La pollution des produits agroalimentaires et des eaux environnementales par les substances phytosanitaires et les médicaments est une réelle préoccupation de santé publique. Il existe aujourd’hui de nombreuses méthodes d’analyses quantitatives développées sur des appareils de type triple quadripôle pour leur détection mais elles ne se préoccupent peu ou pas des résidus médicamenteux et des produits de dégradation abiotique ou biologique des polluants et sont limitées à un nombre restreint et figé de molécules.Dans ce contexte, nous avons développé une méthode d’analyse basée sur la métabolomique par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse à ultra-haute résolution (LC-HRMS). Deux matrices (miel et eau souterraine) ont ainsi été étudiées comme preuve de concept. Nous avons montré que la LC-HRMS associée à des outils de fouille de données permet (i) une recherche ciblée de polluants prioritaires, (ii) la détection sans a priori de contaminants inattendus ou inconnus et (iii) la recherche de métabolites nécessaire à la classification des échantillons en fonction de leur métadonnée (adultération, origine géographique, etc.). Ensuite, une approche semi-quantitative ciblée large spectre a été développée et validée pour la détection de pesticides, médicaments et métabolites dans l’eau par couplage de la SPE en ligne avec l’UHPLC-ESI-HRMS. Cette méthode permet la détection de 539 contaminants organiques en 36 minutes dans 5 millilitres d’eau au seuil minimum réglementaire de 0,1 µg/L. L’étude de 26 eaux du robinet de la région parisienne a permis de mettre en évidence la présence à l’état de trace de 37 polluants dont 6 médicaments. / Pollution of agrifood and environmental water by pesticides and drugs is a real public health concern. There are many quantitative methods developed on triple quadrupole mass spectrometer for their detection, but drug residues and abiotic or biological degradation of pollutants are generally not considered and are limited to a predetermined and restricted list of molecules.In this context, we have developed an analytical method based on metabolomic analyses by high performance liquid chromatography coupled with ultra-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Two matrices (honey and groundwater) were investigated as proof of concept studies. We showed that LC-HRMS associated to data mining tools enables (i) targeted analyses of pollutants, (ii) detection of untargeted and unknown xenobiotics, and (iii) detection of metabolites useful for the characterization of matrices. Then, a large targeted and semi-quantitative approach has been developed and validated for the detection of pesticides, drugs and metabolites in water samples by using on line SPE and UHPLC-ESI-HRMS. This method allowed the detection of 539 organic contaminants at the MLR of 0.1 µg/L in 36 minutes with only 5 milliliter of water. A study of 26 tap water samples from the Paris region showed the presence of 37 pollutants including 6 drugs.

Ce travail porte sur la valorisation de sarments de vigne comme source de polyphénols bioactifs. Après purification d’oligomères du resvératrol et hémi synthèse d’analogues du resvératrol, l’activité antifongique de ces molécules a été testée. Le 3,5-diméthoxyresvératrol a montré des activités intéressantes sur douze espèces du genre Candida. Pendant le stockage des sarments, une forte augmentation en E-resvératrol et E-picéatannol a lieu de façon thermo dépendante et l’expression des gènes PAL, C4H et STS participent à la biosynthèse de novo du E-resvératrol. Une infection par le mildiou au vignoble pendant la période de croissance modifie à la fois la composition et la répartition spatiale des stilbénoïdes dans les sarments. L’analyse métabolomique ciblée par UPLC-MS couplée à une analyse PLS-DA permet de discriminer les sarments selon leur génotype et de déterminer des métabotypes. La distance biochimique observée correspond à la distance génétique inter cépage. Ces résultats démontrent le potentiel antifongique des stilbènoïdes et permettent d’identifier quelques facteurs clés influençant la composition phytochimique des sarments de vigne. / This work aims at grape cane valorization as a source of bioactive polyphenols. After purifying E-resveratrol oligomers and obtaining E-resveratrol analogues through semi-synthesis, the antifungal activity of the compounds was evaluated. The 3,5-dimethoxyresveratrol exhibited interesting activity against twelves Candida species. During post-pruned grape cane storage, a strong and temperature dependent increase in E-resveratrol and E-piceatannol was observed and the expression of PAL, C4H, 4CL and STS genes contributed to a de novo biosynthesis of E-resveratrol. Downy mildew infection in vineyard during the growing season modified both the composition and the spatial distribution of stilbenoids in grape canes. UPLC-MS-based targeted metabolomics coupled to multivariate statistical analysis discriminates grape canes according to their genotypic origin and determines metabotypes. The observed biochemical distances between genotypes corresponded to genetic distances. Finally, results highlight the antifungal potential of stilbenoids and several key factors affecting the phytochemical composition of grape canes

La thyroïde est une glande endocrine importante pour le contrôle du métabolisme, le développement et la croissance des mammifères. Sa fonction est stimulée par la « Thyroid Stimulating Hormone » (TSH) mais inhibée par une forte élévation de l’iode plasmatique. Cette inhibition par l’iode a été décrite il y a plus de 70 ans, mais la compréhension des mécanismes sous-jacents reste partielle et controversée. La mise en place de l’effet inhibiteur de l’iode nécessite la génération de composants intermédiaires iodés dont la nature est inconnue. La première partie de cette thèse a eu pour objectif d’étudier si des protéines iodées pourraient avoir un rôle dans la régulation de la thyroïde par l’iode. En combinant le marquage radioactif, l’électrophorèse bidimensionnelle et la spectrométrie de masse, nous avons mis en évidence dans des cellules en culture une iodation spontanée de la Peroxyrédoxine 6 (PRDX6). Nous avons ensuite identifié les positions d’iodation sur la protéine PRDX6 et évalué leurs effets sur son activité enzymatique. De plus, nous avons montré qu’une diminution de l’expression de la PRDX6 par « Short hairpin RNA » amplifie la diminution de la capacité de captation d’iode induite par un excès d’iode. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la PRDX6 exerce un rôle protecteur vis-à-vis d’une exposition aiguë à l’iode. Les résultats obtenus apportent des connaissances originales dans le mécanisme de la régulation thyroïdienne par l’iode et dévoilent un nouveau rôle potentiel de cette peroxydase dans la thyroïde. La deuxième partie de cette thèse a consisté à développer des approches en métabolomique pour les appliquer dans les études sur des dysfonctionnements ou des lésions de la thyroïde. Pour ce faire, nous avons utilisé la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse pour mesurer la variation des métabolites dans les cellules ou les tissus. Grâce à l’exposition à des perturbateurs thyroïdiens d’une lignée de cellules thyroïdiennes de rat, nous avons identifié une liste de métabolites iodés comme étant de potentiels marqueurs d’exposition aux perturbateurs thyroïdiens. Par la suite, grâce aux prélèvements congelés de lésions thyroïdiennes dont le diagnostic de nature avait été réalisé en histologie, nous avons construit un modèle de classification supervisée (de type OPLS-DA) basé sur les données métabolomiques pour discriminer les lésions bénignes des malignes. Les variations des métabolites déterminants pour cette classification indiquent une altération au niveau du cycle de Krebs, du métabolisme du glutathion et du métabolisme des bases puriques. En outre, nous avons montré qu’une liste restreinte de métabolites suffit pour établir un modèle de discrimination statistiquement significatif. Ces résultats ouvrent la possibilité d’affiner le diagnostic sur les prélèvements de cytoponction en ciblant uniquement ces métabolites. Ces approches en métabolomique ont également été appliquées à l’étude d’autres types de tumeurs, notamment la classification des sous-types histologiques de carcinomes du rein. / Thyroid function is stimulated by the thyroid-stimulating hormone TSH while inhibited by iodide. The inhibition of thyroid function by an excess of circulating iodide was first reported more than 70 years ago but our understanding of the underlying molecular mechanisms remains unclear. The inhibitory effect of iodide is due to the presence of oxidized iodide in the thyrocytes and the subsequent generation of iodinated intracellular signaling molecules. The first part of this thesis aimed to study the potential role of iodinated proteins in thyroid regulation by iodide. By combining radioactive labeling, two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry, we showed that the cytosolic enzyme, peroxiredoxin 6 (PRDX6), is spontaneously iodinated in cultured cells in the presence of iodide. We identified the iodinated amino acids in the PRDX6 sequence and studied the effect of the iodination on the protein’s activity. In addition, decreased expression of PRDX6 by short hairpin RNA led to increased cell iodide uptake loss induced by excess iodide. Based on our findings, we propose that PRDX6 is involved in the cellular responses to excess iodide. This novel function for PRDX6 provides new insights into the molecular mechanisms underlying acute regulation by iodide.The second part of this thesis aimed to develop metabolomics approach in the studies of thyroid disruptors and thyroid cancers. To this end, we analyzed metabolite variations in various samples using LC-MS (Liquid chromatography-Mass spectrometry). Firstly, in rat thyroid cell line exposed to different thyroid disruptors, we identified a list of iodinated metabolites, which could serve as potential biomarkers for thyroid disruptor screening. Secondly, we analyzed frozen specimens from thyroid nodules previously diagnosed by histology. Our data allowed us to build a multivariate classification for the discrimination of benign and malignant thyroid nodules. We also detected various metabolic dysregulations in malignant thyroid nodules, including the TCA cycle, the glutathione metabolism and the purine metabolism. Accurate classification was possible by using only a short list of metabolites, allowing for future LC-MS-based thyroid nodule diagnosis on fine-needle aspiration biopsies. Finally, we showed that metabolomics approach could also be helpful for the characterization of other tumors.

Le taux de mortalité associé aux infections par le S. aureus résistant à la méticilline (SARM) est le plus élevé parmi les infections staphylococciques. Le SARM est aussi la plus fréquente des bactéries multirésistantes, plaçant souvent le médecin en situation d'impasse thérapeutique. Une meilleure compréhension des phénomènes de résistance aux antibiotiques permettrait de mieux détecter ces bactéries et concevoir de nouveaux antibiotiques. Dans ce contexte, ces travaux de thèse visaient à étudier le phénotype de résistance à la méticilline de S. aureus par une approche métabolomique.La première partie de ce travail a été dédiée au développement des outils nécessaires aux analyses métabolomiques globales de S. aureus. Ces développements ont impliqué la mise place d'un protocole de préparation d'échantillon spécifique et multi-étapes, de méthodes de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC/HRMS) et l'implémentation d'une base de données spectrales dédiée.Dans ces conditions, nous avons pu extraire et identifier jusqu'à 210 métabolites intracellulaires, ce qui représente la plus large couverture métabolique de S. aureus obtenue à ce jour. Dans un second temps, nous avons appliqué l'approche développée à l'étude de souches SARM et de souches sensibles à la méticilline (SASM). Après optimisation rigoureuse des conditions de culture, l'étude approfondie de 24 souches cliniques nous a permis de dégager une signature métabolique du phénotype de la résistance à la méticilline, signant notamment l'implication des voies de biosynthèse de la paroi et de la capsule bactérienne.Le séquençage complet du génome de ces 24 souches combiné à l'étude complémentaire de 16 souches de SARM de fonds génétiques différents nous a ensuite permis de souligner la pertinence de cette signature métabolique vis-à-vis du phénotype étudié. Enfin, l'étude de souches isogéniques en présence d'antibiotique a également confirmé l'implication de la synthèse de la paroi dans la distinction SARM/SASM. / The mortality rate associated with Methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the highest among the staphylococcal infections. A better understanding of antibiotic resistance phenomena would lead to better detect these bacteria and design new antibiotics. In this context, this PhD work aimed to study the MRSA phenotype by using a metabolomics approach. The first part of this work has been dedicated to developing a global metabolomic analysis of S. aureus: i.e., the setting up of a reliable sample preparation protocol, the development of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry methods, and the implementation of a dedicated spectral database. Under these conditions, 210 metabolites have been extracted and identified in bacterial cell extracts, which is the widest metabolic coverage of S. aureus obtained to date.Secondly, we have performed a metabolomic study of MRSA and methicillin susceptible S. Aureus (MSSA) strains. The analysis of 24 clinical strains has allowed us to highlight a metabolic signature of MRSA phenotype of which metabolites involved in bacterial wall and capsule biosynthesis pathways were part. The complete genome sequencing of these 24 strains combined with the complementary study of 16 MRSA strains of different genetic backgrounds have reinforced the relevance of this metabolic signature. Finally, the study of isogenic strains in the presence of an antibiotic has confirmed the involvement of metabolites of the wall and capsule biosynthesis pathways in the distinction of MRSA/MSSA phenotypes.

Le méthane, puissant gaz à effet de serre (GES), est produit dans le rumen des bovins par la fermentation microbienne anaérobie des aliments. Cette production est également responsable d’une perte d’énergie pour l’animal représentant 6 % à 8 % de l’apport alimentaire. Pour ces raisons, plusieurs travaux de recherches sont entrepris pour réduire ces émissions, en jouant sur la composition des aliments ou sur l’utilisation d’additifs alimentaires. Actuellement, la mesure des émissions de méthane se fait par différentes techniques, qui présentent des inconvénients, notamment le coût ou encore la difficulté d’application à grande échelle sur le terrain. De ce fait, de nombreuses recherches sont menées pour trouver des méthodes alternatives ou « proxy » pour la mesure indirecte du méthane. Mon travail de thèse a pour objectif de rechercher des marqueurs associés à la production de méthane chez la vache laitière, par une approche métabolomique multiplateforme. Ces marqueurs, une fois validés, pourront être dosés par des méthodes simples de laboratoire et appliqués à grande échelle pour évaluer les émissions de méthane. Étant donné le caractère exploratoire de l’approche et pour maximiser nos chances de réussite, nous avons combiné l’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la méthanogènèse et l’analyse des profils métaboliques de quatre matrices (le lait, le plasma, le contenu ruminal et les urines)  avec différentes plateformes analytiques complémentaires : la résonnance magnétique nucléaire et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Les échantillons biologiques proviennent d’une expérimentation animale utilisant 25 vaches Holstein primipares, et séparées en deux groupes suivant la présence ou non de l’additif anti-méthane dans la ration. Nous avons mesuré une diminution des émissions de méthane de 22,7% chez les animaux ayant reçu l’additif. Les analyses statistiques multivariées ont montré des profils métaboliques différents entre les 2 groupes d’animaux dans le plasma (27 métabolites discriminants) et le lait (16 métabolites discriminants). Les travaux sur les urines et le contenu ruminal sont en cours. L’analyse des réseaux métaboliques a mis en évidence plusieurs voies métaboliques impactées par la réduction des émissions de méthane impliquées dans le métabolisme énergétique ou encore dans celui des acides-aminés. / Ruminants produce significant amount of enteric methane, which is a major contributor of greenhouse gas emissions from agricultural origin. This production also results in a loss of 6 to 8% of the energy present in the diet. The reduction of enteric methane emissions from ruminants is an active area of research that requires the use of expensive, constraining measurement methods such as respiratory chambers or the use of a tracer gas that are difficult to use outside experimental farms. Therefore, there is a need of alternative, non-invasive measurement methods that can be used on large number of animals. In this work, we used an open metabolomic approach for identifying potential metabolic biomarkers associated with the production of methane in dairy cows. These discriminant metabolites, once validated, may be used for monitoring methane emissions under field conditions. To maximize the chance of finding such biomarkers, we used a multiplatform metabolomics approach (nuclear magnetic resonance and mass spectrometry) to better cover the metabolome and analyzed four biological matrices, namely milk, plasma, ruminal fluid and urine. We carried out a study involving 25 primiparous Holstein dairy cows that were divided into two groups fed a diet with or without a specific anti-methanogenic compound. We measured 22.7% reduction of methane emissions in the Treated group compared to the Control group. We identified 27 discriminant metabolites in plasma and 16 discriminant metabolites in milk. Metabolic network analysis highlighted pathways involved in energy and amino acids metabolism suggesting a general effect on the host animal induced by a reduction in methanogenesis.

Dans un marché globalisé où 40% du vin consommé est importé, le contrôle de la traçabilité est un enjeu majeur de la filière viti-vinicole. L'authentification du vin est le processus pouvant faire appel à différentes méthodes analytiques devant pouvoir contrôler trois paramètres fondamentaux : l’origine géographique, le cépage et le millésime. La spectroscopie RMN 1H quantitative (RMNq) est aujourd'hui considérée comme un outil très prometteur pour l'étude de l'authenticité des vins. Lors de cette thèse, une technique de dosage de 40 composés majoritaires des vins par RMN 1H a été développée. Elle permet l’acquisition d’une information riche et complexe en une seule analyse non-spécifique. La capacité de cette technique à authentifier un vin a été démontrée suite à une collaboration avec le Château Mouton-Rothschild, par comparaisons avec des analyses officielles réalisées par la DGDDI et DGCCRF de Pessac (SCL). La détermination d’un seuil de conformité a été établie en prenant en compte l’évolution naturelle des vins en bouteille. Une étude de caractérisation des vins rouges de Bordeaux a été menée. La singularité de ces vins a été observée par comparaison avec d’autres vins français, mettant en évidence des métabolites caractéristiques des vins de Bordeaux. Les résultats fournissent une description globale du potentiel de la RMN 1H pour l’authentification des vins. / In a globalized market where 40% of the wine consumed is imported, traceability control is a major challenge for the wine industry. Wine authentication is the process that can use different analytical methods able to control three fundamental parameters: geographical origin, grape variety and vintage. Quantitative 1H NMR spectroscopy (qNMR) is now considered as a very promising tool for studying wine authenticity. During this thesis, a technique was developed for the determination of 40 major wine compounds by 1H NMR. It allows the acquisition of rich and complex information in a single non-specific analysis. The ability of this technique to authenticate a wine has been demonstrated following a collaboration with Château Mouton-Rothschild, by comparison with official analyses carried out by the DGDDI and DGCCRF of Pessac (SCL).The determination of a compliance threshold has been established by taking into account the natural evolution of bottled wines. A characterization study of Bordeaux red wines was carried out. The singularity of these wines was observed in comparison with other French wines, highlighting the characteristic metabolites of Bordeaux wines. The results provide a global description of the potential of 1H NMR for wine authentication.

Le plus grand défi qui se pose pour les générations actuelles et futures est celui des changements climatiques. Les impacts se feront sentir pour les humains, les sociétés, mais aussi pour les écosystèmes. Ces changements climatiques entrainent déjà des modifications de la faune et la flore des écosystèmes autour du globe et il est accepté que les régions du Nord subiront les modifications les plus drastiques de leurs conditions menaçant ainsi les ressources naturelles qu'elles renferment. De nombreux secrets et les connaissances associées pourraient donc disparaitre avec les changements climatiques. Les plantes et les lichens produisent toute une kyrielle de molécules jouant divers rôles dans leur croissance, leur survie, leur reproduction, leur communication, etc. Un nombre considérable de ces produits naturels issus de végétaux sont d'ailleurs utilisés en pharmaceutique, en cosméceutique, en cosmétique, en parfumerie, en alimentation, etc. Les organismes produisent des métabolites en réponse aux stress qu'ils subissent et ces stress sont très différents dans la nordicité en comparaison des autres écosystèmes de la planète ce qui peut avoir un impact sur la composition moléculaire des végétaux et des autres organismes qui s'y trouvent. Le métabolome de végétaux issus de la nordicité a été étudié, en analysant les huiles essentielles de Rhododendron groenlandicum, Rhododendron subarcticum et Myrica gale, ainsi que la fraction volatile de Betula glandulosa par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Les huiles essentielles ont été comparées à des huiles essentielles des mêmes espèces ne provenant pas de la nordicité. Pour Betula glandulosa, il s'agissait de la première investigation de sa fraction volatile. Les huiles essentielles des deux Rhododendron ont également été évaluées pour diverses activités biologiques. Aussi, l'impact de la nordicité a été évalué en développant une méthodologie permettant la comparaison de la composition en métabolites secondaires d'échantillons de lichens prélevés à différentes latitudes. / The biggest challenge for current and future generations is climate change. Impacts will be felt by humans and society but also by ecosystems. Climate change already modifies fauna and flora around the world and the most intense modifications of ecosystem conditions will take place in the northern regions. The natural resources found in northern regions have a great potential. Their ecosystems are still full of secrets, knowledge that could very well disappear with climate change. Plants and lichens produce a variety of molecules playing diverse roles in their growth, their survival, their reproduction, their communications, etc. and a great number of natural products from plants are used in pharmaceuticals, cosmeceuticals, cosmetics, perfumes, foods, etc. Organisms produce secondary metabolites in response to stresses they are enduring and those are very different in northern regions compared to ecosystems elsewhere, which certainly have an impact on molecular composition of plants and other organisms evolving there like lichens. Metabolome of some plants from Nunavik have been studied, by analysis of essential oils from Rhododendron groenlandicum, Rhododendron subarcticum and Myrica gale and of the volatile fraction of Betula glandulosa by gas chromatography-mass spectrometry. Those essential oils have been compared with essential oils from the same species growing outside Nunavik. The investigation of volatile fraction from Betula glandulosa was the first ever. Essential oils from both Rhododendron species have been submitted to biological activity assays. Also, the impact of latitude has been examined by developing a method allowing comparison of secondary metabolites in lichens collected over a gradient of latitudes.

Les acides gras polyinsaturés oméga-3 (AGPI n-3) sont réputés pour leurs nombreux bénéfices sur la santé, dont celui d’abaisser les risques de maladies cardiovasculaires. Cependant, lors de traitements thermiques, comme la friture, ils se dégradent, entre autre en gras trans et en monomères cycliques d’acides gras (MCAG), produits dont la nocivité est connue ou questionnée. Ces dégradations thermiques surviennent à des températures utilisées autant par l’industrie alimentaire pour la désodorisation des huiles riches en AGPI et pour la friture, que par le consommateur pour frire ses aliments, soit à environ 180°C (350°F). La cinétique qui contrôle la cyclisation des acides gras en MCAG est peu connue. Ainsi, nous avons étudié la cinétique de formation des MCAG à partir d’un AGPI n-3 susceptible d’être présent dans certaines huiles de friture, à savoir l’acide alpha-linolénique (AAL), et de ses isomères géométriques. Bien que le mécanisme de formation des MCAG demeure hypothétique, nous croyons que les AGPI empruntent la voie d’un réarrangement intramoléculaire de cycloaddition suivie d’une migration protonique [1,6] pour former les MCAG. Dans le but de vérifier cette hypothèse, nous avons contribué à la synthèse d’un AGPI n-3, soit un isomère géométrique de l’AAL, marqué par deux atomes de deutérium en un endroit directement impliqué dans ce réarrangement intramoléculaire. Enfin, compte tenu de la nocivité potentielle des MCAG et pour mettre en lumière certains aspects de leur métabolisme, nous avons synthétisé un isomère de MCAG marqué et réalisé sa métabolomique chez le rat. Nous avons opté pour une approche multi plateforme GC-MS et LC-MS, soit une approche ciblée d’analyse des lipides d’une part et une approche globale d’autre part (détermination de profils métaboliques, puis identification structurale des métabolites d‘intérêt). L’approche multi-disciplinaire de nos travaux nous a permis d’approfondir les connaissances dans la cinétique de formation des MCAG, d’avancer et d’optimiser la synthèse d’un AGPI marqué dans le but de vérifier le mécanisme de formation des MCAG à partir des AGPI. Enfin, ces travaux ont mis en lumière plusieurs aspects quant à leur métabolisme jusqu’ici hypothétiques et d’identifier certains métabolites.

Le cycle de Krebs occupe une place centrale dans le métabolisme cellulaire et est le point de jonction de nombreuses voies essentielles. Depuis le début des années 2000, un lien a été démontré entre l’apparition de certains cancers et des mutations affectant des gènes codant pour des enzymes du cycle de Krebs, i.e., la succinate déshydrogénase, la fumarase ou les iso-enzymes 1 et 2 de l'isocitrate déshydrogénase (IDH). Les mutations des gènes IDH sont présentes dans 15 à 20 % des leucémies myéloïdes aigues (LAM) et jusqu'à 80 % dans certains gliomes. Ces mutations affectent le site actif des enzymes et elles induisent une néo-fonction enzymatique qui se traduit par la production et l'accumulation d'un oncométabolite : le stéréoisomère D du 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) responsable de dérégulations énergétiques et épigénétiques au sein de la cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu entre ces anomalies et la pathologie humaine, mon travail de thèse a impliqué le développement de différentes méthodes analytiques : - tout d'abord une méthode robuste de séparation et de quantification des stéréoisomères D et L par dérivation chirale du 2-HG, ceci en GC tandem MS, - également par GC tandem MS, des méthodes métabolomiques ciblées à haute spécificité pour l'analyse de plus de 120 composés d'intérêt clinique, - des méthodes analytiques à haute résolution et non-ciblées (masse exacte; n=360 composés) adaptées à l'étude de cellules, - et des méthodes d'étude de flux métaboliques sur culture cellulaire basées sur l'analyse des dérivés de traceurs marqués aux isotopes stables. Le développement de ces méthodes m'a permis d'obtenir les résultats suivants. J'ai démontré l'importance du D-2-HG comme marqueur de la présence de mutations IDH1/2 dans une large cohorte de patients leucémiques, à la fois pour le diagnostic et pour le suivi des patients sous traitement. Notre étude pilote a conduit à utiliser ce paramètre en pratique hospitalière courante dans le laboratoire de chimie analytique de l'institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). L'étude de profils métaboliques associés aux mutations affectant les enzymes IDH2 et succinate déshydrogénase nous a permis d'identifier des mécanismes compensatoires du dysfonctionnement du cycle de Krebs, par exemple la sur-activation de la pyruvate carboxylase. Nous avons par ailleurs montré que ces mécanismes ne sont que partiellement efficaces; ils pourraient ainsi servir de cibles thérapeutiques. Une mutation du gène IDH2 (R140Q) est retrouvée chez des patients atteint de LAM et chez des patients possédant une acidurie D-2-hydroxyglutarique, maladie héréditaire du métabolisme extrêmement rare. Un inhibiteur spécifique de l'enzyme IDH2 possédant la mutation R140Q est actuellement testé comme traitement dans un essai clinique à l'IGR pour les patients leucémiques. Nous avons étudié les effets de ce composé sur des fibroblastes de notre patient atteint d'acidurie D-2-hydroxyglutarique. Nous avons confirmé ses effets sur l'enzyme IDH et observé des effets secondaires sur le métabolisme des lipides et du cycle de Krebs, à la fois dans les fibroblastes témoin et du patient. Cet inhibiteur étant connu pour avoir des effets sur la différenciation cellulaire, nos résultats pourraient permettre d'expliquer les mécanismes impliqués. Ce travail a apporté de nouveaux outils pour l'exploration des maladies métaboliques traditionnelles ainsi que de certains types de cancers, et il met en avant de nouvelles illustrations de la puissance de l'approche métabolique pour identifier des points d'intervention et de surveillance thérapeutique personnalisée des patients ("théranostique"). / The Krebs cycle has a central role in cellular metabolism and is at the junction of many essential pathways. Since 2000, a link has been shown between the development of particular cancers and mutations affecting genes coding for several Krebs cycle enzymes, i.e., succinate dehydrogenase, fumarase or iso-enzymes 1 and 2 of the isocitrate dehydrogenase (IDH). The IDH mutations are found in 15 to 20 % of acute myeloid leukemias and up to 80% of specific gliomas. These mutations affect the enzyme active site and are responsible for an neomorphic activity that is the production and accumulation of a putative oncometabolite : the D stereoisomer of the 2-hydroxyglutarate (D-2-HG) which is linked to energetic and epigenetic deregulations in the cell. To better understand the mechanisms between these abnormalities and human pathology, my PhD work involved the development of different analytical tools : - First of all, a robust method of separation and quantification of the stereoisomers D and L by chiral derivatization of the 2-HG, in tandem mass spectrometry, - GC tandem MS was also used to develop targeted metabolomic methods with high specificity for the analysis of more than 120 compounds of clinical interest, - An analytical non-targeted method using high mass resolution (exact mass; n=360 compounds) adapted to the study of fibroblast cells, - and finally, methods for the study of metabolic flux in culture cell based on derivatives of stable labeled tracers. The development of these methods led to the following results. I highlight the importance of the D-2-HG as a biomarker of the presence of IDH1/2 mutations in a large cohort of leukemic patients, for the diagnostic and the follow-up of patients under treatment. Our pilot study was the starting point for routine usage of this test in the clinical setting at the Institut Gustave Roussy (IGR; Villejuif). The study of metabolic profiles related to the mutations affecting IDH enzymes and succinate dehydrogenase allowed us to identify compensatory mechanisms of the dysfunction of the Krebs cycle, notably, the overactivation of pyruvate carboxylase. Moreover, we have shown that because these mechanisms are only partially efficient; they have potential to provide therapeutic targets. An IDH2(R140Q) mutation is shared between patients with AML and patients with D-2-hydroxyglutaric aciduria, a very rare hereditary disease of the metabolism. A specific inhibitor of the IDH2 enzyme mutant for R140Q is currently used in a clinical trial at the IGR institute. We studied the effects of this compound in fibroblasts of our aciduria patient. We confirmed the expected effect in the IDH enzyme and also observed moderate off-target effects concerning the lipid and the Krebs cycle metabolism, both in control and patient fibroblasts. Because this inhibitor is known to have effects in the cellular differentiation, our results could explain the underlying mechanisms. This work provides new tools for the exploration of traditional inherited metabolic diseases, as well as particular cancers, and illustrates the power of the metabolic approach to identify therapeutic targets and for the personalized monitoring of patients ("theranostics").

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l'état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d'une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l'Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd'hui un nombre croissant d'études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j'ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l'inhibition de la NME cytoplasmique. J'ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j'ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l'activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l'existence d'un mécanisme ubiquitaire associé à la NME.