Charles Univesity, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Jana Tomanová Supervisor: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Consultant: PharmDr. Vít Šesták, Ph.D. Title of the Diploma Thesis: LC-HRMS analysis of selected drugs in biological material I. High performance liquid chromatography is one of the most widespread separation analytical techniques. It is used in various medical, pharmaceutical and industrial laboratories. It uses different affinities of the substances in the analysed mixture to the mobile and stationary phases. Mass spectrometry is one of the instrumental techniques by which charged particles are separated in the gas phase based on the mass- to-charge ratio. Nowadays, great emphasis is placed on the fact that the individual analytical methods which are being developed are subsequently validated according to a guideline issued by national or international authorities. Validation is a process that verifies that a method is suitable for its intended use. In this thesis, the conditions for the determination of warfarin in patient's serum by means of mass spectrometer with LTQ XL linear ion trap were optimized and validated. The optimization of the method was based on the already developed and validated...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Kristýna Švarcová Consultant: RNDr. Martin Mžik, Ph.D. Supervisor: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Title: LC-HRMS analysis of selected drugs in biological material II. Anxiety disorders affect up to 25 % of the population in their life, the lifetime prevalence is 13,6 %. Insomnia affect at least one third of the population in their life, the prevalence is 15-40 %. Drugs used to treat anxiety and insomnia easily cross the blood-brain barrier and affect the CNS. It is therefore necessary to determine the correct dosing schedule and monitor treatment. The result is optimization of treatment, reduction of side effects and increased patient adherence to treatment. The rapid qualitative and quantitative analysis for urgent cases of intoxication is also needed. This diploma thesis deals with development and optimization of an extraction method for selected benzodiazepines (alprazolam, bromazepam, diazepam, chlordiazepoxide, clonazepam, midazolam, oxazepam) and zolpidem in human serum. Subsequently, the whole analytical method was validated for use in clinical practice using the UHPLC-HRMS. Protein precipitation with acetonitrile was the most suitable sample preparation...

5 ABSTRACT Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Anna Tláskalová Supervisor - specialist: Mgr. Martin Mžik Supervisor: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Title: LC-HRMS analysis of selected antihypertensive drugs in biological material for compliance assessment About 40 % of Czech population between the ages of 25 and 64 suffer from arterial hypertension. Although an array of effective antihypertensives is available nowadays, optimal blood pressure during treatment is reached by mere 30 % of the patients. This is mainly due to the patients' poor adherence to the treatment, who use their medicaments incorrectly or not at all. The adherence of a patient to the treatment, as well as pharmacokinetics, represent the most significant source of variability of the answer to the treatment and notably influences its outcome. The monitoring of plasmatic levels of antihypertensives is one of the methods of modern medicine which enables both an effective supervision of the incorrectly compensated patients, and the adjustment of dosage scheme. This diploma thesis focuses on development and optimisation of extraction procedures for selected antihypertensives (amiloride, amlodipine, betaxolol, bisoprolol, carvedilol, celiprolol,...

Le taux de mortalité associé aux infections par le S. aureus résistant à la méticilline (SARM) est le plus élevé parmi les infections staphylococciques. Le SARM est aussi la plus fréquente des bactéries multirésistantes, plaçant souvent le médecin en situation d'impasse thérapeutique. Une meilleure compréhension des phénomènes de résistance aux antibiotiques permettrait de mieux détecter ces bactéries et concevoir de nouveaux antibiotiques. Dans ce contexte, ces travaux de thèse visaient à étudier le phénotype de résistance à la méticilline de S. aureus par une approche métabolomique.La première partie de ce travail a été dédiée au développement des outils nécessaires aux analyses métabolomiques globales de S. aureus. Ces développements ont impliqué la mise place d'un protocole de préparation d'échantillon spécifique et multi-étapes, de méthodes de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC/HRMS) et l'implémentation d'une base de données spectrales dédiée.Dans ces conditions, nous avons pu extraire et identifier jusqu'à 210 métabolites intracellulaires, ce qui représente la plus large couverture métabolique de S. aureus obtenue à ce jour. Dans un second temps, nous avons appliqué l'approche développée à l'étude de souches SARM et de souches sensibles à la méticilline (SASM). Après optimisation rigoureuse des conditions de culture, l'étude approfondie de 24 souches cliniques nous a permis de dégager une signature métabolique du phénotype de la résistance à la méticilline, signant notamment l'implication des voies de biosynthèse de la paroi et de la capsule bactérienne.Le séquençage complet du génome de ces 24 souches combiné à l'étude complémentaire de 16 souches de SARM de fonds génétiques différents nous a ensuite permis de souligner la pertinence de cette signature métabolique vis-à-vis du phénotype étudié. Enfin, l'étude de souches isogéniques en présence d'antibiotique a également confirmé l'implication de la synthèse de la paroi dans la distinction SARM/SASM. / The mortality rate associated with Methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the highest among the staphylococcal infections. A better understanding of antibiotic resistance phenomena would lead to better detect these bacteria and design new antibiotics. In this context, this PhD work aimed to study the MRSA phenotype by using a metabolomics approach. The first part of this work has been dedicated to developing a global metabolomic analysis of S. aureus: i.e., the setting up of a reliable sample preparation protocol, the development of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry methods, and the implementation of a dedicated spectral database. Under these conditions, 210 metabolites have been extracted and identified in bacterial cell extracts, which is the widest metabolic coverage of S. aureus obtained to date.Secondly, we have performed a metabolomic study of MRSA and methicillin susceptible S. Aureus (MSSA) strains. The analysis of 24 clinical strains has allowed us to highlight a metabolic signature of MRSA phenotype of which metabolites involved in bacterial wall and capsule biosynthesis pathways were part. The complete genome sequencing of these 24 strains combined with the complementary study of 16 MRSA strains of different genetic backgrounds have reinforced the relevance of this metabolic signature. Finally, the study of isogenic strains in the presence of an antibiotic has confirmed the involvement of metabolites of the wall and capsule biosynthesis pathways in the distinction of MRSA/MSSA phenotypes.

Le profilage métabolomique global de matrices biologiques dans de larges séries d'échantillon est un enjeu majeur. Dans ce contexte, notre travail vise à développer des approches LC-HRMS et outils bioinformatiques pour les analyses métabolomique et lipidomique de larges cohortes. Dans un premier temps, nous avons développé puis évalué la pertinence de 4 méthodes LC-HRMS dans l'annotation du métabolome/lipidome sérique humain. Ainsi, une base de données spectrales a été implémentée à l'aide de spectres MS, MS/MS et les temps de rétention de composés de référence afin d'assurer l'annotation de jeux de données. La combinaison de méthodes RP, HILIC et PFPP-HRMS a permis l'identification de 266 métabolites et 706 espèces lipidiques sériques répartis sur 20 et 24 classes chimiques respectivement dont 27% d'espèces isomères. Ces outils ont été appliqués, dans un second temps, à la stratification de 78 patients diabétiques. Outre le syndrome métabolique marqué (perturbation du métabolisme énergétique), nos analyses ont montré l'impact délétère de facteurs physiologiques confondants -âge et IMC-. Nous en avons évalué l'influence sur une cohorte de 227 salariés du CEA. Les empreintes lipidomiques sont robustes, néanmoins l'impact de l'IMC est marqué pour les lipides neutres. L'effet du genre démontre un catabolisme masculin important. L'effet de l'âge se manifeste par des activités enzymatiques altérées. Ces études combinent une analyse globale métabolomique et lipidomique des mêmes échantillons humains. Elles visent à construire une base de données relationnelle incluant données spectrales et biologiques servant à la caractérisation de biomarqueurs dans le cas d'études cliniques. / Global metabolomic profiling of biological media in large sample sets is a major challenge. In this context, our work aims to develop LC-HRMS approaches and data mining tools for metabolomics and lipidomics analysis of large cohorts. We have first developed and evaluated the reliability of four LC-HRMS methods in the annotation of human serum metabolome and lipidome. Thus, spectral database was implemented using MS spectra, MS/MS and retention times of reference compounds to further ensure datasets annotation. The combination of RP, PFPP and HILIC-HRMS methods allowed identification of 266 metabolites and 706 lipid species in human serum over 20 to 24 chemical classes respectively including 27% of isomeric species. These analytical tools were then applied for the stratification of 78 diabetic patients. Unsurprisingly, we highlighted a metabolic syndrome (energy metabolism disruption), moreover our analyses have shown the deleterious impact of confounding physiological factors on diabetes biomarker discovery –age and BMI-. We finally evaluated their influence on a cohort of 227 CEA employees. Lipidomic fingerprints are robust, however BMI impact is marked for neutral lipids. Gender effect shows significant male catabolism and age altered enzyme activities. These studies combine an overall metabolomics and lipidomics analyses of the same human samples. They aim to build up a relational database including spectral and biological data for biomarker characterization in clinical studies.

Grâce aux récents progrès en terme d'instrumentation analytique, la protéomique, en tant que science qui étudie le protéome d'un organisme ou d'un milieu, a connu un véritable tournant et a permis d'étendre le champ des connaissances sur le fonctionnement du vivant dans son ensemble (structure, fonction, métabolisme, dynamisme). Néanmoins, l'étude des protéomes représente un challenge pour de nombreux biologistes, chimistes et biochimistes, en raison notamment de la complexité des échantillons étudiés. De nombreux protocoles analytiques ont d'ores et déjà été développés. Cependant, dans leur ensemble, ces stratégies sont relativement longues et multi-étapes et le plus souvent ciblées sur une protéine donnée.Dans ce contexte, ce travail de thèse a pour objectif de simplifier les protocoles expérimentaux existants afin de limiter les pertes en protéines et ainsi amplifier leurs signaux au cours d'une analyse « Bottom-up » par LC-HRMS (analyse « hors gel »). Chaque étape du processus a été décortiquée et optimisée. Dans un premier temps, les paramètres UPLC-HRMS/MS ont été optimisés afin d'améliorer la détection et la quantification des protéines présentes à des concentrations très variables dans les milieux étudiés. Ensuite, une approche de purification simplifiée qui repose sur une seule et unique étape de lavage et solubilisation des protéines a été mise au point. La démonstration de son efficacité « chimique » et « biologique » a ensuite été réalisée via une étude mécanistique au cours de laquelle les changements de conformation des protéines ont été étudiés à chacune des étapes de purification proposées. Enfin, certains paramètres influençant l'extraction des protéines à partir de ces mêmes matrices ont été étudiés afin de proposer à terme un protocole d'extraction à la carte compatible avec une analyse directe par LC-HRMS/MS. / Recent advances in proteomics have been spurred by the rapid development of hybrid and/or high-resolution mass analysers (HRMS/MS). These powerful instrumentations have led to significant improvements in « Bottom-up » approach and have enabled to deepen our knowledge on the functionality of biological systems (structure, function, metabolism, dynamic, etc).Despite their high sensibilities, the potential of such instruments could be significantly lessened by an imperfect sample pre-treatment. In this context, current sample pretreatments follow multi-steps experimental workflows, which alternatively lead to low recoveries of proteins. In this line, this study aims at developing a simple and versatile strategy in order to reduce protein losses and enhance their detection in gel-free LC-MS analysis. First, an analytical method based on liquid chromatography and tandem mass spectrometry was developed to detect and quantify complex peptides mixture. Secondly, a universal, simple and fast purification approach was designed with the aim to purify protein extracts in only one-step. For this purpose, the molecular reactivity, dynamics and conformational changes of proteins at each development step were comprehensively investigated with a set of spectroscopic techniques, in order to select the best strategy. Finally, different factors influencing extraction of proteins were investigated with the goal in the long term to propose an on-demand extraction protocol for direct analysis of proteins by LC-HRMS/MS.