Le paludisme est une des maladies tropicales les plus dévastatrices au monde causée par des parasites protozoaires intracellulaires du genre Plasmodium. Cinq espèces de plasmodies sont responsables du paludisme chez l'homme et causent 600 000 décès par an principalement chez les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes vivant dans les régions les plus pauvres du globe. Les parasites ont généré une résistance contre les chimiothérapies existantes et aucun vaccin efficace n'est encore disponible. Il est donc impératif d'identifier et de valider de nouvelles cibles qui peuvent être exploitées pour la découverte de nouveaux médicaments.Cette étude a porté sur la caractérisation d'un enzyme, la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC), produit d'un gène spécifique au parasite et absent chez l'hôte humain, ce qui constitue l'un des pré-requis d'une cible potentielle pour la découverte de médicaments. Le gène avait été montré comme essentiel pour des parasites seulement en absence de malate ou de fumarate, suggérant un rôle de la protéine dans le métabolisme du carbone intermédiaire des parasites.Mes études de thèse avaient pour but de caractériser le rôle de la PEPC en utilisant la métabolomique. J'ai d'abord établi et normalisé une méthodologie d'analyses métabolomiques des globules rouges infectés par Plasmodium et optimisé l'analyse des métabolites hydrophiles présents dans le parasite intracellulaire et sa cellule hôte. Nous nous sommes concentrés sur les métabolites du métabolisme du carbone intermédiaire, où la PEPC pouvait jouer un rôle déterminant par analogie avec les plantes et les bactéries. Des analyses ciblées utilisant un marquage isotopique du métabolome à partir de 13C-U-glucose, 13C-bicarbonate et 13C, 15N-glutamine ont aussi été réalisées permettant de mieux appréhender les conséquences d'un KO de l'enzyme PEPC sur le métabolisme du parasite.Les données montrent que l'enzyme PEPC permet une fixation du bicarbonate et catalyse une réaction anaplérotique conduisant à du malate qui est introduit dans le cycle de l'acide tricarboxylique mitochondrial, transférant ainsi des équivalents réducteurs du cytoplasme à la mitochondrie et fournissant aussi un point d'entrée du squelette carboné dans le cycle. Les résultats montrent surtout que les parasites possèdent un cycle complet et de type oxydatif de l'acide tricarboxylique mitochondrial. Il parait y avoir trois points d'entrée: 1. l'acétyl CoA résultant du pyruvate généré par la glycolyse et décarboxylé dans la mitochondrie; 2. l'acide alpha-cétoglutarique provenant du glutamate, qui lui-même résulte de la désamination de la glutamine essentiellement fournie par l'environnement externe; 3. le malate, produit en aval de la malate déshydrogénase qui réduit l'oxaloacétate produit par la PEPC. En aval de la PEPC, la biosynthèse des pyrimidines opère grâce à l'activité de l'aspartate aminotransférase agissant sur oxaloacétate.En dehors du malate, le fumarate est le seul autre métabolite qui permet de s'opposer au défaut de croissance des parasites déficients en PEPC, ce qui a conduit à évaluer le rôle de la fumarase. À cette fin, l'étiquetage du gène endogène fumarase avec une étiquette HA, a permis de montrer que la protéine est exprimée dans les stades intra-érythrocytaires de P. falciparum et de montrer que la protéine se trouve à la fois dans la mitochondrie et le cytoplasme. La protéine recombinante a été exprimée avec succès et partiellement caractérisée biochimiquement. De nombreuses tentatives visant à générer des mutants de délétion génétique de P. falciparum n'ont pas abouti, laissant en suspens la question du caractère essentiel du gène pour les parasites. Cependant, il est possible de cibler le locus du gène via un marquage C-terminal. Ceci suggère que l'enzyme peut être essentielle pour la survie du parasite et donc une cible exploitable pour la découverte d'un type nouveau de médicament antipaludique. / Malaria is one of the world's most devastating tropical diseases caused by obligate intracellular protozoan parasites of the genus Plasmodium. Five species of these parasites cause malaria in humans and infection results in ~600,000 deaths annually primarily in children under the age of 5 and pregnant women living in the poorest areas of the globe. The parasites have an outstanding ability to generate resistance against existing chemotherapies and an efficacious vaccine is not available yet. Therefore it is imperative that attempts are being made to identify and validate new targets that can be exploited for future drug discovery.This study focused on the validation and elucidation of a parasite-specific gene product namely phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC), which is not present in the human host and thus has one of the pre-requisites of a potential drug target. The gene had been previously genetically validated and it was demonstrated that mutant parasites lacking pepc were only viable in the presence of malate or fumarate, suggesting a role of the protein in intermediary carbon metabolism of the parasites.My studies had the goal to assess the role of PEPC using a metabolomics approach. Initially the methodologies to perform metabolomics analyses of Plasmodium-infected RBCs were established and standardised and it was assessed how to best analyse the hydrophilic metabolites present in the intracellular parasites and its host cell. We focused on metabolites of intermediary carbon metabolism, as it is likely that PEPC is important for metabolic functions linked to this in the parasites, in analogy to plants and bacteria. While global metabolomics analyses were appealing, it was decided to apply a targeted metabolomics and comparative approach using stable isotope labelling of the parasite metabolomes with 13C-U-glucose, 13C-bicarbonate and 13C-,15N-glutamine to assess the consequences of the pepc knockout on parasite metabolism.The data demonstrated that PEPC has an anaplerotic function fixing bicarbonate and leading to generation of malate that is fed into the mitochondrial tricarboxylic acid cycle and so transfers reducing equivalents from cytoplasm to mitochondrion as well as providing an entry point of carbon skeleton into the cycle. The most important findings with respect to parasite mitochondrial metabolism were that the parasites possess a complete and oxidative tricarboxylic acid cycle, which appears to have three entry points: 1. Acetyl CoA resulting from glycolytically generated pyruvate that is decarboxylated in the mitochondrion; 2. α-ketoglutarate from the reaction of glutamate dehydrogenase and 3. malate, which is a downstream product of malate dehydrogenase that reduces oxaloacetate the reaction product of PEPC. Other downstream reactions supported by PEPC activity are pyrimidine biosynthesis through the activity of aspartate aminotransferase also acting on the PEPC-derived oxaloacetate.Apart from malate, fumarate was the only other metabolite that reversed the growth defect of pepc mutant parasites. Hence the role of fumarase in the parasites was also assessed. To this end the endogenous fumarase gene of P. falciparum was tagged with an HA-tag, which showed that the protein is expressed in the intra-erythrocytic stages of P. falciparum and demonstrated that the protein is located in both mitochondrion and cytoplasm. In addition, the recombinant protein was produced and partially biochemically characterised. Numerous independent attempts to generate genetic deletion mutants of P. falciparum were unsuccessful, leaving the question whether the gene is essential for the parasites unanswered. However, it was possible to manipulate the locus by C-terminal tagging of the fumarase gene suggesting that fumarase might be indeed essential for parasite survival and therefore possibly suitable for future drug design and discovery.

La métabolomique consiste en l'analyse exhaustive du métabolome d'un système biologique qui est réalisée par l'utilisation conjointe d'une ou plusieurs techniques analytiques et d'outils chimiométriques. Elle permet une mesure globale de la réponse métabolique grâce à la caractérisation et à la quantification de métabolites dans un échantillon donné. Ici, la technique analytique utilisée a été la RMN du proton. Ce travail de thèse a permis d'appliquer la démarche métabolomique à quatre pathologies en se focalisant sur un aspect précis de chaque maladie. Un large éventail d'échantillons a été étudié, allant de lignées cellulaires à des échantillons humains en passant par des cerveaux de souris. La première pathologie étudiée a été le mélanome. Pour cela, des études ont été effectuées sur une lignée cellulaire de mélanome dans laquelle la protéine HIF-1a a été réprimée et sur des tumeurs de souris xénogreffées avec et sans traitement au vémurafénib. Enfin, une étude préliminaire a été réalisée sur des mélanomes de patients. Ces trois études ont montré d'importants désordres au niveau du métabolisme bio-énergétique. Une étude métabolomique sur la maladie d'Alzheimer constitue la deuxième partie de notre travail. Les profils métaboliques de liquides céphalo-rachidiens de sujets sains et de patients ont été comparés afin de mettre en évidence d'éventuelles modifications métaboliques. Dans la troisième partie, nous nous sommes intéressés à une maladie orpheline, l'hypophosphatasie, à travers la première analyse métabolomique de cerveaux d'un modèle murin de cette pathologie. La dernière partie décrit les différences métaboliques provoquées par des modifications structurales de la protéine IRE1 dans une lignée cellulaire de glioblastome. / Metabolomics consists in the general analysis of the metabolome of a biological system which is achieved by the use of one or more analytical techniques combined with chemometric tools. It allows an overall measurement of the metabolic response through the characterization and quantification of metabolites in a given sample. Herein, proton NMR was chosen as the analytical technique. This work allowed us to apply metabolomic study to four diseases. Our research focused on a specific aspect of each disease. A wide range of samples has been studied here, from cell lines to human samples through biopsies mouse brain. The first chapter is dedicated to the study of melanoma and deals with a human melanoma cell line in which the HIF-1a protein was restrained. Melanoma tumors of xenograft mice were studied with and without vemurafenib treatment. Thanks to these results, we were able to start a preliminary study concerning the tumors of human patients. These three studies show melanoma disorders within the bioenergetic metabolism. The second part of this work is related to the metabolomic study of Alzheimer's disease. Cerebrospinal fluids of healthy and diseased patients were compared to highlight any metabolic modification. In the third part, we present the first metabolomic study of a rare disease: hypophosphatasia. Furthermore, unlike the previous work concerning this disease, we chose to use murine model to detect any metabolic modification within mice brain. In the last part, a study of glioblastoma was performed to show metabolic differences due to changes in IRE1 protein in a glioblastoma cell line.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est devenue une des techniques spectroscopiques les plus puissantes et polyvalentes de la chimie analytique avec des applications multiples dans des différents domaines de la recherche. Cependant, un des inconvénients majeurs de la RMN est le processus fastidieux d'analyse de donnée qui nécessite fréquemment des interventions humaines. Ces dernières font diminuer non seulement l'efficacité et l'objectivité des études mais également renferment les champs d'applications potentielles de la RMN pour les non-initiés. Par conséquent, le développement des méthodes computationnelles non supervisées se trouve nécessaire. Les travaux réalisés ici représentent des nouvelles approches dans le domaine de la métabolomique et de la biologie structurelle. Le défi ultime de la RMN métabolomique est l'identification complète de l'ensemble des molécules constituant les échantillons biologiques complexes. Cette étape est vitale pour toute interprétation biologique. Dans la première partie de cette thèse, une nouvelle méthode numérique a été développée pour analyser des spectres à deux dimensions HSQC et TOCSY afin d'identifier les métabolites. La performance de cette nouvelle méthode a été démontrée avec succès sur les données synthétiques et expérimentales. La RMN est une des principales techniques analytiques de la biologie structurale. Le processus conventionnel de détermination structurelle est bien établie avec souvent une attribution explicite des signaux. Dans la seconde partie de cette thèse, une nouvelle approche computationnelle est présentée. Cette nouvelle méthode permet de déterminer les structures RMN sans attributions explicites des signaux. Ces derniers proviennent de données spectrales tridimensionnelles TOCSY et NOESY. Les structures ont été résolues en appliquant cette nouvelle méthode aux données spectrales d'une protéine de 12kDa. / Nuclear Magnetic Resonance (NMR) has become one of the most powerful and versatile spectroscopic techniques in analytical chemistry with applications in many disciplines of scientific research. A downside of NMR is however the laborious data analysis workflow that involves many manual interventions. Interactive data analysis impedes not only on efficiency and objectivity, but also keeps many NMR application fields closed for non-experts. Thus, there is a high demand for the development of unsupervised computational methods. This thesis introduces such unattended approaches in the fields of metabonomics and structural biology. A foremost challenge to NMR metabolomics is the identification of all molecules present in complex metabolite mixtures that is vital for the subsequent biological interpretation. In this first part of the thesis, a novel numerical method is proposed for the analysis of two-dimensional HSQC and TOCSY spectra that yields automated metabolite identification. Proof-of principle was successfully obtained by evaluating performance characteristics on synthetic data, and on real-world applications of human urine samples, exhibiting high data complexity. NMR is one of the leading experimental techniques in structural biology. However the conventional process of structure elucidation is quite elaborated. In this second part of the thesis, a novel computational approach is presented to solve the problem of NMR structure determination without explicit resonance assignment based on three-dimensional TOCSY and NOESY spectra. Proof-of principle was successfully obtained by applying the method to an experimental data set of a 12-kilodalton medium- sized protein.

Le profilage métabolomique global de matrices biologiques dans de larges séries d'échantillon est un enjeu majeur. Dans ce contexte, notre travail vise à développer des approches LC-HRMS et outils bioinformatiques pour les analyses métabolomique et lipidomique de larges cohortes. Dans un premier temps, nous avons développé puis évalué la pertinence de 4 méthodes LC-HRMS dans l'annotation du métabolome/lipidome sérique humain. Ainsi, une base de données spectrales a été implémentée à l'aide de spectres MS, MS/MS et les temps de rétention de composés de référence afin d'assurer l'annotation de jeux de données. La combinaison de méthodes RP, HILIC et PFPP-HRMS a permis l'identification de 266 métabolites et 706 espèces lipidiques sériques répartis sur 20 et 24 classes chimiques respectivement dont 27% d'espèces isomères. Ces outils ont été appliqués, dans un second temps, à la stratification de 78 patients diabétiques. Outre le syndrome métabolique marqué (perturbation du métabolisme énergétique), nos analyses ont montré l'impact délétère de facteurs physiologiques confondants -âge et IMC-. Nous en avons évalué l'influence sur une cohorte de 227 salariés du CEA. Les empreintes lipidomiques sont robustes, néanmoins l'impact de l'IMC est marqué pour les lipides neutres. L'effet du genre démontre un catabolisme masculin important. L'effet de l'âge se manifeste par des activités enzymatiques altérées. Ces études combinent une analyse globale métabolomique et lipidomique des mêmes échantillons humains. Elles visent à construire une base de données relationnelle incluant données spectrales et biologiques servant à la caractérisation de biomarqueurs dans le cas d'études cliniques. / Global metabolomic profiling of biological media in large sample sets is a major challenge. In this context, our work aims to develop LC-HRMS approaches and data mining tools for metabolomics and lipidomics analysis of large cohorts. We have first developed and evaluated the reliability of four LC-HRMS methods in the annotation of human serum metabolome and lipidome. Thus, spectral database was implemented using MS spectra, MS/MS and retention times of reference compounds to further ensure datasets annotation. The combination of RP, PFPP and HILIC-HRMS methods allowed identification of 266 metabolites and 706 lipid species in human serum over 20 to 24 chemical classes respectively including 27% of isomeric species. These analytical tools were then applied for the stratification of 78 diabetic patients. Unsurprisingly, we highlighted a metabolic syndrome (energy metabolism disruption), moreover our analyses have shown the deleterious impact of confounding physiological factors on diabetes biomarker discovery –age and BMI-. We finally evaluated their influence on a cohort of 227 CEA employees. Lipidomic fingerprints are robust, however BMI impact is marked for neutral lipids. Gender effect shows significant male catabolism and age altered enzyme activities. These studies combine an overall metabolomics and lipidomics analyses of the same human samples. They aim to build up a relational database including spectral and biological data for biomarker characterization in clinical studies.

Les expositions environnementales aux pesticides chez la femme enceinte sont une préoccupation de santé publique. L’association d’analyses métabolomiques par RMN chez l’Homme et l’animal a permis de tester l’utilité de cet outil dans l’étude des mélanges complexes. Les empreintes métaboliques proviennent des urines et du sang de cordon de plus de 300 femmes de la cohorte PELAGIE (Bretagne) et des urines, sang, foie et cerveaux de rates et de leurs fœtus exposés par voie orale durant la gestation à 8 pesticides représentatifs des expositions humaines. Une discrimination des profils métaboliques a été observée chez l’Homme en fonction de l’exposition estimée par la part de cultures de céréales dans la commune. Les modifications métaboliques suggèrent un mécanisme osmo-protecteur lié à un stress oxydant. Les données animales ont confirmé ces observations avec des modifications évoquant un dysfonctionnement mitochondrial. Les conséquences sanitaires associées restent à étudier. / Environmental exposure to pesticides is of growing interest in public health, especially in pregnant women. The combination of metabolomics analyses both in human and animal allows testing the utility of this tool in the study of complex mixtures and low-dose exposures. 1H NMR metabolic profiling was carried out on urinary samples collected at the first trimester of pregnancy and cord blood samples at birth for more than 300 women included in the PELAGIE cohort (Britany, France) and on urine, blood, liver and brain from rats and their fetuses orally exposed during the gestation to 8 pesticides representative of human exposures. Based on PLS-DA analyses, a good separation of the metabolic profiles was observed in human according to the percentage of area devoted to cereal crops in the town of residence. The metabolic modifications suggest an osmo-protective mechanism associated with an oxidative stress. Animal data confirmed this hypothesis with plasmatic, liver and brain metabolic changes suggesting a mitochondrial dysfunction. The associated health impacts are yet to be studied.

Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit porte sur la caractérisation de l’exposition des organismes aquatiques à un produit pharmaceutique (PP) et sur l’étude des perturbations métaboliques associées. Un PP récemment inclus dans la liste de vigilance de la directive cadre sur l’eau européenne (2015/495/EC), le DCF, et un organisme du milieu marin, Mytilus galloprovincialis, ont été choisis comme modèles de travail. L’approche méthodologique développée est une combinaison de l’analyse ciblée et non-ciblée des métabolites endogènes et exogènes (l’endo- et le xéno-métabolome) présents chez l’organisme d’étude suite à une exposition au DCF. L’évaluation des effets du DCF chez la moule par approche ciblée a été conduite sur la base de son mode d’action connu chez l’Homme : la modulation de la synthèse des prostaglandines (PG). Les PGs sont impliquées dans diverses fonctions, telles que la reproduction et l’osmorégulation chez les organismes aquatiques, et d’autres voies métaboliques sont susceptibles d’être impactées. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence une sous-modulation de la synthèse de la PGE2 chez les moules exposées au DCF. Par ailleurs, peu d’informations sont disponibles concernant la métabolisation du DCF chez les invertébrés. Pour étudier la biotransformation et les effets du DCF chez la moule, l’application d’une approche non-ciblée nous semblait prometteuse. L’étude du xéno-métabolome m’a permis de mettre en évidence la formation de 13 métabolites, dont 3 de phase I et 10 de phase II. Parmi ces métabolites, 5 sont référencés pour la première fois dans la littérature. Par la suite, l’étude de l’endo-métabolome a permis de révéler la modulation de deux voies métaboliques : le métabolisme de la tyrosine et le métabolisme du tryptophane. Les catécholamines et la sérotonine ressortent comme particulièrement impactées dans ces deux voies métaboliques. Chez la moule, ces métabolites sont impliqués dans des fonctions biologiques importantes : l’osmorégulation et la reproduction et sont en accord avec les études menées chez d’autres organismes aquatiques. Le travail effectué a permis de mettre en évidence que l’application de l’approche métabolomique à des questions environnementales est pertinente et performante pour étudier la biotransformation et les effets non-documentés (différent du mécanisme d’action connu) d’un produit pharmaceutique chez des organismes non-cibles, sans hypothèse a priori. / This PhD thesis describes an investigation of the metabolomic approach performances to characterize the pharmaceuticals environmental exposure and effects in non target organisms. The studied pharmaceutical was diclofenac (DCF), a non-steroidal anti-inflammatory drug recently included in the first watch list of the European Water Framework Directive (2015/495/EC), and the model organism was the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis. The methodological approach combines target and non-targeted analysis of endogenous and exogenous metabolites in mussel, the endo- and the xeno-metabolome. DCF effects in mussel were investigated considering its known mode of action in human: the prostaglandins (PG) synthesis modulation. In aquatic organisms, PGs are involved in various biological functions, such as reproduction or osmoregulation. This targeted analysis allowed us to determine a PGE2 synthesis disruption with DCF exposure. Otherwise, little information is available about DCF biotransformation in invertebrates. To study DCF biotransformation in mussel, the application of a non-targeted approach seemed promising. This study allows the reveal 13 DCF metabolites formation of which 3 were phase I metabolites and 10 were phase II metabolites. Among them, 5 were described for the first time. Subsequently, the mussel’s endo-metabolome study showed the modulation of two pathways: the tyrosine and the tryptophan metabolism. Inside these pathways, the catecholamines and serotonin appeared as particularly impacted. In mussels, these compounds are involved in important biological functions: the osmoregulation and the reproduction. Such DCF effects are in accordance with those reported in other study conducted on aquatic organisms. The work conducted highlighted the relevance and pertinence of the metabolomic approach as a tool for environmental studies without a priori hypothesis, such as studying the biotransformation and unexpected effects of pharmaceuticals in non-target organisms.

La métabolomique non ciblée est une approche visant à caractériser le contenu métabolique d’un échantillon biologique. Cela permet d’évaluer les changements phénotypiques ayant lieux en son sein. Au cours de cette thèse, une cohorte de patients souffrant d’encéphalopathie hépatique (EH) a été étudiée en métabolomique, en association avec de la lipidomique et de la glycomique. L’EH est une maladie dont les mécanismes sont encore mal compris mais avec un impact important médicale et sociétal. Ces travaux ont montré que l’EH est associée à une altération du métabolisme énergétique observable dans le sang et dans le liquide céphalorachidien. A la suite de cette étude et face aux limites mises en exergue, la suite de ces travaux a visé à développer de nouvelles approches analytiques en métabolomique. Nous ainsi avons montré que l’utilisation de nouveaux instruments de type Orbitrap-Fusion, permettant d’atteindre de très hautes résolutions, donne accès à la structure isotopique fine des métabolites ce qui facilite leur l’identification. L’étude de la fragmentation MS² des ions a permis de mieux comprendre des mécanismes mis en jeu, améliorant l'interprétation des spectres. Enfin, nous avons montré que les améliorations apportées aux instruments, notamment en termes de vitesse d’acquisition, permettaient d’envisager la mise en place de nouveaux modes d’acquisition basés sur l’acquisition multi-événements de spectres MS et MS². Ces améliorations proposées devraient rapidement être utilisables et applicables à l'étude métabolomique de nouvelles cohortes médicales. / Untargeted metabolomics aims at studying the whole metabolite content of biological media. This allows to assess phenotypic changes in these samples. In the frame of this work, a cohort of patients suffering from hepatic encephalopathy (HE) was studied using metabolomics, in association with lipidomics and glycomics. HE is a disease still poorly understood, but with high medical and social impact. This work, performed on cerebrospinal fluid and blood samples, demonstrates that HE is associated to an alteration of energy metabolism. Then, considering the limitations of metabolomics raised in our first study, we aim at developing new analytical chemistry methods for metabolomics. We demonstrate that the use of new instrument such as Orbitrap Fusion, which can reach very high resolution, gives acces to isotopic fine structure of metabolites, thus facilitating their identification. Furthermore, the study of ion fragmentation from MS² spectra enabled to better understand the involved mechanisms and should help for interpreting MS² spectra obtained from unknown metabolites. Finally, we showed that improvements achieved with the Orbitrap Fusion instrument in terms of data acquisition speed enables the implementation of new acquisition modes based on multi events MS and MS² acquisition, such as data dependent or data idependant acquisitions. All these improvements in the field of metabolomics should rapidly be applicable to medical cohort analyses.

Les profils métabolomiques d’acides aminés (AA) sanguins d’individus obèses présentent des niveaux élevés d’acides aminés à chaîne ramifiée (AACR) possiblement en lien avec une altération des enzymes de leur catabolisme dans le tissu adipeux. Nous avons étudié les profils d’AA sanguins associés à l’obésité viscérale et aux facteurs de risque cardiométabolique ainsi que l’expression des gènes et l’abondance protéique des enzymes du catabolisme des AACR dans les tissus adipeux d’un échantillon de femmes ayant divers degrés d’adiposité. Nous avons démontré que les femmes obèses présentaient des niveaux d’AACR, de glutamate et de tyrosine augmentés. De plus, les taux circulants d’AACR étaient associés positivement aux marqueurs d’homéostasie du glucose et d’adiposité totale et sous-cutanée tandis que le glutamate et l’acylcarnitine C3 étaient associés positivement à l’aire de tissu adipeux viscéral et aux niveaux de triglycérides sanguins. L’expression et l’abondance protéique des enzymes du catabolisme des AACR étaient abaissées dans le tissu adipeux omental des femmes obèses. Les résultats de cette étude suggèrent que les concentrations sanguines d’AACR, de tyrosine et de glutamate sont plus élevées chez les individus obèses. Cette élévation des taux plasmatiques pourrait être associée à une diminution de l’expression et de l’abondance protéique des enzymes responsables du catabolisme des AACR, principalement observée dans les tissus adipeux omentaux des individus obèses. / Metabolomic profiling of obese individuals revealed high blood levels of branched-chain amino acids (BCAA) possibly linked to altered adipose tissue BCAA catabolism. We examined plasmatic AA profiling linked with visceral obesity and cardiometabolic risk factors as well as gene expression and protein abundance of BCAA-catabolizing enzymes in adipose tissue of lean-to-obese women. We showed that obese women had significantly higher circulating BCAA, glutamate and tyrosine levels. Moreover, circulating BCAA levels were positively related to glucose homeostasis variables in addition to total and subcutaneous adiposity markers while glutamate and C3 acylcarnitine levels were positively associated with visceral adipose tissue area and triglycerides. Obese women had lower expression and protein levels of BCAA-catabolizing enzymes in visceral adipose tissue specifically. The results of this study suggest that plasma concentrations of BCAA, tyrosine and glutamate are elevated in obese individuals. This could be associated with a reduction in expression and protein abundance of BCAA-catabolizing enzymes mainly observed in omental adipose tissue of obese individuals.

Les évidences observationnelles suggèrent une association entre la consommation de produits laitiers et une diminution du risque de diabète de type 2. Néanmoins, les études cliniques demeurent controversées, probablement en raison de la grande variabilité interindividuelle en réponse aux produits laitiers. De plus, très peu d’études utilisent des biomarqueurs objectifs pour évaluer la consommation de produits laitiers. L’analyse sérique des profils de métabolites avec la métabolomique pourrait être une stratégie intéressante d’identification de biomarqueurs de la consommation de produits laitiers et ainsi, améliorer la précision des évaluations nutritionnelles dans les études cliniques. L’objectif global de ce mémoire est d’observer l’effet d’une consommation augmentée de produits laitiers sur les différents paramètres glycémiques et insulinémiques associés au diabète de type 2, de même que sur les profils métabolomiques chez des sujets hyperinsulinémiques. De plus, un objectif spécifique est d’évaluer la réponse interindividuelle en réponse aux produits laitiers. La réalisation d’un essai randomisé en chassé-croisé entrepris auprès de 27 adultes hyperinsulinémiques suggère qu’une consommation de ≥4 portions/jour de produits laitiers pendant 6 semaines n’affecte pas les différents paramètres glycémiques et insulinémiques comparativement à ≤2 portions/jour. Néanmoins, augmenter à ≥4 portions/jour la consommation de produits laitiers semble accentuer la résistance à l’insuline comparativement à avant l’intervention. Toutefois, une grande variabilité dans la réponse interindividuelle fut remarquée pour la résistance à l’insuline, suggérant qu’une consommation augmentée de produits laitiers pourrait être favorable ou défavorable selon les individus. De plus, une consommation de ≥4 portions/jour affecte les profils de métabolites de façon distincte à ≤2 portions par jour, suggérant une signature de métabolites spécifique au nombre de portions consommées. Davantage d’études de longue durée tenant compte de la variabilité interindividuelle et utilisant des biomarqueurs objectifs sont requises afin d’identifier les individus qui pourraient réellement bénéficier d’une augmentation de leur consommation produits laitiers pour prévenir le diabète de type 2. / Observational evidences suggest an association between dairy product intake and a reduced risk of developing type 2 diabetes. However, results from clinical studies remain controversial, notably due to large interindividual variability in response to dairy products. Further, clinical studies using objective dietary biomarkers to assess dietary intake are missing. Serum metabolite analysis using metabolomics could be a novel strategy to identify new biomarkers of dairy product intake and thus, improving accuracy of nutritional evaluations in clinical studies. The main objective of this research was to observe the effects of increased dairy product intake on type 2 diabetes related risk factors such as glycemic and insulinemic parameters, along with metabolomic profiles in hyperinsulinemic subjects. Interindividual variability in response to dairy products was also assessed as a specific objective. Results from a cross-over randomized controlled trial undertaken among 27 hyperinsulinemic adults suggest that consuming 4 servings or more of dairy products daily for 6 weeks does not affect glycemic and insulinemic parameters compared to a standard intake of dairy products (2 servings or less per day). Yet, increasing dairy intake to 4 servings or more per day increased insulin resistance compared with baseline values, without affecting insulin secretion of β-cells function. However, large inter-individual variability in response to dairy products was denoted for insulin resistance, suggesting that higher intake of dairy products might be unfavorable or beneficial depending on the individual. Further, consuming 4 servings or more of dairy products daily affected serum metabolomic profiles distinctly from consuming ≤2 servings per day, suggesting specific metabolite signature to increased dairy product intake. Additional long-term trials studying interindividual variability and using objective biomarkers of dairy intake are required to identify which individuals may really benefit from increasing dairy intake to prevent type 2 diabetes.

La surface des vignobles mondiaux représente environ 7,9 millions ha, ce qui correspond à une production annuelle de 67 millions de tonnes de baies. La production mondiale annuelle de vins est de l’ordre de 300 millions hl/an. La surface du vignoble français est de 843 000 ha. La viticulture moderne doit affronter trois défis majeurs interdépendants : réduire l’utilisation des produits phytosanitaires, s'adapter au changement climatique, maîtriser la qualité et la typicité pour garder ou conquérir de nouveaux marchés.En 2007, la vigne est devenue la première espèce fruitière pérenne dont le génome a été séquencé. Cette avancée scientifique ouvre de nombreuses perspectives en termes de génomique fonctionnelle (ensemble de méthodes permettant de caractériser la fonction des gènes) et de biologie intégrative (ensemble de méthodes visant à appréhender le fonctionnement global de la plante et ses réponses à l’environnement). Ces perspectives dépendent pour une bonne part de la maîtrise de quantités importantes de données qu’il convient d’organiser et de corréler grâce à des outils informatiques adaptés.Des approches fonctionnelles concernant des gènes candidats et des approches transcriptomiques à haut débit ont permis d’identifier certains gènes ou certaines familles de gènes impliqués dans le développement et la maturation de la baie de raisin, mais au moment où cette thèse a débuté, aucun travail de biologie intégrative n’avait été entrepris.Le travail présenté ici, qui décrit l’obtention et l’analyse de métadonnées transcriptomiques et biochimiques portant sur la réponse de la baie à l’environnement radiatif, s’inscrit dans ce contexte. En procédant à un effeuillage partiel après la véraison, nous avons modulé l’exposition des baies au rayonnement solaire. Ceci a permis d’étudier l’influence du rayonnement (baie exposée, non exposée), de la position de la grappe (est, ouest) et de la position de la baie (à l’extérieur ou à l’intérieur de la grappe). Des baies ont été récoltées à 5 moments différents après l’effeuillage et utilisées pour des analyses métabolomiques et transcriptomiques. Leur contenu en sucres, acides organiques, acides aminés, anthocyanes et flavonols a été analysé par des dosages enzymatiques et par chromatographie liquide à haute performance). L’expression des gènes a été étudiée avec des microarrays représentatifs de l’ensemble du génome de la vigne (29600 gènes) pour les conditions présentant les différences métaboliques les plus marquées (baies exposées, situées à l’ouest et à l’extérieur de la grappe vs baies non exposées, situées à l’est et à l’intérieur de la grappe). Des analyses statistiques et corrélatives ont été conduites pour (a) déterminer les métabolites qui répondent au traitement et les facteurs qui les influencent (b) déterminer les gènes qui répondent aux traitements et ceux qui semblent co-régulés (c) préciser les réseaux de gènes et de métabolites qui semblent reliés. L’effeuillage n’affecte pas la teneur en sucres ou en acide tartrique des baies, il affecte peu les acides aminés, mais il augmente la teneur en flavonols et diminue la teneur en acide malique. Il affecte plus particulièrement les gènes associés au stress abiotique, au métabolisme secondaire, au transport et au métabolisme hormonal. Des expériences complémentaires ont permis d’identifier divers gènes spécifiquement associés à la composante thermique de l’exposition au soleil, parmi lequels des gènes codant pour des HSP, des transporteurs ABC, et des enzymes du métabolisme flavonoïdique. Des réseaux reliant des gènes et des métabolites ont pu être construits, qui associent des métabolites secondaires à des gènes de fonctions connues, ou à de nouveaux gènes candidats dont il conviendra d’étudier la fonction précise. / The total surface of vineyards worldwide is about 7.9 millions ha, which corresponds to an annual production of 67 millions tons berries. The annual world production of wines is about 300 millions hl/year. The French wineyard occupies 843 000 ha, among which 481 000 ha are dedicated to high quality wines (VQPRD) and 362 000 ha to table wines. Modern viticulture must deal with three major and related challenges : reduce the use of organic and inorganic phytochemicals, adapt the vineyard to climatic change and control the quality and the typicity in order to keep or gain new markets.In 2007, the grapevine became the first perennial fruit species whose genome was sequenced. This scientific breakthrough opens new pespectives in terms of functional genomics (set of methods allowing to characterize the function of genes) and integrative biology (set of methods allowing to study the global functioning of the plant and its response to the environment). These perspectives mainly depend on our ability to analyze large sets of data with adequate informatic tools.Functional approaches on candidate genes, and high throughput transcriptomic approaches have allowed to identify some genes or some gene families involved in the development and ripening of the grape berry, but when this Ph. D work started, no paper based on integrative biology was published on grapevine. The present work, which describes the collection and analysis of transcriptomic and metabolomic metadata related to the response of the berry to sun exposure. The exposure of the berries to the sun was controlled through a partial defoliation after veraison. This allowed to study the effects of sun exposure (exposed or shaded berries), of the position of the cluster (east, west) and of the anatomical position of the berry (outside or inside the berry). Berries were collected at 5 different time points after defoliation and used for metabolomic and transcriptomic analysis. Their content in sugars, amino acids, organic acids, anthocyanins and flavonols was analyzed by enzymatic assays and high performance liquid chromatography. For the berries whose metabolic content differed the most (exposed, west and outside berries vs shaded, east and inside berries), gene expression was studied with microarrays bearing a set of probes covering the whole genome of grapevine (29600 genes). Correlative and statistical analysis were conducted in order to (a) determine the metabolites that are the most responsive to the treatment, and the most important factors that control them (b) determine the genes that respond to the treatment and seem to be co-regulated (c) to precise the networks of genes and metabolites which seem related. Defoliation does not affect the sugar and tartaric acid contents, hardly affects amino acids, but it increases flavonol content and decreases malic acid content. It affects more specifically genes associated with abiotic stress, secondary metabolism, transport and hormonal metabolism. Additional experiments allowed us to identify genes that are specifically associated with the thermal component of sun exposure, among which genes encoding HSP, ABC transporters, and enzymes of flavonoid metabolism. Networks relating genes and metabolites could be constructed. These networks associate secondary metabolites with genes of known function and new candidate genes for which the function will have to be precised.