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Anti-Candida activity of the human gut metabolome

Garcia-Rangel, Carlos-Enrique January 2018 (has links)
L’intestin humain contient une variété de microbes commensaux qui sont représentés par divers organismes appartenant aux trois domaines de la vie où les Eukarya sont essentiellement représentés par le règne des champignons. La levure commensale et opportuniste Candida albicans a été identifiée comme étant le champignon le plus commun dans l’intestin des humains sains. Des études récentes soutiennent que malgré leur faible abondance les levures du genre Candida peuvent altérer l'équilibre du microbiote et conduire à des dysbioses ou des pathologies récurrentes comme la maladie de Crohn et les colites ulcéreuses. Il a été démontré que le microbiote commensal joue un rôle essentiel dans la protection de l’intestin contre la colonisation par des bactéries pathogènes et des pathobiontes. Cependant, jusqu'à présent, on ignore si la prolifération ou la pathogénicité de C. albicans peuvent être contrôlées par d'autres microbiotes fécaux. Dans cette étude, nous avons démontré que le métabolome microbien de l'intestin humain exerce une activité antifongique contre C. albicans et d’autres levures qui résident au niveau intestinal. Ces métabolites inhibent plusieurs traits de virulence de C. albicans incluant la filamentation et l'invasion des cellules humaines. De plus, un crible génétique chez C. albicans a suggéré que TOR est la cible moléculaire de la ou des molécules antifongiques du métabolome microbien de l'intestin humain. / The human gut contains a variety of commensal microbes which are composed of diverse organisms that belong to all three domains of life with Eukarya primarily represented by fungi. The commensal / opportunistic yeast Candida albicans has been reported as the most common fungus in the gut of healthy humans. Recent evidences support that, this small fraction can alter the microbiota equilibrium leading to dysbiosis and diseases like inflammatory bowel diseases. It has been demonstrated that commensal microbiota plays a critical role in the protection of the gut against colonization by other bacterial pathogens and pathobionts. However, so far, whether C. albicans overgrowth or pathogenicity are controlled by other fecal microbiota is not known. In this study, we showed that the human microbial gut metabolome (GM) exerts an antifungal activity against different intestinal-resident yeasts including hyphal growth and the invasion of human enterocytes of C. albicans. Furthermore, a genetic screen in C. albicans suggested that TOR is the molecular target of the antifungal molecule(s) of the GM.
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Développement d'outils computationnels pour une approche de métabolomique non ciblée par spectrométrie de masse à haut débit

Plante, Pier-Luc 05 March 2023 (has links)
La métabolomique est l'étude des petites molécules produites par un système biologique. L'objectif principal des études en métabolomique non ciblées est la recherche d'une signature moléculaire, à base de biomarqueurs, permettant de distinguer deux phénotypes(ex. : malade et sain). Elle trouve des applications dans le domaine de la santé, de la nutrition, de l'agroalimentation et même de l'environnement. La spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide est une des techniques les plus utilisées puisqu'elle offre sensibilité et spécificité lors de l'étude du métabolome. Par contre, le long temps d'analyse limite la taille et la portée des études métabolomiques. De nouvelles approches de métabolomique non ciblée à haut débit par spectrométrie de masse où un échantillon peut être analysé en quelques secondes peuvent cependant éliminer cette barrière. Ce changement de paradigme entraîne une complexification des différentes étapes de l'analyse de données (prétraitement, recherche de biomarqueurs et identification des métabolites). Dans le cadre de cette thèse, nous proposons différents outils basés sur l'apprentissage automatique visant à résoudre les problèmes d'analyse de données causés par une accélération de la vitesse d'acquisition et une augmentation du nombre d'échantillons. Premièrement, nous proposons une série d'algorithmes de correction et d'alignement de spectres de masse visant à les rendre comparables afin de permettre les analyses statistiques et l'apprentissage automatique. Deuxièmement, nous présentons MetaboDashboard, un outil visant à simplifier et à démocratiser l'utilisation de l'apprentissage automatique pour la recherche de biomarqueurs en métabolomique non ciblée. Un exemple de son utilisation dans le contexte d'une infection virale des voies respiratoires est présenté. Finalement, un réseau de neurones appelé DeepCCS permettant la prédiction de la section efficace dans l'objectif de supporter l'identification des métabolites est exposé. Nous démontrons, tout au long de cette thèse, l'utilité et la puissance de l'apprentissage automatique appliqué à la métabolomique non ciblée. Les outils computationnels présentés dans cette thèse sont le point de départ du développement d'une méthode de métabolomique non ciblée à haut débit. Nous espérons qu'ultimement, les contributions de cette thèse permettront la détection de biomarqueurs associés à différents phénotypes dans des populations entières avec un maximum de précision et à une vitesse encore jamais vue. / Metabolomics is defined as the study of small molecules produced by a biological system. The main objective of metabolomic studies is the search of a molecular signature, constituted of biomarkers, that allow to distinguish two phenotypes (ex: sick and healthy). It can be applied to diverse fields such as health, nutrition, food and environment. Mass spectrometry coupled to liquid chromatography is the most common technique used in metabolomics since it offers sensibility and specificity. Unfortunately, the long running time of these analysis limits the size and impact of metabolomic studies. New approaches in high-throughput untargeted metabolomics, where a sample can be analyzed in seconds, try to overcome this limitation. This new paradigm increases the complexity of the different data analysis steps that follows that acquisition (data pre-treatment, biomarker discovery and metabolite identification). In this thesis, we propose different tools based on machine learning that aim at solving the new data analysis issues that arise from the increased number of samples and throughput. First, we present new algorithms to correct and align mass spectra to make them comparable in order to enable statistical analysis and machine learning. Second, we present MetaboDashboard, a tool that aims at simplifying and democratizing the use of machine learning approach for biomarker discovery in the context of untargeted metabolomics. An example of its usage in the context of viral respiratory tract infection is then presented. Finally, a neural network tool called DeepCCS, that allow the prediction of collisional cross section for metabolite identification is reported. Throughout this thesis, we demonstrate the use and impact of machine learning applied to different problems in untargeted metabolomics. The computational tools presented in this thesis are the first steps towards the development of new methods in high-throughput untargeted metabolomics. We hope that ultimately, the scientific contributions presented in this thesis will enable biomarker discovery for different phenotypes at the scale of whole population with a level of precision and speed never seen before.
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Etude de la spéciation chimique de la collection nationale de violettes et mise en place d'un agro-raffinage de la violette de Toulouse

Chervin, Justine 09 November 2018 (has links) (PDF)
Le projet « Viola Tolosa » a pour objectif de valoriser une plante produite en Occitanie, la violette et plus particulièrement l’emblématique violette de Toulouse, pour des domaines essentiellement non alimentaires tels que la chimie des substances naturelles et la cosmétique. Les violettes appartiennent au genre Viola qui comprend plus de 500 espèces. Aujourd’hui, leurs usages sont principalement limités à des aspects ornementaux et culinaires. Néanmoins, l’intérêt croissant de la part des acteurs de la filière (industriels, cultivateurs et académiques) a conduit la région Occitanie à mettre en place le projet Viola Tolosa intitulé « Spéciation chimique de la collection nationale des violettes et mise en place d’un agro-raffinage de la violette de Toulouse ». Il comporte quatre aspects interdisciplinaires associant aspects fondamentaux et applicatifs. La caractérisation de la centaine de plants de la collection de violettes détenue par les serres municipales de Toulouse, identifiée à 80% par des noms de cultivars ou vernaculaires, a été réalisée par l’intermédiaire d’études génétique et chimiotaxonomique. Une première étude génétique basée sur les séquences des espaces internes transcrits a permis de classer 58% de la collection au rang d’espèce. Cette étude phylogénétique a été complétée par une étude chimiotaxonomique à l’aide des profils chimiques des fractions volatiles des fleurs et non-volatiles des parties aériennes de la collection. Une projection orthogonale de structures latentes a permis d’indexer 96% de l’ensemble des plants par un nom d’espèce. L’étude des métabolites secondaires non volatils des feuilles a été entreprise dans le but d’étudier le potentiel biologique des violettes, notamment les activités antioxydante, antifongique et inductrice des réponses immunitaires des plantes. L’étude détaillée d’un extrait hydroalcoolique de la violette de Toulouse a permis d’identifier huit composés antioxydants de la famille des flavonoïdes et des coumarines, dont trois ont été caractérisés par RMN 1D et 2D et deux de novo dérépliqués par réseau moléculaire. L’application sur l’ensemble de la collection a ensuite permis d’identifier six composés antioxydants, dont deux coumarines et quatre flavonoïdes, prépondérants chez deux espèces. Une relation espèce-activité a donc été mise en évidence. Au niveau des activités antifongiques, réalisées sur cinq souches de champignons, et de défenses végétales, par l’intermédiaire de l’étude de l’expression du gène marqueur « pathogenesis-related protein 1 », les résultats sont plus ambigus. Cependant, certaines espèces ont présenté une activité plus prononcée que les autres et ce criblage a permis de poser une hypothèse forte quant à l’implication des cyclotides. Finalement, l’ensemble de ces travaux a permis d’obtenir une carte d’identité des violettes de la collection (identification génétique, profil chimique, potentiel biologique) et une description semi-quantitative de l’ensemble des groupes chimiques est proposée par combinaison des données chromatographiques du détecteur Corona (CAD) et des données spectrales. Différentes méthodes d’extraction (électroporation, micro-ondes, CO2 supercritique et extraction hydroalcoolique) répondant aux préceptes de la chimie verte ont ensuite été comparées afin de sélectionner celle présentant le meilleur compromis entre le cahier des charges cosmétiques et l’enrichissement en molécules d’intérêt, en vue d’un transfert technologique.
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Étude métabolomique du phénotype sécrétoire de la prostate saine à l'aide d'un modèle ex vivo d'organoïdes

Frégeau-Proulx, Lilianne 20 February 2023 (has links)
La prostate est une glande du système reproducteur masculin ayant comme fonction la sécrétion de différents ions et molécules dans le liquide spermatique pour favoriser la fertilité masculine. Pour soutenir ces fonctions, les cellules épithéliales de prostate possèdent un métabolisme adapté. En effet, le zinc présent en grandes quantités dans les cellules épithéliales de prostate inhibe l'aconitase mitochondriale (ACO2) qui ne peut plus transformer le citrate en isocitrate, tronquant le cycle de Krebs de ces cellules. Le citrate ainsi produit et non utilisé par la cellule pour la production d'énergie est sécrété dans le liquide spermatique. En contexte tumoral, cette sécrétion de citrate par la prostate cesse par des mécanismes moléculaires encore largement inconnus. Afin de comprendre la reprogrammation du phénotype sécrétoire de la prostate dans ce contexte, il est nécessaire de comparer l'organe tumoral à l'organe sain, mais plusieurs incompréhensions demeurent quant au métabolisme de la prostate normale, à savoir comment ces cellules produisent de l'énergie avec un cycle de Krebs sévèrement tronqué, et quels nutriments sont utilisés par ces cellules pour soutenir une importante sécrétion de citrate. Par contre, aucun modèle actuellement disponible de prostate ne sécrète du citrate, complexifiant l'étude de ce phénotype sécrétoire. Le présent mémoire établit un protocole pour l'obtention d'organoïdes de prostate de souris, un nouveau modèle d'étude ex vivo reproduisant le phénotype sécrétoire de l'organe pour des études métabolomiques, en plus d'interroger les voies métaboliques qui alimentent leur synthèse de citrate. Nos résultats démontrent que plusieurs nutriments, par diverses voies métaboliques, permettent la synthèse de citrate dans les organoïdes obtenus, complexifiant les connaissances liées au métabolisme de la prostate saine. Une meilleure compréhension du métabolisme des organoïdes de prostate saine et tumorale pourrait offrir de nouvelles cibles de traitement au cancer de la prostate et à l'infertilité masculine. / The prostate is a gland of the male reproductive system whose function is to secrete various ions and molecules in the spermatic fluid to promote male fertility. To support these functions, the prostate epithelial cells have a unique metabolism. Indeed, zinc present in large quantities in prostate epithelial cells inhibits mitochondrial aconitase (ACO2) which can no longer transform citrate into isocitrate, thus truncating the tricarboxylic acid cycle (TCA) of these cells. The citrate produced and not used by the cells for energy production is secreted into the spermatic fluid. In the context of prostate cancer, this secretion of citrate by the prostate ceases by molecular mechanisms that remain largely unknown. In order to understand the reprogramming of the prostate secretory phenotype in this context, it is necessary to compare the tumor to the healthy organ, but several misunderstandings remain about the metabolism of the normal prostate, namely how these cells produce energy with a severely truncated TCA cycle, and which nutrients are used by these cells to support a substantial citrate secretion. A problem persists, no currently available model of the prostate reproduces this citrate secretion, complicating the study of this secretory phenotype. This master thesis establishes a protocol to obtain mouse prostate organoids, a novel ex vivo study model that reproduces the organ's secretory phenotype for metabolomic studies, in addition to examining the metabolic pathways that fuel the citrate synthesis of prostate epithelial cells. Our results demonstrate that several nutrients, through various metabolic pathways, enable citrate synthesis in our organoids, offering new insights about the metabolism of the healthy prostate. A better understanding of the metabolism of healthy and tumorous prostate organoids could offer new therapeutic targets for the treatment of prostate cancer and male infertility.
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Développement de l'approche métabolomique par couplage chromatographie liquide / spectrométrie de masse : application à la nutrition

Pereira, Hélène 01 February 2010 (has links) (PDF)
L'étude du métabolome est un challenge analytique important, de part la grande diversité chimique des métabolites présents à des concentrations très variables dans les matrices biologiques. Ce travail présente une stratégie analytique mettant en oeuvre le couplage chromatographie liquide / spectrométrie de masse afin d'acquérir des profils métaboliques de fluides biologiques et d'identifier des biomarqueurs potentiels de dysfonctionnements métaboliques. Une attention particulière a été donnée à l'étude des sources de variablité analytique, depuis l'étape de préparations d'échantillons jusqu'au traitement des données. Un protocole optimisé a été proposé et appliqué à une intervention nutrionnelle (ANR METAPROFILE). L'identification a été basée sur l'utilisation des bases de données, ainsi que sur l'interprétation des informations spectrales (profils isotopiques et fragmentations MSn)
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Etude intégrative et comparative du métabolisme primaire des fruits au cours de leur développement / Integrative and comparative study of primary metabolism of different species during fruit development

Roch, Léa 19 December 2018 (has links)
Le marché mondial des fruits représente des centaines de milliards d’euro par an et l’amélioration de la qualité organoleptique et nutritionnelle des fruits est l’un des principaux objectifs de ces dernières années. Le métabolisme primaire est une cible toute trouvée pour tenter de répondre à ces exigences. En effet c’est lui qui va fournir les briques nécessaires à la croissance et au développement, mais également les composés qui confèrent les valeurs gustatives tels que les sucres et les acides organiques. C’est pourquoi la compréhension de son fonctionnement au cours du développement des fruits est nécessaire. Pour cela le métabolisme primaire a été étudié chez huit espèces de fruits charnus qui diffèrent en termes de durée de développement, de taille de fruit, de famille botanique, de qualité gustative (sucrosité, acidité…), et sujettes ou non à une crise respiratoire au début de la maturation. Des données physiologiques et biochimiques ont été collectées tout au long du développement du fruit, de l’anthèse à la maturité physiologique. La modélisation de la croissance des fruits a permis de standardiser les stades de développement et ainsi d’améliorer la comparaison entre espèces. La composition de la biomasse a ensuite été caractérisée qualitativement et quantitativement par des approches analytiques ciblées et non ciblées mettant en évidence les similitudes et les différences de composition et d’évolution au cours du développement. Des modèles linéaires généralisés combinant la composition et les données de croissance ont été utilisés pour comparer différentes phases de développement du fruit et une analyse discriminante par régression des moindres carrés partiels (PLS-DA) a permis de séparer les fruits climactériques des non climactériques. Dans les deux cas, les composés des parois cellulaires, les protéines et les lipides interviennent dans la différentiation des groupes. Enfin, une étude détaillée du métabolome et de l’activome du fruit a été réalisée chez trois espèces de Solanacées. Elle montre qu’au sein d’une même famille botanique la régulation diffère au cours du développement, notamment au niveau du métabolisme des sucres et de la glycolyse. Ces travaux revisitent le caractère climactérique des fruits, le positionnant bien en amont du déclenchement de la crise respiratoire, et, plus généralement, permettent de mieux comprendre le métabolisme primaire au cours du développement du fruit. / The world fruit market represents hundreds of billions of euros per year and improving the organoleptic and nutritional quality of fruit has been one of the main objectives in recent years. Primary metabolism is a target that can be used to try and meet these requirements. Indeed, it provides the bricks necessary for growth and development but also the compounds that contribute to taste such as sugars and organic acids. Therefore, it is necessary to understand how it operates during fruit development. For this purpose, primary metabolism has been studied in eight species of fleshy fruits that differ in terms of development duration, fruit size, botanical family, taste quality (sweetness, acidity, etc.), and are subject or not to a respiratory crisis at the initiation of ripening. Physiological and biochemical data have been collected throughout the fruit development from anthesis to physiological maturity. Fruit growth modelling allowed standardizing the stages of development and thus improved comparison between species. The composition of biomass was then characterized qualitatively and quantitatively by targeted and non-targeted analytical approaches highlighting similarities and differences in composition and changes during development. Generalized linear models combining composition and growth data were used to compare different phases of fruit development and a discriminant partial least square regression analysis (PLS-DA) was used to separate climacteric and non-climacteric fruits. In both cases, cell wall compounds, proteins and lipids were involved in group differentiation. Finally, a detailed study of the fruit metabolome and activome was performed in three species of Solanaceae. It revealed that within the same botanical family, regulation differs during development, particularly for sugar metabolism and glycolysis. This work revisits the climacteric character of fruits, positioning it long before the onset of the respiratory crisis, and, more generally, provides a better understanding of primary metabolism during fruit development.
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Etude des effets multigénérationnels d'une exposition chronique à faible dose d'uranium par analyses omiques / Study of multigenerational effects of chronic low-dose uranium exposure by omic analysis

Grison, Stéphane 13 December 2018 (has links)
Pour enrichir les connaissances scientifiques sur les effets biologiques des radionucléides et risques des contaminations chroniques sur la descendance, une étude multigénérationnelle in vivo d’exposition a été réalisée à doses non toxiques d'uranium. Ce modèle, a permis de suivre les effets biologiques de l’uranium sur trois générations de rats (F0, F1 et F2) par des analyses cliniques et le suivi de marqueurs biologiques. Dans cette étude, des analyses métabolomiques, transcriptomiques et épigénomiques ont été réalisées à partir d’échantillons de sang, d’urine et de rein.Pour la première génération des rats contaminés (F0), des différences dépendant du sexe des animaux sont observables par l’analyse des niveaux d’expression géniques (ARNm et micro-ARN) dans les reins, des profils métabolomiques et biochimiques dans les reins, l’urine et le sang. Aucune modification épigénétique des profils de méthylation de l’ADN rénal n’est à noter. Pour les deux générations suivantes (F1 et F2), un effet multigénérationnel dépendant aussi du sexe des rats est observable au niveau des profils métabolomiques urinaires et rénaux ainsi qu’au niveau des profils épigénétiques de méthylation de l'ADN des reins. Une baisse de poids corporel et des reins a aussi été observée pour la troisième génération de rats chez les mâles (F2).En conclusion, les travaux de cette thèse montrent qu’une contamination chronique à faible dose d'uranium entraine des effets biologiques sur plusieurs générations de rats. Ils sont observables à différents niveaux moléculaires des systèmes de régulation cellulaires et dépendent du sexe des rats. Ces effets, étroitement liés à des systèmes biologiques intégrés, sont utiles à la compréhension des mécanismes biologiques des expositions à l'uranium et à l’évaluation des risques de nocivités à long termes. Dans le domaine de la radioprotection, ces résultats justifient la nécessité de considérer les dimorphismes sexuels des individus et les conséquences des expositions sur les générations à venir. / In order to deepen scientific knowledge regarding biological effects of radionuclides and associated risk to offspring, an in vivo multigenerational study of chronic exposure to a non-toxic dose of uranium was performed by monitoring three generation of rats (F0, F1 and F2). Clinical parameters and biological markers, including metabolomics, transcriptomics and epigenomics high throughput analysis were conducted in blood, urine and kidney samples.For the first generation of contaminated rats (F0) sex-differences to uranium effects were observed in kidney for gene expression (mRNA, miRNA) and in kidney, urine and blood for biochemical parameters and metabolomics profiles. No epigenetic modification of DNA methylation profiles was shown in kidney. For the next two generations (F1, F2), a multigenerational sex-specific effect is observed for both metabolomics and renal DNA methylation profiles of contaminated rats. Moreover, for the last generation of male rats (F2), a decrease of both total body and kidney weight was shown.In conclusion, low-dose chronic contamination of rats to uranium leads to multigenerational effects. Including sex-differences, they can be shown at different molecular levels of the cellular system. Depending of integrated system biology, data of this thesis are useful in the understanding of biological mechanisms of uranium effect and risk of delayed harmful effect. In the field of radiation protection, these results prove the requirement of considering sexual dimorphisms and consequences of such exposures to offspring.
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Etude métabolomique de la pathologie autistique / Metabolomic study of autism spectrum disorder

Diémé, Binta 17 March 2016 (has links)
Les TSA représentent un groupe de troubles neurodéveloppementaux défini par des déficits des interactions sociales, de la communication et des comportements restreints et répétitifs. A ce jour le diagnostic de l’autisme se fait uniquement sur la base de symptômes cliniques. Il n’existe aucun biomarqueur des TSA. Ce travail s’inscrit donc (1) dans la recherche de biomarqueurs prédictifs dans les TSA et (2) dans la mise en évidence des dysfonctions métaboliques cérébrales dans un modèle de rat (rat valproate, VPA). Pour mettre en évidence des biomarqueurs urinaires prédictifs nous avons analysé simultanément les données issues de plusieurs technologies analytiques afin d’améliorer la robustesse et la capacité prédictive des modèles statistiques. L’autre partie de la thèse consistait à caractériser et à comparer au cours du développement l’évolution du métabolome du rat VPA. Nous avons mis en évidence des perturbations des voies de la neurotransmission, énergétique, du stress oxydatif etc. Même si on ne peut pas transposer les résultats obtenus chez le rat, à l’homme, le modèle VPA permet néanmoins de mieux comprendre les perturbations physiologiques cérébrales induites par ce médicament. / ASDs are a group of neurodevelopmental disorders defined by deficits in social interaction, communication and restricted and repetitive behaviors. To date, the diagnosis of autism is made only on the basis of clinical symptoms. There is no biomarker of ASD. The aim of this work is (1) the search of predictive biomarkers in ASD and (2) the better understanding of brain metabolic dysfunctions in a rat model (valproate rat, VPA). To highlight urinary predictive biomarkers we analyzed together data from different analytical technologies in order to improve the robustness and predictive power of statistical models. The second part of the thesis was to characterize and compare the cerebral metabolome of VPA rat during development. We showed disturbances of neurotransmission, energy, oxidative stress pathways. Even if results obtained in rats cannot be transposed to humans, the VPA model still allows a better understanding the brain physiological disturbances induced by the drug.
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Valorisation de métabolites secondaires issus de micro-algues : approches métabolomiques, isolement et caractérisation structurale / Valorisation of secondary metabolites from microalgae : metabolomics approaches, isolation and structural caracterisation

Audoin, Coralie 27 September 2013 (has links)
Les microalgues présentes à la fois dans les eaux douces et salées compteraient plus de 200 000 espèces. Cette diversité en fait une source potentielle de métabolites spécialisés originaux. Parmi les principales familles de substances naturelles valorisées actuellement, on peut citer les pigments, lipides, protéines, polysaccharides, caroténoïdes. Une vision plus globale du métabolome de chacune des espèces apparaît aujourd’hui nécessaire pour mieux mettre en valeur le potentiel commercial que représente cette « microbiodiversité ». Pour cela, nous avons tout d’abord choisi d’approcher le métabolome de différentes souches de microalgues cultivées au sein de la Société Greensea en s’appuyant sur les techniques d’HPTLC, de RMN et d’UHPLC-QTOF pour une visualisation large. Cette étude nous a permis de regrouper les espèces par analogie métabolique après traitement statistique des données. Une seconde partie a consisté en une étude phytochimique approfondie de certaines souches et a conduit à l’isolement et la caractérisation de plusieurs molécules. Ainsi, en plus de métabolites connus, un peptide original portant un motif isoprényl, le cumbriamide a été caractérisé au sein de Lyngbya sp. et une première évaluation de son potentiel thérapeutique a été entreprise. Une large diversité en glycolipides s’est montrée prépondérante dans de nombreuses souches et une méthode de caractérisation a pu être mise au point pour leur identification par UHPLC-QTOF. Enfin, différentes applications des approches métabolomiques ont été envisagées. Ainsi, des études chimiotaxonomiques ont été menées sur les différentes souches de microalgues et l’influence de changements de conditions de culture sur la production de métabolites chez Nannochloropsis oculata a été observée. / Microalgae are present both in Oceans and freshwaters and could include more than 200 000 species. This diversity is a source of original specialized metabolites that can find a large array of applications. Pigments, lipids, proteins, polysaccharides and carotenoids are usual compounds produced by microalgae that have found commercial applications. A global vision of the metabolome of each species has showed promises to highlight the commercial value of this “microdiversity”. We then decided to assess the metabolome of several microalgae species grown at the Greensea company by using HPTLC, NMR and UHPLC-QTOF techniques for a rapid and global overview. A classification of the species according to their metabolomics similarities was obtained after statistics treatment of the data. A second part was dedicated to a phytochemical study of the extracts of selected strains and led to the isolation and characterization of several metabolites. Thus, in addition to known molecules, an original peptide substituted by an isoprenyl moiety and named cumbriamide has been characterized in Lyngbya sp and a first assessment of its therapeutical potential has been undertaken. Glycolipids have been identified as the major metabolites in the extracts of numerous strains and a UHPLC-QTOF method was developed for their identification. Finally, several applications of the metabolomics approaches were considered. Chemotaxonomic studies were first carried out and the influence of growth conditions on the metabolome of Nannochloropsis oculata was observed.
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Etudes métabolomiques du métabolisme du carbone des stades érythrocytaires asexués du parasite du paludisme humain Plasmodium falciparum. / Use of metabolomics to decipher parasite carbon metabolism of asexual erythrocytic stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum

Sethia, Sonal 24 June 2015 (has links)
Le paludisme est une des maladies tropicales les plus dévastatrices au monde causée par des parasites protozoaires intracellulaires du genre Plasmodium. Cinq espèces de plasmodies sont responsables du paludisme chez l'homme et causent 600 000 décès par an principalement chez les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes vivant dans les régions les plus pauvres du globe. Les parasites ont généré une résistance contre les chimiothérapies existantes et aucun vaccin efficace n'est encore disponible. Il est donc impératif d'identifier et de valider de nouvelles cibles qui peuvent être exploitées pour la découverte de nouveaux médicaments.Cette étude a porté sur la caractérisation d'un enzyme, la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC), produit d'un gène spécifique au parasite et absent chez l'hôte humain, ce qui constitue l'un des pré-requis d'une cible potentielle pour la découverte de médicaments. Le gène avait été montré comme essentiel pour des parasites seulement en absence de malate ou de fumarate, suggérant un rôle de la protéine dans le métabolisme du carbone intermédiaire des parasites.Mes études de thèse avaient pour but de caractériser le rôle de la PEPC en utilisant la métabolomique. J'ai d'abord établi et normalisé une méthodologie d'analyses métabolomiques des globules rouges infectés par Plasmodium et optimisé l'analyse des métabolites hydrophiles présents dans le parasite intracellulaire et sa cellule hôte. Nous nous sommes concentrés sur les métabolites du métabolisme du carbone intermédiaire, où la PEPC pouvait jouer un rôle déterminant par analogie avec les plantes et les bactéries. Des analyses ciblées utilisant un marquage isotopique du métabolome à partir de 13C-U-glucose, 13C-bicarbonate et 13C, 15N-glutamine ont aussi été réalisées permettant de mieux appréhender les conséquences d'un KO de l'enzyme PEPC sur le métabolisme du parasite.Les données montrent que l'enzyme PEPC permet une fixation du bicarbonate et catalyse une réaction anaplérotique conduisant à du malate qui est introduit dans le cycle de l'acide tricarboxylique mitochondrial, transférant ainsi des équivalents réducteurs du cytoplasme à la mitochondrie et fournissant aussi un point d'entrée du squelette carboné dans le cycle. Les résultats montrent surtout que les parasites possèdent un cycle complet et de type oxydatif de l'acide tricarboxylique mitochondrial. Il parait y avoir trois points d'entrée: 1. l'acétyl CoA résultant du pyruvate généré par la glycolyse et décarboxylé dans la mitochondrie; 2. l'acide alpha-cétoglutarique provenant du glutamate, qui lui-même résulte de la désamination de la glutamine essentiellement fournie par l'environnement externe; 3. le malate, produit en aval de la malate déshydrogénase qui réduit l'oxaloacétate produit par la PEPC. En aval de la PEPC, la biosynthèse des pyrimidines opère grâce à l'activité de l'aspartate aminotransférase agissant sur oxaloacétate.En dehors du malate, le fumarate est le seul autre métabolite qui permet de s'opposer au défaut de croissance des parasites déficients en PEPC, ce qui a conduit à évaluer le rôle de la fumarase. À cette fin, l'étiquetage du gène endogène fumarase avec une étiquette HA, a permis de montrer que la protéine est exprimée dans les stades intra-érythrocytaires de P. falciparum et de montrer que la protéine se trouve à la fois dans la mitochondrie et le cytoplasme. La protéine recombinante a été exprimée avec succès et partiellement caractérisée biochimiquement. De nombreuses tentatives visant à générer des mutants de délétion génétique de P. falciparum n'ont pas abouti, laissant en suspens la question du caractère essentiel du gène pour les parasites. Cependant, il est possible de cibler le locus du gène via un marquage C-terminal. Ceci suggère que l'enzyme peut être essentielle pour la survie du parasite et donc une cible exploitable pour la découverte d'un type nouveau de médicament antipaludique. / Malaria is one of the world's most devastating tropical diseases caused by obligate intracellular protozoan parasites of the genus Plasmodium. Five species of these parasites cause malaria in humans and infection results in ~600,000 deaths annually primarily in children under the age of 5 and pregnant women living in the poorest areas of the globe. The parasites have an outstanding ability to generate resistance against existing chemotherapies and an efficacious vaccine is not available yet. Therefore it is imperative that attempts are being made to identify and validate new targets that can be exploited for future drug discovery.This study focused on the validation and elucidation of a parasite-specific gene product namely phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC), which is not present in the human host and thus has one of the pre-requisites of a potential drug target. The gene had been previously genetically validated and it was demonstrated that mutant parasites lacking pepc were only viable in the presence of malate or fumarate, suggesting a role of the protein in intermediary carbon metabolism of the parasites.My studies had the goal to assess the role of PEPC using a metabolomics approach. Initially the methodologies to perform metabolomics analyses of Plasmodium-infected RBCs were established and standardised and it was assessed how to best analyse the hydrophilic metabolites present in the intracellular parasites and its host cell. We focused on metabolites of intermediary carbon metabolism, as it is likely that PEPC is important for metabolic functions linked to this in the parasites, in analogy to plants and bacteria. While global metabolomics analyses were appealing, it was decided to apply a targeted metabolomics and comparative approach using stable isotope labelling of the parasite metabolomes with 13C-U-glucose, 13C-bicarbonate and 13C-,15N-glutamine to assess the consequences of the pepc knockout on parasite metabolism.The data demonstrated that PEPC has an anaplerotic function fixing bicarbonate and leading to generation of malate that is fed into the mitochondrial tricarboxylic acid cycle and so transfers reducing equivalents from cytoplasm to mitochondrion as well as providing an entry point of carbon skeleton into the cycle. The most important findings with respect to parasite mitochondrial metabolism were that the parasites possess a complete and oxidative tricarboxylic acid cycle, which appears to have three entry points: 1. Acetyl CoA resulting from glycolytically generated pyruvate that is decarboxylated in the mitochondrion; 2. α-ketoglutarate from the reaction of glutamate dehydrogenase and 3. malate, which is a downstream product of malate dehydrogenase that reduces oxaloacetate the reaction product of PEPC. Other downstream reactions supported by PEPC activity are pyrimidine biosynthesis through the activity of aspartate aminotransferase also acting on the PEPC-derived oxaloacetate.Apart from malate, fumarate was the only other metabolite that reversed the growth defect of pepc mutant parasites. Hence the role of fumarase in the parasites was also assessed. To this end the endogenous fumarase gene of P. falciparum was tagged with an HA-tag, which showed that the protein is expressed in the intra-erythrocytic stages of P. falciparum and demonstrated that the protein is located in both mitochondrion and cytoplasm. In addition, the recombinant protein was produced and partially biochemically characterised. Numerous independent attempts to generate genetic deletion mutants of P. falciparum were unsuccessful, leaving the question whether the gene is essential for the parasites unanswered. However, it was possible to manipulate the locus by C-terminal tagging of the fumarase gene suggesting that fumarase might be indeed essential for parasite survival and therefore possibly suitable for future drug design and discovery.

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