suspectait déjà que FBXW4 appartienne à un complexe d’ubiquitination, nous avons émis l’hypothèse que la mutation affectait l’assemblage de ce complexe et causait ainsi les désordres cliniques identifiés. J’ai donc reproduit cette mutation in vitro ainsi que d’autres à cette position pour en étudier les effets dans le système d’expression des ovocytes de Xenopus laevis. J’ai constaté que FBXW4 était organisé en homomères et que la nature du résidu 376 jouait un rôle dans cet assemblage. J’ai aussi observé que la nature du résidu 376 affectait aussi la liaison de FBXW4 avec Skp1, une autre protéine qui se retrouve dans le complexe. Ces travaux ont ainsi permis d’en arriver aux conclusions suivantes : 1) la mutation des patients affecte l’assemblage oligomérique de FBXW4, 2) elle est donc fort possiblement causale, et 3) elle entraînerait la maladie dû à un désordre de l’ubiquitination de certaines protéines durant le développement. / Protein degradation, also known as proteolysis, is essential for cell function and survival. It is most often achieved through the ubiquitination of proteins, a process that allows the proteasome to recognize and cleave such proteins. In this project, I studied two clinical cases in which the protein F-box/WD repeat-containing protein 4 (FBXW4) was believed to play a role. Both patients suffered from a polymalformative syndrome characterized by an ectrodactyly called type 3 split hand/split foot malformation (SHFM3) and chronic renal failure. Both patients also bore a P376Q mutation in FBXW4. As previous studies was consistent with the possibility that FBXW4 was part of an ubiquitination complex, we hypothesized that the mutation affected the assembly of this complex and resulted in the observed clinical disorders. I therefore reproduced the mutation in vitro among others at this location and characterized the effects of such mutations in Xenopus laevis oocyte expression system. I found that FBXW4 was organized in homooligomers and that the nature of the residue of position 376 played a role in assembly of the FBXW4 containing complex. I also found that the nature of residue 376 affected the binding of FBXW4 to another protein in the complex, that is, to Skp1. These results allow us to draw the following conclusions: 1) the mutation identified affects the oligomeric assembly of FBXW4, 2) it is thus very likely to be causative, and 3) it could cause an ubiquitination disorder in which certain proteins are not properly degraded during development

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle est due à l’expansion anormale de polyglutamine dans la partie N-terminal de la protéine huntingtine (HTT). Une des étapes clés de la pathologie est le clivage de la HTT pleine longueur en fragments N-terminaux plus petits, contenant l’expansion de polyglutamine, et qui sont toxiques pour les neurones. En effet, les clivages de la HTT mutée génère des fragments N-terminaux (N-ter) de tailles comprises entre les acides aminés 1-105 et 1-586 observés dans des extraits de cerveaux de patients MH post-mortem et dont l’implication dans la mort neuronal est bien caractérisée. Mes travaux de thèse ont visé à modéliser le clivage de la HTT et à évaluer les conséquences sur la survie neuronale.Au cours de ma thèse, j’ai développé un outil permettant de contrôler le clivage de la HTT dans le temps et à des sites spécifiques. J’ai étudié le clivage de la HTT à deux sites stratégiques : les positions clivées par la caspase-6 et par la bléomycine hydrolase/cathepsine Z. A l’aide de cet outil, j’ai montré que le clivage de la HTT confère une toxicité cellulaire qui dépend du profil du clivage. Plus précisément, J’ai décrit une interaction intramoléculaire au sein des domaines de la HTT. Mes résultats indiquent que cette interaction protège les cellules de la toxicité induite par le clivage de la HTT mutée. En effet, les clivages successifs de la HTT annulent cette interaction, ce qui induit la libération des fragments N-ter mutants et provoque la mort cellulaire à l’issue de leur translocation nucléaire. Pour conclure, au cours de ma thèse, j’ai montré que la protéolyse successive de la HTT induit des processus cytotoxiques différents. / Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine (polyQ) expansion in the N-terminus of the protein huntingtin (HTT). A crucial step in HD pathogenesis is the cleavage of full-length HTT into smaller N-terminal (N-ter) fragments that contain the polyQ stretch and that are toxic to neurons. HTT cleavage generates short N-ter fragments whose amino-acid positions range from 1-105 to 1-586. These fragments are observed in HD post mortem brain samples and their participation in neuronal death in HD is well characterized. During my PhD research, I investigated the consequences of full-length mutant HTT proteolysis by developing a time and site-specific controlled system for HTT proteolysis. I have assessed HTT cleavage on two sites caspase-6 and cathepsin Z. My results show that HTT cleavage induces neurotoxicity in vitro as well as in vivo, toxicity which depends on HTT proteolysis pattern. Briefly, we described an intramolecular interaction within the HTT domains which is impaired upon successive proteolysis of HTT. We found that HTT intramolecular interaction buffer mutant N-ter HTT-induced toxicity. Moreover, specific cleavages of the mutant HTT generated toxic N-ter fragments as they translocate into the nucleus. To conclude, my PhD work has shown that additional cleavage of mutant HTT induces cytotoxicity by different mechanisms.

La détermination du rôle des protéines est à l'origine de la plupart des études biologiques. Elle est encore plus d'actualité depuis l'avènement du séquençage des génomes qui fournit des protéines de rôle inconnu en grande quantité. Le séquençage de nouveaux génomes a permis, par ailleurs, l'obtention de données post-génomiques à haut débit comme les données transciptomique. Il a permis également la construction de données comme les profils phylogénétiques. L'approche que nous avons utilisée, mêlant statistiques et biologie, intègre ces données post-génomiques pour prédire puis valider le rôle de protéines protéolytiques chez Lactococcus lactis. Nous avons procédé en trois étapes réalisant, dans un premier temps, une inférence statistique des liens prédits entre protéines du lactocoque basée sur cinq sources de données distinctes : le graphe des voies métaboliques, des données transcriptomiques, des profils phylogénétiques, des distances entre gènes en paires de bases et des données protéomiques issues de gels 2D. Ces liens nous ont permis de émettre des hypothèses biologiques sur le rôle de protéines cibles. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé des expériences de laboratoire pour valider les prédictions comparant la souche sauvage aux mutants de délétion de PepF et YvjB. La troisième étape de ce travail a consisté à réaliser une analyse de sensibilité dans le but de souligner les données qui ont contribuées le plus aux prédictions et de trouver un sous-ensemble de données aboutissant aux mêmes prédictions. Appliquée à deux enzymes protéolytiques potentielles du lactocoque, PepF et YvjB, cette approche nous a permis de vérifier leur participation dans l'export de protéines telle qu'elle avait été prédite par l'analyse statistique. Nous avons montré que PepF participe à l'export de protéines libérées dans le milieu extérieur (protéines sécrétées) en hydrolysant le peptide signal libéré par la signal peptidase I. PepF participe par ailleurs aussi à la synthèse de la paroi cellulaire et au métabolisme du pyruvate, fonctions aussi prédites par l'analyse statistique. YvjB participe à la mise en place et la maturation d'un autre groupe de protéines exportées, les lipoprotéines. Elle est nécessaire pour la localisation correcte de certaines lipoprotéines et participe au clivage de leur peptide signal. Notre approche s'est avérée très utile dans la mesure où elle permet d'émettre des hypothèses biologiques qui guident les validations expérimentales. Par ailleurs, cette démarche est applicable à tout organisme entièrement séquencé pour lequel suffisamment de données post-génomiques sont disponibles.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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