La prostate est une glande du système reproducteur masculin ayant comme fonction la sécrétion de différents ions et molécules dans le liquide spermatique pour favoriser la fertilité masculine. Pour soutenir ces fonctions, les cellules épithéliales de prostate possèdent un métabolisme adapté. En effet, le zinc présent en grandes quantités dans les cellules épithéliales de prostate inhibe l'aconitase mitochondriale (ACO2) qui ne peut plus transformer le citrate en isocitrate, tronquant le cycle de Krebs de ces cellules. Le citrate ainsi produit et non utilisé par la cellule pour la production d'énergie est sécrété dans le liquide spermatique. En contexte tumoral, cette sécrétion de citrate par la prostate cesse par des mécanismes moléculaires encore largement inconnus. Afin de comprendre la reprogrammation du phénotype sécrétoire de la prostate dans ce contexte, il est nécessaire de comparer l'organe tumoral à l'organe sain, mais plusieurs incompréhensions demeurent quant au métabolisme de la prostate normale, à savoir comment ces cellules produisent de l'énergie avec un cycle de Krebs sévèrement tronqué, et quels nutriments sont utilisés par ces cellules pour soutenir une importante sécrétion de citrate. Par contre, aucun modèle actuellement disponible de prostate ne sécrète du citrate, complexifiant l'étude de ce phénotype sécrétoire. Le présent mémoire établit un protocole pour l'obtention d'organoïdes de prostate de souris, un nouveau modèle d'étude ex vivo reproduisant le phénotype sécrétoire de l'organe pour des études métabolomiques, en plus d'interroger les voies métaboliques qui alimentent leur synthèse de citrate. Nos résultats démontrent que plusieurs nutriments, par diverses voies métaboliques, permettent la synthèse de citrate dans les organoïdes obtenus, complexifiant les connaissances liées au métabolisme de la prostate saine. Une meilleure compréhension du métabolisme des organoïdes de prostate saine et tumorale pourrait offrir de nouvelles cibles de traitement au cancer de la prostate et à l'infertilité masculine. / The prostate is a gland of the male reproductive system whose function is to secrete various ions and molecules in the spermatic fluid to promote male fertility. To support these functions, the prostate epithelial cells have a unique metabolism. Indeed, zinc present in large quantities in prostate epithelial cells inhibits mitochondrial aconitase (ACO2) which can no longer transform citrate into isocitrate, thus truncating the tricarboxylic acid cycle (TCA) of these cells. The citrate produced and not used by the cells for energy production is secreted into the spermatic fluid. In the context of prostate cancer, this secretion of citrate by the prostate ceases by molecular mechanisms that remain largely unknown. In order to understand the reprogramming of the prostate secretory phenotype in this context, it is necessary to compare the tumor to the healthy organ, but several misunderstandings remain about the metabolism of the normal prostate, namely how these cells produce energy with a severely truncated TCA cycle, and which nutrients are used by these cells to support a substantial citrate secretion. A problem persists, no currently available model of the prostate reproduces this citrate secretion, complicating the study of this secretory phenotype. This master thesis establishes a protocol to obtain mouse prostate organoids, a novel ex vivo study model that reproduces the organ's secretory phenotype for metabolomic studies, in addition to examining the metabolic pathways that fuel the citrate synthesis of prostate epithelial cells. Our results demonstrate that several nutrients, through various metabolic pathways, enable citrate synthesis in our organoids, offering new insights about the metabolism of the healthy prostate. A better understanding of the metabolism of healthy and tumorous prostate organoids could offer new therapeutic targets for the treatment of prostate cancer and male infertility.

La thrombine, une protéase à sérine connue pour être l'acteur clé de la cascade de coagulation, a été décrite pour réguler les processus apoptotiques au niveau du côlon via l'activation de récepteurs activés par des protéases ou PARs (Protease-Activated Receptors). Cependant, les effets de la thrombine sur la cellule épithéliale colique n'ont été étudiés qu'en utilisant des lignées cellulaires. Les conséquences d'une exposition à différentes doses de thrombine sur un épithélium complexe, composés de différents types cellulaires plus ou moins différenciés sont inconnues à ce jour. Un nouveau modèle cellulaire, nommé organoïde, permet de reconstituer un épithélium colique fonctionnel en 3-dimensions (3D) à partir de résections ou de biopsies humaines, et ce, grâce aux capacités d'auto-renouvellement et de différenciation des cellules souches issues des cryptes coliques. Le 1er objectif de ma thèse a été d'évaluer les effets de la thrombine sur la survie, la prolifération, l'apoptose et la différenciation de l'épithélium colique humain, en utilisant le modèle organoïde. Puis, de déterminer l'implication des récepteurs PAR1 et PAR4 activés par la thrombine dans ces effets. Ainsi, l'ajout de thrombine (à faible dose : 10mU/mL et à forte dose : 50mU/mL) sur une culture d'organoïdes établis à partir de tissus colorectaux normaux entraîne une diminution de moitié de l'activité métabolique et de la prolifération cellulaire. Ces effets sont bloqués en présence d'un antagoniste de PAR1. Le processus apoptotique est, cependant, augmenté d'un facteur 8 en réponse à la thrombine (aux deux doses). Ce processus est inhibé en présence d'antagoniste de PAR1 ou de PAR4. Concernant la différenciation épithéliale, la thrombine diminue le nombre de colonosphères (structures immatures), au profit d'une augmentation du nombre de structures apoptotiques et de colonoïdes (structures plus matures présentant des néo-cryptes). Cet effet est dû à l'activation à la fois de de PAR1 et de PAR4 dans les cellules épithéliales coliques. Mes résultats démontrent que la thrombine exogène agit sur les processus d'apoptose, de prolifération et de différenciation sur un épithélium complexe, issu de la culture de tissus humains. L'utilisation de ce modèle ex vivo permet de comparer les organoïdes pathologiques et normaux, voire de tester les effets d'approches pharmacologiques et de nouveaux médicaments sur ces cultures. Ainsi, la 2nde partie de ce travail de thèse a été d'aborder la mise en place des conditions de culture et d'imagerie nécessaires pour réaliser un screening à haut débit robuste et reproductible, HCS (High-Content Screening), appliquée aux organoïdes. Les conditions de culture d'organoïdes en plaques 96-puits ont été mises au point de même que les conditions permettant d'acquérir des images répondant aux critères nécessaires pour une analyse via un système HCS. Le système Operetta HCS couplé au logiciel d'analyse Harmony (PerkinElmer) a été utilisé pour mettre en place une procédure d'analyse permettant de reconnaître les organoïdes, de les dénombrer, de les classer selon leur état de différenciation et de suivre leur croissance tout au long de la culture. Pour conclure, ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence les effets de la thrombine sur l'état métabolique, l'apoptose et la différenciation de l'épithélium colique humain, grâce au modèle 3D ex vivo d'organoïdes colorectaux. L'utilisation de ce modèle complète les approches jusque-là effectuées dans des modèles de lignées de cellules épithéliales, proposant une vision intégrée du comportement d'un épithélium complexe humain. L'approche HCS initiée lors de ces travaux de thèse pourrait permettre d'analyser de façon robuste et automatisée dans ce modèle, les effets d'autres composés et avoir ainsi un impact majeur sur notre compréhension des pathologies épithéliales et sur les tests de nouvelles approches thérapeutiques. / Thrombin, a serine protease known for its role in the coagulation cascade, was described for its effects on the induction of apoptosis in colonic epithelial cell lines, through the activation of Protease Activated Receptors (PARs). However, the effects of thrombin on complex epithelial structures such as the human intestinal epithelium composed of different cell types and cells at different stages of differentiation, has never been investigated. A new cellular model, named organoid, enables to reconstitute a functional epithelium in 3-dimensions (3D), from human resections or biopsies, thanks to the self-renewal and differentiation properties of stem cells isolated from colonic crypts. The first objective of this thesis was to evaluate thrombin's effects on survival, proliferation, apoptosis and differentiation in human colonic epithelium, using the organoid model. Then, we aimed to determining the implication of PAR1 and PAR4 in the thrombin's effects. Thus, thrombin added (at low dose: 10mU/mL and higher dose: 50mU/mL) to organoid cultures from control patients, led to a decrease by half of metabolic activity and cell proliferation. These effects were blocked by the addition of a PAR1 antagonist. Apoptotic process was 8-fold higher in organoid cultures exposed to thrombin (both doses) and this effect was inhibited by the addition of a PAR1 or a PAR4 antagonist. As per epithelial differentiation, thrombin decreased the number of colonospheres (immature structures) favoring the increase of apoptotic structures and colonoids (budding structures considered as more mature). This effect was due to PAR1 and PAR4 activation as again, it was blocked both by PAR1 and PAR4 antagonist. Taken together, these results reveal that exogenous thrombin acts on apoptosis, proliferation and differentiation processes in complex human colonic epithelium. The use of this ex vivo model will allow to compare pathological versus normal organoid cultures, but also to test the effects of pharmacological approaches and new treatment options directly in cultured human tissues. Thus, the 2nd part of this thesis was to setup the best culture conditions and the best imaging conditions to perform a robust and reproducible screening approach, HCS (High-Content Screening), using organoid cultures. Culture conditions in 96-well plates were set up and allowed to acquire images with the HCS system. Operetta HCS coupled to an analysis software (Harmony, PerkinElmer) was used to develop a specific program enabling the recognition of organoids, their counting, their classification according to their differentiation status and enabling to follow organoid growth in cultures. To sum up, the work performed allowed to highlight the effects of thrombin on metabolic status, apoptosis and differentiation of human colon epithelium, using an ex vivo 3D organoid model. The use this model nicely completed epithelial cell line approaches, offering an integrated view of the complex behavior of human epithelium. The HCS approach initiated within this thesis should allow the automated analysis of a number of drugs and treatments. It should help our understanding of epithelial pathologies and the testing of new therapeutic approaches.

Les principales maladies neurodégénératives humaines, qui reposent toutes sur des mécanismes de type prion (auto-propagation d’agrégats protéiques pathogéniques), représentent un risque sociétal majeur avec une augmentation de leur prévalence directement corrélée avec l’augmentation de la longévité de la population mondiale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif ni aucun modèle expérimental suffisamment pertinent pour ces maladies.L'objectif de ce travail a été d'utiliser le potentiel des mini-cerveaux humains comme modèle in vitro auto-assemblé en trois dimensions (3D) capable de restituer la complexité du cortex cérébral et d’étudier les mécanismes de type prion en développant une méthodologie de validation basée sur la microscopie 3D. Ces nouvelles structures 3D qui peuvent être obtenues à partir de cellules adultes reprogrammées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC), offrent des possibilités uniques pour accéder, observer et perturber les processus biologiques dans le cerveau humain sans les biais ni les complications des modèles animaux ou des échantillons de cerveau humain ex vivo. Ce modèle permet notamment d’observer l’apparition d’agrégats d’Aß et de Tau phosphorylée, deux protéines qui s’accumulent et se propagent de cellule en cellule dans la maladie d’Alzheimer.Nous avons été en mesure de rendre le modèle des mini-cerveaux compatible avec une future approche de criblage de molécules thérapeutiques en modifiant la méthodologie de différenciation pour augmenter leur rendement de production. D’autre part, nous avons pu tester différentes modalités de modélisation pour la Maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la Démence Fronto-Temporale et la maladie de Creutzfeldt-Jakob : à l’aide de molécules d’induction chimique, à l’aide de cellules issues de patients, par modification génétique et par mise en contact de matériel infectieux. Ces différentes approches nous ont permis d’établir que le modèle d’organoïde cérébral permet de reproduire des aspects-clés retrouvés dans l’apparition de la pathologie chez les patients. Pour compenser l’hétérogénéité de notre modèle, nous avons réalisé une analyse in toto par imagerie, c’est-à-dire dans sa totalité sans coupes préalables. La modalité retenue pour cette acquisition est la microscopie à feuillet de lumière utilisée après marquage et clarification des mini-cerveaux. Pour ce faire, nous avons évalué et développé différentes stratégies en vue d’obtenir une plateforme d’analyse à haut contenu pour nos organoïdes cérébraux.Cette plateforme centrée autour de l’organoïde cérébral, sous-tendue par l’analyse en microscopie 3D, a été développée dans le cadre du projet « Investissements d’Avenir » 3DNeuroSecure. Ce projet a pour ambition d’apporter des solutions de calcul haute performance au domaine de la biologie, notamment avec la possibilité de traiter des informations de très grand volume, dit « exascale », telles que celles que nous obtenons avec la microscopie 3D. Le développement de cet aspect nous permettrait à terme de pouvoir établir les bases d’un outil de criblage thérapeutique par les organoïdes cérébraux pour les maladies neurodégénératives. Nous avons démontré que les mécanismes de type prion pouvaient être étudiés dans ce modèle de mini-cerveaux humains et de multiples voies de recherche fondamentale et appliquée sont désormais possibles. A plus long terme, une telle plateforme pourrait accueillir tout type d’organoïdes pour modéliser l’ensemble du corps humain et s’inscrire comme un compagnon biologique dans le cadre des futurs développements de la médecine personnalisée. / Human neurodegenerative diseases, which are all based on prion-like mechanisms (self-propagation of pathogenic protein aggregates), represent a major societal risk with the increase of their prevalence directly correlated to the increasing longevity of the world population. There is to date neither any cure nor any pertinent experimental model for their study.The objective of this work was to use the potential of human mini-brains, a self-assembled three-dimensional in vitro model able to restitute the complexity of the cerebral cortex. This model will allow us to study prion-like mechanism by developing a validation methodology based on 3D microscopy. These novel 3D structures can be obtained from reprogrammed adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and offer unique possibilities to access, observe and disrupt biological processes in the human brain without bias nor complications as in animal models and ex vivo human brain samples. This model makes it possible to observe the development of aggregates of Aβ and hyper-phosphorylated Tau, two proteins that accumulate and propagate from cell to cell during Alzheimer’s disease.We have been to able to adapt the cerebral organoid model for a future screening approach by modifying the differentiation methodology to enhance its production ratio. We also have been able to test different modalities for disease modeling for Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Fronto-Temporal Dementia and Creutzfeldt-Jakob disease: with chemical induction, with patient specific cells, through genetic modification and through contact with infectious material. These different approaches allowed us to validate that the cerebral organoid can indeed reproduce key aspects found during pathological development within patients. To compensate for the heterogeneity of the cerebral organoid, we performed an in toto analysis through microscopy, meaning in its totality without prior slicing. The chosen method of acquisition is fluorescence light-sheet microscopy used after staining and optical clearing of cerebral organoids. To do so, we have evaluated and established different strategies in order to obtain a high content screening platform for our cerebral organoid model.This platform centered around the cerebral organoid model, underpinned by 3D microscopy analysis, was developed during the “Investissements d’Avenir” project 3DNeuroSecure. This project has for ambition to bring high performance computing to the biological sciences, notably with the possibility to deal with large scale data, also called “exascale”, like the ones obtained with 3D microscopy. The development of this aspect would allow us to establish the basis for a therapeutic screening tool based on cerebral organoids for neurodegenerative diseases. We have demonstrated that prion-like mechanisms can be studied in a human mini-brain model and multiple research avenues are now opened for both fundamental and applied research. This platform could in turn become the basis for any kind of organoids derived from patients to model the whole human body and become a biological companion for personalized medicine.

L'intestin est reconnu comme un organe métabolique clé impliqué dans le développement des complications de l'obésité et du diabète. En présence d'obésité, l'intestin grêle développe un état local de résistance à l'insuline, un métabolisme lipidique altéré et une inflammation ainsi qu'une perméabilité paracellulaire accrue. En raison de l'environnement complexe des cellules épithéliales intestinales, il n'est pas clair à ce jour si la dyshoméostasie intestinale peut être induite par des altérations endogènes liées à l'obésité de l'hôte. L'objectif de cette étude était d'évaluer l'impact individuel de l'hyperglycémie, la dyslipidémie et l'inflammation sur les fonctions épithéliales intestinales en utilisant des organoïdes de crypte intestinale. Les organoïdes, dérivés du duodénum de souris mâle C57BL/6, ont été incubés 24 h dans des conditions inflammatoires, dyslipidémiques avec un taux élevé d'acide gras libres et hyperglycémiques. L'expression génique ainsi que la sensibilité à l'insuline ont été mesuré par qPCR et analyse densitométrique, respectivement. Nous montrons que les organoïdes, et donc les cellules de l'épithélium intestinal, répondent bien à l'insuline car cette hormone induit une activation dose-réponse de la phosphorylation d'Akt, un effecteur clé de cette voie de signalisation. La signalisation de l'insuline a été réduite par le cocktail inflammatoire et par la dyslipidémie, alors que l'hyperglycémie réduit la sensibilité à l'insuline à des niveaux élevés de glucose. L'état inflammatoire affecte l'expression des gènes liés à la perméabilité paracellulaire intestinale, à la réponse immunitaire et inflammatoire, au métabolisme des lipides et des lipoprotéines et au transport des nutriments, alors que la dyslipidémie a eu peu d'effet sur ces gènes. Cette étude suggère que les changements endogènes de l'hôte liés à l'obésité représentent un mécanisme important dans le développement des altérations de l'intestin grêle lors du développement de l'obésité. Ces altérations auraient à leur tour un impact sur les complications systémiques, notamment en augmentant le taux de lipoprotéines et de glucose libéré en circulation.

Les cellules entéroendocrines sécrétrices d’hormones représentent 1% de l’épithélium intestinal mais sont des régulateurs essentiels du métabolisme énergétique et l’altération de leur différenciation provoque de graves pathologies métaboliques. Leur différenciation est régie par une cascade de régulations transcriptionnelles qui est encore peu décrite, particulièrement chez l’homme. L’objectif de ce projet de thèse était d’évaluer l’implication de plusieurs facteurs de transcription préalablement identifiés chez la souris (NGN3, RFX6, ARX, PAX4) dans la différenciation entéroendocrine humaine. Pour ce faire, ces gènes ont été inactivés par la technique CRISPR/Cas9 dans des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs), qui ont ensuite été différenciées in vitro en organoïdes intestinaux (HIOs). Les analyses des HIOs déficients pour NGN3 ne permettent pas de conclure quant à un rôle dans la différenciation entéroendocrine mais indiquent une altération de la régionalisation du tissu formé chez les mutants. RFX6 semble important pour la différenciation et/ou la fonction des cellules entéroendocrines, bien que sa fonction précise n’ait pas pu être déterminée. / Hormone-producing enteroendocrine cells represent 1% of the intestinal epithelium but are key regulators of the energetic metabolism and alteration of their differentiation is associated with severe metabolic disorders. Enteroendocrine differentiation is governed by a transcriptional regulatory cascade that is poorly described, especially in humans. This thesis project aimed to evaluate the implication of several transcription factors, previously identified in mice (NGN3, RFX6, ARX, PAX4), in human enteroendocrine differentiation. To do so, these genes were disrupted with the CRISPR/Cas9 system in human inducible pluripotent stem cells (hiPSCs), which were then differentiated in intestinal organoids (HIOs). Preliminary analysis of NGN3-deficient HIOs did not allow a firm conclusion regarding NGN3 implication in enteroendocrine differentiation but showed a tissue regionalization alteration. RFX6 seems important for the differentiation/function of enteroendocrine cells, although its precise function is still to be determined.

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), incluant la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, sont des maladies chroniques qui résultent d’un dérèglement de la réponse immunitaire aux microorganismes de la lumière intestinale. Des études de séquençages réalisées par le laboratoire du Dr. Rioux, avec ses collègues du International IBD Genetics Consortium ont identifié quatre variants rares, indépendants et causals pour les MII, dans le gène IFIH1. La protéine d’IFIH1 (MDA5) interagit avec certains virus à ARN, afin de déclencher une réponse antivirale de l’immunité innée. Nous avions émis l’hypothèse que ces variants dans IFIH1 diminuaient la réponse antivirale de l’épithélium intestinal, suite à une infection. Nous avons d’abord travaillé avec des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs) obtenues à partir d’individus atteints de MII et qui sont homozygotes ou hétérozygotes composés pour ces variants, ainsi qu’à partir d’individus contrôles (IFIH1 wt). Ces LCLs ont été reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites humaines, avant d’être différenciées en cultures épithéliales intestinales. Nos résultats ont d’abord confirmé l’impact des variants sur la structure génique et protéique (IFIH1/MDA5), dans ces modèles cellulaires. Puis, la réponse antivirale a été induite, grâce à la stimulation avec des agents (moléculaire et viral) connus pour stimulés la protéine MDA5. Nous avons démontré que ces variants dans IFIH1 induisaient effectivement une moins grande réponse antivirale, caractérisée par une plus faible expression d’IFNs, comparativement aux contrôles. Finalement, la modulation des IFNs constituerait une avenue potentiellement intéressante pour le traitement des patients atteints des MII et porteurs des variants causals. / Inflammatory Bowel Disease (IBD), including Cronh’s disease and ulcerative colitis, are chronic inflammatory diseases of the gastro-intestinal tract. IBD is associated with a disturbance of the immune response to the microorganisms of the intestinal lumen. Sequencing studies conducted by the laboratory of Dr. John Rioux, in collaboration with his colleagues of the International IBD Genetics Consortium, identified four rare and independent variants in IFIH1, associated to IBD. The protein of IFIH1 (MDA5) interacts with certain RNA viruses to trigger the innate mechanism of antiviral defense. Our hypothesis was that these IFIH1 variants decreased the intestinal epithelial antiviral response, following an infection. We first worked with lymphoblastoid cell lines (LCLs) obtained from IBD patients who are homozygotes or compound heterozygotes for the different variants, as well as from control individuals (IFIH1 wt). These LCLs were reprogrammed into human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs), before being differentiated into intestinal epithelial cultures. Our results first confirmed the impact the variants on the genetic and protein structure for these models. Then, the antiviral response was triggered by the stimulation of LCLs and intestinal epithelial cells, with agents (molecular and viral) known to stimulate MDA5. We have demonstrated that these IFIH1 variants did indeed induce a lower antiviral response, characterized by lower IFNs expression, compared to control cell lines. Finally, modulation of IFNs could be an interesting avenue for the treatment of IBD patients with the causal variants.

Les mutations somatiques sur le variant d’histone H3.3 et les régulateurs épigénétiques associés à H3.3 ont été identifiés dans 30 % des glioblastomes pédiatriques. Ces mutations sont caractérisées par des substitutions d'acides aminés à des positions spécifiques dans la région N-terminale de l'histone H3.3 telles que la glycine 34 en valine/arginine (G34V/R), l'alanine 29 en proline (A29P), ou une haplo-insuffisance de la protéine Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 est un co-répresseur de la transcription qui se lie spécifiquement à H3.3K36me3 pour moduler l'activité de l'ARN polymérase II. De plus, il est intéressant de mentionner que l’interaction entre ZMYND11 et H3.3K36me3 est altérée lorsque le résidu G34 est muté en G34V. Récemment, les mutations germinales H3.3G34V, H3.3A29P et ZMYND11 ont été identifiées chez des patients présentant une déficience neurologique. Nous émettons l'hypothèse que les mutants H3.3G34V et H3.3A29P empêchent ZMYND11 de se lier à H3.3K36me3 et pourrait converger mécaniquement avec la perte de fonction de ZMYND11, ce qui perturberait la neurogenèse. À l'aide de la technologie CRISPR Cas9, nous avons généré des modèles mutants isogéniques à partir de cellules souches pluripotentes (iPSC) pour H3F3B-A29P, H3F3B-G34V et ZMYND11-knock-out (KO). Par la suite, nous avons stimulé la différenciation de ces modèles vers des lignées neuronales afin d’identifier si ces mutations affectent la neurogenèse. Enfin, en utilisant des méthodes de séquençage à haut-débit nous avons analysé le profil épigénomique et transcriptomique pour déterminer comment l’interaction entre ZMYND11 et H3K36me3 est perturbée et à quels degrés ces mutations impactent sur les modifications post-traductionnelles des histones. Ce projet permettra de mieux comprendre les fonctions de ZMYND11 sur le remodelage de la chromatine et sa fonction biologique au cours du développement cérébral. / Somatic mutations on the histone 3 variant H3.3 and H3.3-associated chromatin modifiers have been identified in 30% of pediatric high-grade gliomas (pHGG). The mutations are characterized by amino acid substitutions at specific positions within the histone H3.3 tail such as glycine 34 to valine/arginine (G34V/R), alanine 29 to proline (A29P), or haploinsufficiency of the chromatin reader Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 is a transcriptional co-repressor that specifically reads H3.3K36me3 to modulate RNA polymerase II activity. Notably, binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 is altered when G34 residue is mutated to G34V. Recently, germline mutations of H3.3G34V, H3.3A29P, and ZMYND11 have been identified in patients with Intellectual disability. We hypothesize that H3.3 G34V and H3.3A29P mutants impede the binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 and may mechanistically converge with ZMYND11 loss-of-function mutation to perturb neurogenesis. Using CRISPR Cas9-mediated gene editing, we will generate isogenic human induced pluripotent stem cell (iPSC) models for H3F3B-A29P, H3F3B-G34V and ZMYND11-KO, and perform in vitro neural differentiation to identify whether specific neural lineages are affected. Next, using epigenomic and transcriptomic profiling we will study whether binding between ZMYND11 and H3K36me3 is disrupted, and the downstream impact on Post-Translational Modifications of histones (PTMs) and transcription. This project will lead to a better understanding of the crucial role of the chromatin reader ZMYND11 on chromatin remodeling and the biological function during neural development.

L'œsophage et la trachée proviennent du diverticule endodermique du tube de l'intestin antérieur au cours de l'embryogenèse. Des événements cellulaires et moléculaires bien régulés et organisés entraînent la séparation du tube de l'intestin antérieur en œsophage et trachée. Cette séparation est encore mal connue et la perturbation de ce processus se traduit par une anomalie congénitale sévère telle qu'une l’atrésie de l'œsophage avec ou sans fistule trachéo-œsophagienne (AO/FTO). L'AO/FTO est l'une des malformations congénitales gastro-intestinales les plus courantes affectant 1 naissance sur 3000. Cette malformation nécessite une intervention chirurgicale urgente à la naissance et est fréquemment associée à une morbidité à long terme. Les mécanismes sous-jacents au développement embryonnaire de l'AO/FTO sont mal compris. Les modèles animaux ont été largement utilisés pour comprendre les maladies humaines depuis des décennies et ont considérablement contribué à la compréhension du développement de l'œsophage. Cependant, des différences structurelles et morphologiques clés existent entre l'œsophage humain et animal, ce qui nécessite un modèle plus fiable pour comprendre le développement trachée-œsophagien. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme ont été un outil précieux pour comprendre l'organogenèse en imitant le développement et en déchiffrant les mécanismes qui conduisent à des maladies congénitales et acquises. Cette thèse se concentre donc sur l'utilisation de cellules souches pluripotentes induites (IPS) par des patients pour déchiffrer les mécanismes de signalisation impliqués dans le développement de l'œsophage et les maladies congénitales telles que l’OA/FTO. Il étudie également l'une des maladies œsophagiennes acquises possibles, comme l'œsophage de Barrett. Nous avons orienté la différenciation des IPS saines et dérivées de patients vers différents stades de développement, tels que l'endoderme définitif, l'intestin antérieur, l'épithélium œsophagien et trachéal. De plus, l'épithélium œsophagien a été développé davantage dans un environnement tridimensionnel sans matrice pour générer des organoïdes œsophagiens matures. À chaque étape de la progression du développement, des analyses d'immunofluorescence, de qPCR et de séquençage d'ARN ont été effectuées. Nos résultats suggèrent que l'expression des marqueurs endodermiques CXCR4, SOX17, et GATA4 était similaire dans les cellules différenciées des patients et des cellules saines. Cependant, au stade de l'intestin antérieur, nous avons observé une diminution significative de l'expression des gènes et des protéines du facteur transcriptionnel clé SOX2 dans les cellules dérivées du patient. De plus, en utilisant le séquençage d'ARN à molécule unique, nous avons observé que les gènes critiques GSTM1, et RAB37 impliqués dans la morphogenèse cellulaire et associés à l’OA/FTO étaient dérégulés au stade de l'intestin antérieur dans les cellules dérivées du patient. Nous avons également observé une augmentation significative de l'expression du facteur de transcription NKX2.1 habituellement exprimé uniquement dans les cellules trachéales, dans l'épithélium oesophagien dérivé du patient. NKX2.1 est maintenue dans les organoïdes oesophagiens matures même après 2 mois. Ensuite, nous voulions valider l'utilisation potentielle de nos organoïdes dérivés des IPS pour modéliser les maladies acquises de l'œsophage telles que l'œsophage de Barrett. Nous avons induit une métaplasie ou transformation épithéliale avec surexpression de BMP4 dans des organoïdes de l'œsophage sains et dérivés du patient sur une période d'un mois. Nos résultats préliminaires montrent que les organoïdes de l'œsophage dérivés des patients exprimaient des niveaux d'ARNm plus élevés de MUC5AC, un marqueur épithélial cylindrique par rapport au groupe sain. Cela suggère une plus grande sensibilité de l'organoïde de l'œsophage dérivé du patient aux changements epitheliales métaplasiques. En conclusion, nous avons développé les premiers organoïdes œsophagiens tridimensionnels matures sans matrice différenciés des patients OA/FTO et identifié une signature moléculaire unique dans les cellules dérivées du patient au cours de la différenciation dirigée de l'œsophage. De plus, sur la base des résultats préliminaires, nous avons pu confirmer l'incidence plus élevée de l'œsophage de Barrett chez les patients OA/FTO par rapport au groupe sain. Notre travail met donc en évidence l'importance de l'utilisation des IPS dérivées des patients pour modéliser les maladies œsophagiennes congénitales et acquises afin de fournir de nouvelles informations sur le développement des organes au cours de l'embryogenèse. / The esophagus and trachea originate from the endodermal diverticulum of the anterior foregut tube during embryogenesis. Well-regulated and organized cellular and molecular events result in the compartmentalization of the anterior foregut tube into the esophagus and trachea. This compartmentalization is still poorly understood and disruption in this process results in a severe congenital anomaly such as esophageal atresia with or without tracheoesophageal fistula (EA/TEF). EA/TEF is one of the most common gastrointestinal congenital defects affecting 1 in 3,000 births. This malformation requires urgent surgery at birth and is frequently associated with long-term morbidity. The mechanisms underlying the embryonic development of EA/TEF are poorly understood. Animal models have been widely used to understand human diseases for decades and have significantly contributed to the understanding of esophageal development. However, key structural and morphological differences exist between human and animal esophagus, thus necessitating a more reliable model to understand trachea-esophageal development. Human induced pluripotent stem cells (iPSC) have been a valuable tool to understand organogenesis by mimicking development and deciphering mechanisms that lead to congenital and acquired diseases. This thesis therefore focuses on the use of patient-derived induced pluripotent stem cells to decipher signaling mechanisms involved in esophageal development and congenital diseases such as EA/TEF. It also focuses on one of the possible acquired esophageal diseases, namely, Barrett’s esophagus. We directed the differentiation of healthy and patient-derived iPSCs toward different developmental stages, such as definitive endoderm, anterior foregut, esophageal and tracheal epithelium. Furthermore, the esophageal epithelium was matured further in a matrix free 3-dimensional environment to generate mature esophageal organoids. At each stage of development progression, immunofluorescence, qPCR, and RNA sequencing analysis were performed. Our findings suggest that the expression of endodermal markers CXCR4, SOX17, and GATA4, were similar in both patient and healthy differentiated cells. However, at the anterior foregut stage, we observed a significant decrease in the gene and protein expression of key transcription factor SOX2 in patient-derived cells. Furthermore, using nanopore RNA sequencing, we observed that critical genes GSTM1, and RAB7 involved in cellular morphogenesis and associated with EA/TEF to be dysregulated at the anterior foregut stage in patient-derived cells. We also observed a significant increase in the expression of transcription factor NKX2.1, usually expressed only in tracheal cells, in the patient-derived esophageal epithelium. NKX2.1 expression was maintained in matured esophageal organoids even after 2 months. Next, we wanted to validate the potential use of our PSC-derived organoids to model acquired esophagus diseases such as Barrett’s esophagus (BE). We induced epithelial metaplasia with BMP4 overexpression in healthy and patient-derived esophagus organoids over a 1-month period. Our preliminary results show that patient-derived esophagus organoids expressed higher mRNA levels of MUC5AC, an epithelial columnar marker compared with the healthy group. This suggests a higher susceptibility of patient-derived esophagus organoid to metaplastic changes. In conclusion, we developed the first matrix free mature 3-dimensional esophageal organoids differentiated from EA/TEF patient-derived and identified a unique molecular signature in patient derived cells during directed esophagus differentiation. Furthermore, based on the preliminary results, we could confirm the higher incidence of Barrett’s esophagus in EA/TEF patients compared with the healthy group. Our work therefore highlights the significance of using patient-derived iPSCs to model congenital and acquired esophageal diseases to yield new insights on organ development during embryogenesis. It lays the foundation for a personalized medical approach to other diseases and the ones affecting the whole gastrointestinal system in both children and adults.

Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA. / Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD.