Différents facteurs sont connus pour affecter les paramètres de qualité du foie gras. Parmi ces paramètres, la fonte est considérée comme étant la plus critique du point de vue des producteurs et des consommateurs. Outre les facteurs déjà connus, le but de ce travail est d’étudier si les activités protéolytiques hépatiques pourraient jouer un rôle dans le déterminisme de la qualité du foie gras. Pour atteindre cet objectif, trois expérimentations ont été menées, dans lesquelles nous avons utilisé des approches biochimiques et protéolytiques ainsi que des mesures de qualité. Dans ces trois expériences nous avons évalué : 1) l’effet du gavage chez deux types génétiques de canards, 2) l’effet de la vitesse de refroidissement et du stockage post mortem et 3) l’effet de la variabilité de taux de fonte sur les activités protéolytiques. Nos résultats montrent que les activités protéolytiques restent constantes ou baissent avec le gavage. De plus, malgré des différences connues quant à leur capacité à développer une stéatose hépatique, les canards de Barbarie et les canards Pékin ont réagis de la même façon en ce qui concerne leurs activités protéolytiques. En ce qui concerne l’effet des différentes vitesses de refroidissement, nous avons montré que plus le refroidissement est lent, plus le foie fond et que ceci est –au moins partiellement- due à des activités protéolytiques plus élevées. Finalement, nous avons montré que les foies à fonte élevée présentés également des activités protéolytiques supérieures à celles des foies à fonte faible. Dans cette thèse, nous avons pu mettre en évidence certaines relations existantes entre la protéolyse hépatique et les qualités du foie gras de canard. Cependant, d’autres études seront nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes responsables de ces relations dans le but d’exploiter le potentiel des protéases dans la maîtrise de la qualité du foie gras. / Different factors are known to affect the quality parameters of « foie gras ». Among those parameters, the cooking loss is considered to be the most critical one in the eyes of both producers and consumers. Besides already known factors, the objective of this work is to investigate whether proteolytic activities might play a role in the determinism of « foie gras» cooking losses. To achieve this objective three experiments were conducted in which we used biochemical and proteomic approaches as well as quality analysis. In these three different experiments we evaluated: 1) the effect of overfeeding in two breeds of ducks (Muscovy and Pekin ducks) 2) the effect of chilling rate and post mortem storage and 3) the effect of cooking loss variability on proteolytic activities. Our results show that overfeeding either does not affect proteases activities, either causes their decrease. In addition, despite the known differences regarding their ability to develop hepatic steatosis, in our study Muscovy and Pekin ducks’ proteolytic activities responded similarly to overfeeding. Concerning the effect of chilling rates, we showed that the slower the chilling rate the higher the melting after cooking. This result is - at least partially- due to higher proteolytic activities. Finally we showed that livers with a high melting rate presented higher proteolytic activities than those with a low melting rate. In this thesis, we were able to expose certain relations between hepatic proteolysis and fatty liver qualities. However, more studies are required to better understand the mechanisms underlying these relations in the goal of exploiting the potential of proteases in fatty liver quality control.

De précédents travaux de recherche ont montré la présence de phénomènes inflammatoires dans les muscles de patients souffrant d’une maladie génétique rare nommée dystrophie musculaire des ceintures de type 2A (en anglais, LGMD2A), et ceci très tôt dans le développement de cette maladie. Il a aussi été observé les mêmes phénomènes chez le modèle animal de la maladie. C’est pourquoi nous avons mené une étude sur l’animal pour tenter d’étudier ces phénomènes afin d’en comprendre leur origine et leur(s) mécanisme(s). En parallèle de ce projet, nous avons développé et testé deux outils de thérapie génique : il s’agit de deux concepts qui vont permettre soit de réparer l’ARN au niveau du transcrit du gène CAPN3 muté responsable de la maladie, soit de permettre aux cellules du muscle de produire une protéine calpaïne-3 fonctionnelle, qui ne peut exercer son rôle correctement à cause des mutations qui la rende non opérationnelle. / Previous research works showed inflammatory phenomena early in muscles of patients affected with a rare genetic disease called Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2A (LGMD2A). This very same phenomena have been observed in LGMD2A animal models. For these reasons we conducted an animal-oriented study to apprehend these phenomena from its origin to mechanism(s). In parallel of this project, we designed and evaluated two gene therapy tools: one to repair RNA on CAPN3 gene transcript that is responsible of LGMD2A, another one to help muscle cells to produce a functional calpain-3 protein based on an inter molecular compensation with vector expressing domains of calpain 3

Les bactéries lactiques (BAL) ont été utilisées par l\'humanité depuis des siècles en raison de leurs propriétés technologiques et de leur capacité à améliorer les propriétés organoleptiques des aliments. En outre, la demande des consommateurs pour des produits laitiers sains et dépourvus de conservateurs chimiques est de plus en plus grande.Dans ce contexte, l\'utilisation de bactéries lactiques utilisées depuis des siècles pour la fermentation des produits laitiers semble pertinente pour améliorer la digestibilité et/ou prolonger la durée de vie des produits laitiers fermentés. L\'une des principales propriétés de ces bactéries est la production de substances antimicrobiennes telles que des bactériocines, des peptides ou des composés non protéiques de faible poids moléculaire (acides organiques, H2O2, et ainsi de suite) qui inhibent la croissance des pathogènes alimentaires et des micro-organismes d\'altération. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens ribosomiques produits entre autre par certaines bactéries lactiques et qui possèdent un spectre d\'inhibition étroit ciblant généralement les bactéries à Gram-positif. Les substances inhibitrices produites par BAL peuvent également inhiber les champignons qui sont en grande partie responsables pour la détérioration des aliments. Un autre propriété importante de BAL est de modifier les protéines du lait au cours du processus de fermentation. Ceci est important pour les personnes allergiques, en raison de la modification du potentiel allergénique de protéines du lait, mais également important pour la production de peptides bioactifs. Récentes découvertes ont montré que des peptides dérivés de l\'hydrolyse des protéines du lait peuvent avoir des activités biologiques, tels que des activités antihypertensives, antioxydantes, antimicrobiennes et immunomodulatrices. En résumé, les BAL sont des outils potentiels pour la production d\'aliments de haute qualité, ce qui stimule la recherche de nouvelles souches ayant des propriétés biologiques intéressantes. Ainsi, l\'objectif de cette étude était d\'isoler et de cribler de nouvelles souches de BAL possédant des activités antimicrobienne et / où protéolytique. Des souches de BAL ont ainsi été isolées de lait de vache, de buffle et de chèvre ainsi que des fromages provenant du sud-est du Brésil. À partir de 156 échantillons de lait et de fromages, 815 isolats ont été obtenus sur des géloses sélectives pour les BAL. La majorité d\'entre elles était des coques ou des bacilles à Gram-positif et négatif pour la production de catalase. La présence d\'activités antimicrobiennes a été évaluée sur des cultures pures de ces nouveaux isolats par des tests d\'antagonisme sur géloses (essai spot-on-the-lawn), et leurs activités protéolytiques on été évaluées par culture sur géloses BHI (Brian Heart Infusion) additionnée de lait écrémé. Les isolats les plus protéolytiques ont été testés par culture dans du lait écrémé suivie d\'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Parmi les 815 isolats testés, quatre d\'entre eux, identifiés comme Lactobacillus paraplantarum FT 259 et Streptococcus uberis (FT86, FT126 et FT190) étaient producteurs de bactériocines, tandis que quatre autres, identifiés comme Weissella confusa FT424, Weissella hellenica FT476, Leuconostocs citreum FT671 et Lactobacillus plantarum FT723 ont montré une activité antifongique lors d\'essais préliminaires. Des analyses complémentaires ont montré que la souche la plus antifongique était L. plantarum FT723 qui inhibait Penicillium expansum sur gélose MRS modifiée (de Man, Rogosa, Sharpe, sans acétate) et dans un modèle de lait fermenté. Des activités protéolytiques ont été détectées dans 205 isolats lors des tests sur géloses supplémentées en lait écrémé. Les activités protéolytiques des 123 isolats présentant les activités les plus fortes ont été confirmées en faisant migrer les surnageants de laits fermentés sur SDS-PAGE. Les capacités protéolytiques des trois isolats les plus protéolytiques Enterococcus faecalis (FT132 et FT522) et Lactobacillus paracasei FT700 ont également été testées sur des caséines et sur deux protéines du lactosérum (?-lactoglobuline et d\'?-lactalbumine), les produits de dégradation ont été visualisés par SDS-PAGE. En raison de la grande similitude entre les deux souches d\'Enterococcus, seul E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont été sélectionnés pour des études plus poussées sur leurs activités protéolytiques en utilisant des protéines du lait comme substrats lors d\'incubations dans différentes conditions suivies de l\'analyse des produits d\'hydrolyse par SDSPAGE et par chromatographie liquide haute performance (high performance liquid chromatography, HPLC). Tant E. faecalis FT132 que L. paracasei FT700 ont montré des activités protéolytiques à un pH de 6,5, à des températures comprises entre 37 à 42 ºC. Leurs activités protéolytiques étaient dues à des métallo-protéases. Pour évaluer les activités biologiques possibles des peptides dérivés de l\'action d\'E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 sur les protéines du lait, les surnageants des laits fermentés par ces souches ont été purifiés sur colonnes C8 puis lyophilisés. Ces lyophilisats ont ensuite été repris dans du RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) et ajoutés à différentes cultures primaires (monocytes et macrophages) pour évaluer leur cytotoxicité, les mécanismes de la mort celullaire qui y étaient associés, ainsi que leurs propriétés immunomodulatrices (différenciation des monocytes en macrophages et quantification de TNF-?). Les peptides générés par les deux souches testées étaient toxiques (favorisant l\'apoptose des cellules) après 72 h d\'exposition à une concentration de 10 mg/mL. Au-dessous de ces concentrations cytotoxiques, les deux surnageants de laits fermentés produits par E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont stimulé la différenciation des monocytes en macrophages, comme observé par l\'expression accrue du marqueur CD71. Cette stimulation du système immunitaire n\'était pas inflammatoire en raison de la faible production de TNF-?. Certaines BAL peuvent contribuer à la santé des consommateurs et sont utilisées comme probiotiques. Cependant, les effets biologiques des souches ainsi que leur innocuité doivent être vérifiés avant leur utilisation comme probiotiques. Contrairement aux entérocoques, plusieurs espèces de lactobacilles sont reconnues comme GRAS (Generally Recognized as Safe). Dans cette étude, il a été montré que la souche E. faecalis FT132 hébergeait trois gènes de virulence asa1, as et gelE, et qu\'elle était résistante à l\'érythromycine et à la tétracycline, ce qui signifie que cette souche ne peut pas être ajoutée à des produits alimentaires. Cependant, L. paracasei FT700 pourrait d\'avéré un candidat potentiel pour être utilisée en tant que probiotique, ainsi que L. paraplantarum FT259, la souche bacteriocinogénique décrite précédemment. Afin d\'évaluer leur capacité de survie dans le tractus digestif en vu d\'une éventuelle utilisation comme probiotiques, les souches ont été incubées dans des milieux de culture acidifiés (pH 2,0, 2,5 et 3,5), dans des sels biliaires, dans des conditions simulant les conditions gastriques et leur capacité de survie a été testée ainsi que leur sensibilité à différents antibiotiques. En outre, la bactériocine produite par L. paraplantarum FT259 a été partiellement purifiée sur colonne remplie de résine XAD-16, suivie d\'une extraction en phase solide sur colonne C18, suivie d\'une analyse par SDS-PAGE. Des PCR avec différentes amorces ciblant la plantaricine NC8, la plantaricine S et la plantaricine W ont été effectuées suivie du séquençage des amplicons afin d\'idéntifier des gènes pour la production de bactériocines. Les résultats ont montré que L. paraplantarum FT259 tolérait des expositions à un pH de 3,5, et à une concentration en sels biliaires de 0,3% pendant une durée maximum de 180 minutes. En revanche, il n\'était plus possible de détecter de cellules viables (limite de détection de la méthode : 100 UFC / mL) après une exposition à des pH de 2,0 et de 2,5 pendant 90 minutes. Lors des expériences simulant les conditions gastriques, le nombre de cellules viables de L. paraplantarum FT259 a diminué de 8,6 log UFC/mL à 4,4 log UFC/mL après 180 minutes d\'incubation. Les résultats obtenus pour la souche L. paracasei FT700 ont montré que celle-ci a survécut à presque toutes les conditions. Après 180 minutes dans un pH de 2,0 et dans le jus gastrique simulé, la population bactériennes ont respectivement diminué de 4 et de 3 log UFC/mL. Il a également été démontré que L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700 étaient sensibles à la majorité des antibiotiques testés. L\'analyse par SDS-PAGE a indiqué que la bactériocine partiellement purifiée présentait une masse moléculaire d\'environ 3900 Da et que le séquençage des amplicons d\'ADN suite aux PCR a montré que la souche possédait le gène de la plantaricine NC8. L\'ensemble de ces résultats indique que les deux souches de lactobacilles isolées lors de cette étude (L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700) possèdent des caractéristiques pouvant leur conférer un intérêt d\'utilisation en tant queprobiotiques. La production de bactériocines (L. paraplantarum FT259), et l\'activité protéolytique (L. paracasei FT700) pourraient également être des caractéristiques intéressantes pour des applications alimentaires. En conclusion, les BAL obtenues dans cette étude pourraient être utiles dans l\'industrie alimentaire pour la production de nouveaux produits laitiers à durée de conservation prolongée et une digestibilité accrue, ou encore pour la production de peptides bioactifs. / As bactérias láticas (BAL) têm sido utilizadas pela humanidade há séculos devido às suas propriedades tecnológicas e potencial para conferir características sensoriais agradáveis aos alimentos. Além disso, é cada vez maior a demanda por alimentos de qualidade. Neste contexto, BAL tem grande potencial para serem utilizadas na produção de alimentos. Uma das principais características destas bactérias é a produção de substâncias que inibem a multiplicação de agentes patogênicos e micro-organismos deteriorantes em alimentos, tais como ácidos orgânicos, H2O2 e bacteriocinas. Estas últimas são um peptídeos antimicrobianos produzido via ribossomo por algumas bactérias e possuem pequeno espectro inibição. As bacteriocinas podem reduzir a multiplicação de bactérias-alvo, aumentando a segurança alimentar e a vida de prateleira de alimentos. Essas substâncias inibitórias produzidas por BAL podem também inibir fungos, que são em grande parte responsáveis pela deterioração dos alimentos. Outra importante propriedade das BAL é capacidade de modificar as proteínas do leite durante o processo de fermentação. Isto é importante para indivíduos alérgicos devido à alteração de potencial alergênico das proteínas do leite, e também é importante para a produção de peptídeos bioativos. Recentemente, resultados demonstraram que os peptídeos obtidos a partir da hidrólise de proteínas do leite podem ter diferentes atividades biológicas, tais como anti-hipertensiva, antioxidante, antimicrobiana e imunomodulatória. Em resumo, BAL apresentam potencial para a produção de alimentos de alta qualidade, o que estimula a busca de novas linhagens com propriedades tecnológicas de interesse. Assim, no presente estudo, BAL com atividade antimicrobiana e / ou proteolítica foram isoladas de leite e queijo de vaca, búfala e cabra, obtidos na região sudeste do Brasil. A partir de 156 amostras de leite e queijo, foram obtidos 815 isolados em ágar seletivo para BAL. A maioria eram cocos ou bacilos Gram-positivos, e não produziam a enzima catalase. Culturas puras destes novos isolados foram avaliadas quanto a atividade antimicrobiana por testes de antagonismo em ágar (spot-on-the-lawn), e quanto a atividade proteolítica sobre proteínas do leite pelo cultivo em placas de ágar BHI (Brain Heart Infusion suplementado com leite desnatado). Os isolados com maior atividade proteolítica também foram testados pelo cultivo em leite desnatado seguido de análise do leite fermentado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Entre os 815 isolados testados, quatro deles foram identificados como produtores de bacteriocinas, Lactobacillus paraplantarum FT259 (uma linhagem) e Streptococcus uberis (três linhagens, FT86, FT126 e FT190), enquanto quatro outros identificados como Weissella confusa FT424, W. hellenica FT476, Leuconostoc citreum FT671 e Lactobacillus plantarum FT723, os quais apresentaram atividade antifúngica em ensaios preliminares. Análises complementares mostraram que a linhagem com maior atividade antifúngica foi L. plantarum FT723, o qual inibiu Penicillium expansum em ágar MRS modificado (De Man, Rogosa, Sharpe, sem acetato) e em iv modelo de leite fermentado. No entanto, nenhuma inibição foi observada contra Yarrowia lipolytica. A atividade proteolítica foi detectada em 205 isolados por testes em ágar, sendo que 123 isolados com intensa atividade proteolítica foram submetidos a confirmação da atividade por SDS-PAGE. As atividades proteolíticas de três isolados identificados como Enterococcus faecalis (FT132 e FT522) e Lactobacillus paracasei FT700 foram confirmadas por SDS-PAGE, como visualizado pela digestão de caseínas e proteínas de soro de leite (?-lactoglobulina e ?- lactalbumina). No entanto, devido à alta semelhança entre as linhagens, apenas E. faecalis FT132 (juntamente com L. paracasei FT700) foram selecionados para os próximos estudos utilizando proteínas do leite como substratos em diferentes condições, seguidas de análises por SDS-PAGE e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high-performance liquid chromatography). Ambos E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 apresentaram atividades proteolíticas em pH 6,5, entre 37 e 42 °C. A atividade proteolítica das linhagens foi devida à presença de metaloproteases. Em seguida, para avaliar as possíveis atividades biológicas dos peptídeos derivados da atividade proteolítica de E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 em proteínas do leite, o sobrenadante de leite fermentado produzido por estas linhagens foi purificado em cartucho C8 e liofilizado. Desse modo, os sobrenadantes de leite fermentado produzidos por estas linhagens foram adicionados às culturas de células (monócitos e macrófagos) para avaliar a sua citotoxicidade, os mecanismos de morte celular, propriedades imunomoduladoras (diferenciação de monócitos em macrófagos) e quantificação de TNF-? (do inglês tumor necrosis factor). Os sobrenadantes apresentaram toxicidade após 72 h de exposição a 10 mg/mL por apoptose. Abaixo das concentrações citotóxicas, ambos os sobrenadantes de leite fermentado estimularam a diferenciação de monócitos em macrófagos, como observado pelo aumento da expressão do marcador CD71. Esta estimulação imune não foi inflamatória visto que houve pouca produção de TNF-?. BAL também podem contribuir para a saúde dos consumidores quando utilizadas como probióticos. No entanto, algumas características das linhagens devem ser verificadas antes de serem utilizadas como probióticos, especialmente com relação aos fatores de virulência. Lactobacilos geralmente possuem um status GRAS (do inglês generally recognized as safe), ao contrário dos enterococos. Neste estudo, foi demonstrado que E. faecalis FT132 possuía três genes de virulência, asa1, ace e gelE, e que era resistente à eritromicina e à tetraciclina, indicando que esta linhagem não pode ser adicionada em alimentos. No entanto, L. paracasei FT700 seria um potencial candidato para ser utilizada como probiótico, bem como a linhagem bacteriocinogênica descrita anteriormente, L. paraplantarum FT259. As linhagens foram testadas quanto à sobrevivência em meio ácido (pH 2,0, 2,5 e 3,5), tolerância in vitro aos sais biliares, viabilidade em suco gástrico sintético e sensibilidade a antibióticos. Além disso, o peptídeo antimicrobiano produzido por L. paraplantarum FT259 foi parcialmente purificado em coluna preenchida com resina XAD-16, seguido de extração em fase sólida com cartucho de C18, e analisados por SDSPAGE. Reações em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) com primers para os genes estruturais da plantaricina NC8, plantaricina S e plantaricina W, seguidas de sequenciamento de DNA, foram realizados para detectar genes responsáveis pela produção de bacteriocinas. Os resultados mostraram que L. paraplantarum FT259 foi resistente ao pH 3,5 e a 0,3% de sais biliares por até 180 minutos, mas a população bacteriana em pH 2,0 e 2,5 após 90 minutos estava abaixo do limite de detecção do método (2 log UFC/mL). Em testes utilizando suco gástrico sintético, a população de L. paraplantarum FT259 reduziu de 8,6 log UFC/ v mL para 4,4 log UFC/mL após 180 minutos. Por outro lado, L. paracasei FT700 sobreviveu bem em quase todas as condições. Depois de 180 minutos em pH 2,0 e em suco gástrico sintético, a população bacteriana reduziu 4 e 3 log UFC/mL, respectivamente. Também foi demonstrado que L. paraplantarum FT259 e L. paracasei FT700 foram sensíveis à maioria dos antibióticos testados. A análise de SDS-PAGE indicou que a bacteriocina parcialmente purificada apresentava uma massa molecular de aproximadamente 3900 Da, e o sequenciamento de DNA do produto de amplificação obtido por PCR mostrou a presença do gene que codifica a produção da plantaricina NC8. De modo geral, os resultados indicaram que ambas as linhagens possuem potencial probiótico. Além disso, a produção de bacteriocinas (L. paraplantarum FT259) e a atividade proteolítica (L. paracasei FT700) podem ser características interessantes para aplicações em alimentos. As BAL obtidas neste estudo podem ser úteis na indústria de alimentos para a produção de novos produtos lácteos com maior vida de prateleira e aumento da digestibilidade de proteínas do leite, assim como para a produção de peptídeos bioativos comercializados como fórmulas parcialmente purificadas.

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME. / The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.

Le muscle squelettique fait preuve d'une remarquable plasticité en réponse aux changements physiologiques, comme l'activité physique, et aux situations pathologiques. Il subit notamment une atrophie sévère lors de la cachexie qui accompagne diverses pathologies chroniques comme le cancer, le SIDA, etc. L'atrophie musculaire est aussi une composante de la sarcopénie qui survient lors du vieillissement normal, et se caractérise par un déclin de la force et de la masse musculaire. L'atrophie musculaire, qui entraîne une augmentation de la mortalité et diminue l'efficacité des traitements, constitue donc un problème de santé majeur.La fonte musculaire se caractérise par une altération de l'équilibre entre synthèse et dégradation protéiques dans les fibres adultes. Des taux particulièrement élevés de cytokines circulantes, dont le TNFα, qui affectent l'homéostasie du muscle via différentes voies de signalisation, semblent être à l'origine de l'atrophie. Les mécanismes de la réponse atrophique musculaire à ces taux circulants élevés sont cependant mal définis. Le TNFα a des effets complexes. Il peut activer de multiples voies de signalisation, parmi lesquelles l'induction de la synthèse de sphingolipides, et plus particulièrement de céramides, par la voie de novo et par l'activation des sphingomyélinases. Au niveau musculaire, les céramides sont connus pour leurs effets sur la signalisation de l'insuline, sur l'apoptose et sur la différenciation myogénique. Par contre, leur implication dans le cadre de l'atrophie n'avait jamais été prise en compte. L'objectif de ce travail a été dans un premier temps de démontrer le rôle des céramides dans l'atrophie. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé la voie de signalisation par laquelle l'augmentation intramusculaire de céramide induite par le TNFα aboutit à une chute de la synthèse protéique, couplée à une augmentation de la protéolyse. Dans ce but, nous avons mis au point des modèles in vitro d'atrophie, impliquant des myotubes traités par des concentrations physiologiques de TNF. Nous avons en parallèle étudié un modèle in vivo de cachexie induite chez la souris par l'implantation d'un adénocarcinome C26. L'analyse des sphingolipides nous a permis de montrer l'augmentation des taux de céramides concomitante à l'atrophie générée in vitro et in vivo. Le rôle des céramides dans l'atrophie a été démontré par l'effet protecteur des inhibiteurs de leur synthèse, dans les modèles in vitro et in vivo. Nous montrons de plus dans un modèle in vitro que les effets atrophiques des céramides sont dus à l'inhibition de la voie de signalisation Phospholipase D/mTOR/Akt. Nos résultats nous ont permis de prouver le rôle des sphingolipides dans le contrôle de l'homéostasie protéique du muscle. La modulation du métabolisme des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de la perte musculaire associée à diverses pathologies.

Lorsque l'allaitement est impossible, du lait maternel pasteurisé (LMP) est préférentiellement administré, en particulier aux nouveau-nés hospitalisés. La pasteurisation de Holder (62,5°, 30 min) est appliquée pour des raisons sanitaires mais pourrait réduire l'absorption des lipides via l'inactivation des lipases endogènes du lait. L’homogénéisation du LMP pourrait contrer cet effet négatif en augmentant la surface disponible pour l’adsorption des enzymes. L’objectif de cette thèse était d’étudier l’impact de la pasteurisation de Holder et de l’homogénéisation par ultrasons sur la digestion du LM chez le nouveau-né. Un modèle de digestion in vitro a été mis en place pour évaluer la digestion gastro-intestinale de LM cru (LMC) vs. LMP aux stades « nouveau-né à terme » ou « prématuré ». Une étude clinique a été menée chez des nouveau-nés prématurés pour comparer la digestion gastrique de (A) LMC vs. LMP et (B) LMP vs. LM pasteurisé et homogénéisé (LMPH).La pasteurisation et l’homogénéisation ont modifié la structure initiale du LM, ses cinétiques digestives et sa désintégration structurale. In vitro, la pasteurisation a réduit la lipolyse gastrique au stade à terme, alors qu’aucun impact n'a été observé au stade prématuré. La lipolyse intestinale, in vitro, a été réduite. In vivo, la pasteurisation a accélérée la protéolyse gastrique de la lactoferrine et a réduit celle de l’a-lactalbumine. L'homogénéisation a accéléré la lipolyse et la protéolyse de l'albumine sérique. Concernant les conditions physiologiques, l’activité lipolytique postprandiale était augmentée après adm / When breastfeeding is not possible, pasteurized human milk (PHM) from milk banks is preferentially administered, especially for vulnerable hospitalized newborns. Holder pasteurization (62.5°, 30 min) is applied for sanitary reasons but may reduce fat absorption through inactivation of milk endogenous lipases. This could be counteracted by homogenization of PHM through an increase of the specific surface available for enzyme adsorption. The objective of this thesis was to study the impact of Holder pasteurization and ultrasonic homogenization on the digestion of HM in the newborn. An in vitro dynamic model was used to evaluate the gastrointestinal digestion of raw HM (RHM) vs. PHM at preterm and term stages. A clinical trial was conducted on hospitalized preterm newborns for comparing the gastric digestion of (A) RHM vs. PHM and (B) PHM vs. pasteurized-homogenized HM (PHHM). Pasteurization and homogenization affected the HM initial structure and its digestive kinetics and structural disWhile gastric lipolysis was reduced after pasteurization in term in vitro study, no impact was observed at the preterm stage. Intestinal lipolysis, in vitro, was reduced by pasteurization. Gastric proteolysis was selectively affected by pasteurization, being, in vivo, faster for lactoferrin and slower for a-lactalbumin. Homogenization increased lipolysis and proteolysis of serum albumin. Some physiological gastric conditions were affected by treatments: RHM had enhanced postprandial lipolytic activity and PHHM had a reduced gastric emptying time. The in vivo data described here may help to i

Pour satisfaire l'intérêt grandissant des Québécois pour la consommation de fromage Cheddar, les transformateurs laitiers font face au défi du maintien de la grande qualité de leurs produits. Plusieurs bactéries, levures et champignons du microbiote natif des fromages du terroir québécois ont précédemment été isolés et identifiés. Ces microorganismes sont responsables des propriétés sensorielles typiques des fromages québécois par leurs diverses activités enzymatiques pendant l'affinage, notamment la protéolyse qui module la texture des fromages pendant l'affinage. En premier lieu, un criblage de souches de bactéries lactiques a été réalisé à l'aide d'une méthode basée sur la caractérisation de la texture, mais a été remplacée par la détermination de l'activité protéolytique. Au total, dix souches bactériennes et sept de levures ont été criblées. L'activité lipolytique a aussi été ajoutée comme paramètre de criblage pour son potentiel impact sur la texture. Pour ce faire, des milieux caséinate de calcium et tributyrine ont été inoculés individuellement avec les souches pour le criblage de la protéolyse et la lipolyse, respectivement, et incubés à 15 °C et 25 °C, pendant 21 jours. Deux souches, Latilactobacillus curvatus (LMA-11) et Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802), se sont démarquées par leur forte capacité protéolytique à 15 °C. Ensuite, les souches ont été ajoutées individuellement à la production à l'échelle pilote de fromages de type Cheddar affinés de manière accélérée pendant 64 jours à 13 °C afin de vérifier leur impact sur la protéolyse et la texture. Les suivis de la population bactérienne, de la composition, du pH et du profil de texture (TPA) ont aussi été réalisés après 5, 22, 43 et 64 jours d'affinage. Aucune des deux souches n'a apporté de changements significatifs au niveau de la composition, de la protéolyse, ni de la texture pendant l'affinage. Cependant, Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) a mieux persisté pendant l'affinage et a réduit le compte bactérien du ferment significativement. Ces nouvelles données suggèrent que les souches Latilactobacillus curvatus (LMA-11) et Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) n'induisent pas de défaut de composition ni de texture, mais un affinage prolongé aurait peut-être permis de cerner un impact sur l'un ou l'autre de ces paramètres. Il est possible d'émettre l'hypothèse que Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) aurait permis de réduire la viabilité du ferment, et possiblement son autolyse, ce qui peut ainsi libérer des peptidases intracellulaires qui peuvent moduler les saveurs du fromage Cheddar. / To satisfy the growing interest of Quebecers for Cheddar cheese consumption, dairy processors are facing the challenge of maintaining the high quality of the cheeses. Several bacteria, yeasts, and molds of the native microbiota of Quebec cheeses have been previously isolated and identified. These microorganisms are responsible for the typical sensory properties of Quebec cheeses through their various enzymatic activities during ripening, among which proteolysis, which modulates the texture of cheeses during ripening. First, a screening of lactic acid bacteria was performed using a texture-based method but was replaced by the detection of the proteolytic activity of the strains. A total of ten bacterial strains and seven yeasts were screened. The lipolytic activity was also added as a screening parameter. For this purpose, calcium caseinate and tributyrin media were inoculated with the strains individually for proteolysis and lipolysis screening, respectively, and incubated at 15°C and 25°C, for 21 days. Two strains, Latilactobacillus curvatus (LMA-11) and Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans (LMA-1802), stood out for their high proteolytic activity at 15 °C. Then, the strains were added individually to pilot-scale production of Cheddar-type cheeses aged using an accelerated ripening protocol for 64 days at 13°C to determine their impact on proteolysis and texture. Monitoring of bacterial population, composition, pH, and texture profile (TPA) were also performed after 5, 22, 43 and 64 days of ripening. Neither strain showed changes in composition, proteolysis, or texture during maturation. However, Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans (LMA-1802) persisted better during ripening and reduced the bacterial count of the starter culture significantly. These new data suggest that, at least, Latilactobacillus curvatus (LMA-11) and Lacticaseibacillus paracasei ssp. tolerans (LMA-1802) strains do not induce compositional or textural defects, but extended ripening might have identified an impact on either of these parameters. It is possible to hypothesize that Lacticaseibacillus paracasei subsp. tolerans (LMA-1802) reduced the viability of the starter culture and could have possibly induced its autolysis, which can then release intracellular peptidases that may modulate the flavors of Cheddar cheese.

La fabrication du Cheddar repose sur plusieurs facteurs, le choix du ferment est l’un des plus déterminants pour la formation du caillé. Les ferments utilisés peuvent être des mélanges de souches, qui n’ont pas toutes les mêmes performances, ce qui entrainent une grande variation dans la qualité du fromage obtenu. L’objectif de cette étude est d’examiner chez 19 souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris, certaines caractéristiques d’intérêt technologique tel que l’acidification, la protéolyse et l’autolyse afin d’évaluer leur potentiel pour un éventuel usage dans des ferments dans le but d’optimiser la qualité du fromage avec des caractéristiques constantes. Le test de Pearce est utilisé pour se rapprocher le plus des conditions fromagères. À la suite de ce test, les activités enzymatiques (protéolytique et autolytique) ont été mesurées. L’activité autolytique varie de 424 mU/ml pour la souche 73 à 47 mU/ml pour la souche 83. Pour l’activité protéolytique, on a utilisé deux substrats, MS-Arg et S-Glu. Deux souches (SK11 et E2) se sont distinguées par une activité S-Glu (2,81 et 4,40 mU/ml) plus élevée que Ms-Arg (0 et 0,55mU/ml) dans un tampon sans le NaCl, alors que pour les autres souches, l’activité d’hydrolyse de Ms-Arg était supérieure. La souche E2 a la meilleure activité PepN (14,43 mU/ml) alors que ce sont les souches 83 et E2 qui ont la plus forte activité PepX (40,01 et 20,29 mU/ml). En se basant sur ces résultats, 12 ferments constitués de 3 souches ont été formulés. Les paramètres recherchés pour avoir un ferment considéré comme idéal sont une production d'acide lactique rapide, une activité peptidasique sans génération d'amertume et une capacité d'autolyse dans le fromage. Dans cette étude, une méthode simple et rapide est utilisèe pour caractériser les activités enzymatiques des souches, qui pourrait être utilisée par l’industrie et les résultats obtenus pourraient servir à l’élaboration de nouveaux ferments. / The manufacture of Cheddar is based on several factors; the choice of the ferment is one of the most determining factors for the formation of the curd. The ferments used may be mixtures of strains, which do not all have the same performance, which results in a large variation in the quality of the cheese obtained. The objective of this study was to examine 19 strains of Lactococcus lactis ssp. cremoris, certain characteristics of technological interest such as acidification, proteolysis and autolysis in order to evaluate their potential for eventual use in ferments in order to optimize the quality of the cheese with constant characteristics. The Pearce test is used to get closer to cheese conditions by following a temperature diagram specific to the manufacture of Cheddar. Following this test, enzymatic activities (proteolytic and autolytic) were measured. Autolytic activity varies from 424 mU / ml for strain 73 to 47 mU / ml for strain 83. For proteolytic activity, two substrates, MS-Arg and S-Glu, were used. Two strains (SK11 and E2) were distinguished by higher S-Glu activity (2.81 and 4.40 mU / ml) than Ms-Arg (0 and 0.55 mU / ml) in buffer without NaCl, whereas for the other strains the Ms-Arg hydrolysis activity was greater. The E2 strain has the best PepN activity (14.43 mU / ml) whereas strains 83 and E2 have the highest PepX activity (40.01 and 20.29 mU / ml). Based on these results, 12 ferments consisting of 3 strains were formulated. The desired parameters for a ferment considered as ideal are a rapid lactic acid production, a peptidase activity without generation of bitterness and an autolysis capacity in the cheese. In this study, a simple and rapid method was used to characterize the enzymatic activities of the strains, which could be used by the industry and the results obtained, could be used to develop new ferments.

Les calpaïnes sont des protéases à cystéine de type papaïne identifiées depuis plusieurs décennies. Parce que leur expression est cytosolique et parce que leur activité est contrôlée par la concentration de Ca2+, il est maintenant admis qu'elles jouent un rôle essentiel dans la signalisation intracellulaire. Elles participent ainsi au contrôle de l'apoptose, de la prolifération, de l'adhérence à la matrice extracellulaire et de la mobilité cellulaire. Il n'est donc pas étonnant qu'elles soient impliquées dans les pathologies lourdes (dystrophies musculaires, ischémies, dégénérescences neuronales, mobilité cellulaire invasive). L'objectif de nos recherches est d'élucider les mécanismes d'activation de différentes calpaïnes (Capn1,Capn2, Capn3) et les voies de signalisation qu'elles mettent en jeu. En effet, l'association de la calpaïne 3 avec la titine est un élément essentiel dans la régulation et l'activation de la protéase. Dans ce cadre, ce travail visait à caractériser les interactions moléculaires des calpaïnes 1 et 3 avec la région N1 de la titine humaine. Nous avons pu montré que cette région pouvait fixer très fortement du calcium permettant la polymérisation des molécules de titine. Cette structuration calcium dépendante conditionne la fixation de la µ-calpaïne sur le domaine I4 de la titine. La seconde partie du travail a permis de caractériser la colocalisation de la calpaïne 3 avec la calpaïne 1 au niveau du domaine I5. A l'inverse de la µ-calpaïne , l'association de la calpaïne 3 ne semble pas dépendre de la structure de la titine mais plutôt des changements structuraux pouvant intervenir sur la protéase elle-même quand elle fixe du calcium. A la lumière de ces résultats, la titine apparaît comme un régulateur de l'action calpainolytique

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l'état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d'une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l'Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd'hui un nombre croissant d'études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j'ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l'inhibition de la NME cytoplasmique. J'ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j'ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l'activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l'existence d'un mécanisme ubiquitaire associé à la NME.